環(huán)孢素A減輕急性胰腺炎模型小鼠心臟損傷的機(jī)制研究①

吳 童 高雪飛 賈迎麗 楊 靜 （唐山市工人醫(yī)院內(nèi)科，唐山 063000）

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是一種不可預(yù)測的威脅生命的炎癥性疾病，常伴有嚴(yán)重的全身炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致多器官功能障礙［1］。每個(gè)患者的預(yù)后取決于AP 的嚴(yán)重程度，最嚴(yán)重型通常伴有多器官損傷，病死率為15%～30%［2］。目前研究表明，促炎癥細(xì)胞因子通過驅(qū)動(dòng)炎癥反應(yīng)在AP 相關(guān)并發(fā)癥中起著關(guān)鍵作用［3］。因此，更好地了解AP 的炎癥調(diào)節(jié)途徑對于發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)是必要的。不同類型免疫細(xì)胞介導(dǎo)的抗炎和促炎免疫反應(yīng)不平衡參與AP 病理生理學(xué)過程［1］。巨噬細(xì)胞在AP 損傷過程中起著至關(guān)重要的作用［4］。根據(jù)組織微環(huán)境中存在的刺激，巨噬細(xì)胞可分為典型激活的M1 型和交替激活的M2 型［4］。M1 表型巨噬細(xì)胞分泌促炎介質(zhì)IL-6、IL-1β、TNF-α和活性氮、氧等促炎因子，具有較強(qiáng)的殺微生物作用。M2 表型巨噬細(xì)胞通過產(chǎn)生抗炎介質(zhì)，如IL-10 和IL-4，參與組織重塑［5］。M2 型巨噬細(xì)胞在化解炎癥中起著積極作用，這是AP 治療所必需的。因此，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化平衡可能是AP治療的一個(gè)有前途的策略。環(huán)孢素A（Cyclosporin A，CSA）是一種有效的免疫抑制藥物，主要抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶依賴的轉(zhuǎn)錄因子［6］。通過這種抑制作用，CSA阻斷T細(xì)胞產(chǎn)生NFAT依賴性細(xì)胞因子，如IL-2，并抑制包括輔助性T（Th）細(xì)胞在內(nèi)的效應(yīng)T 細(xì)胞激活和功能［6］。最近研究表明CSA對系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、脊柱關(guān)節(jié)炎等炎癥性疾病具有有益的影響，同時(shí)能降低心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［7］。因此，CSA 可有效治療炎癥性疾病。然而，它在調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞分化中的作用仍不清楚。鑒于上述發(fā)現(xiàn)，本研究旨在證明CSA 是否通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化影響AP 的炎癥反應(yīng)，從而保護(hù)AP小鼠及相關(guān)心臟損傷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 雄性C57BL/6J 小鼠，上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證：SCXK（滬）2018-0004。體質(zhì)量22～25 g，6～8 周齡，安置在12 h/12 h明暗循環(huán)、無特定病原體環(huán)境中，自由飲用食物和水。

1.1.2 主要試劑與儀器 RAW264.7細(xì)胞（中國典型培養(yǎng)物保藏中心）；CSA（美國Sigma-Aldrich 公司）；緩沖液（美國BD Biosciences 公司）；FcR 阻斷試劑（美國Miltenyi公司）；固定/滲透緩沖液（南京福麥斯生物技術(shù)有限公司）；L-精氨酸（北京Solarbio 公司）；CD206（美國Biolegend 公司）；血清肌酸激酶同工酶（上海臥宏生物科技有限公司）；乳酸脫氫酶（南京建城生物工程研究所）；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒（北京英柏生物科技公司）；TUNEL 檢測試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）；Trizol 試劑（美國Invitrogen 公司）；cDNA 合成試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（日本TaKaRa 公司）；BCA 蛋白檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；PVDF 膜（美國Millipore Corp 公司）；Aperio S2 Leica 生物系統(tǒng)顯微鏡（德國Leica 公司）；p-STAT6、GAPDH（美國Abcam公司）；ABI 7500 PCR 系統(tǒng)（美國Life Technologies公司）。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)RAW264.7 細(xì)胞 將RAW264.7 細(xì)胞置于含10%胎牛血清（FBS）、1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)基中，于37 ℃、含5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù) 將RAW264.7 細(xì)胞接種于6 孔板中，用0、5、10、20 nmol/L CSA 刺激24 h，然后將細(xì)胞密度調(diào)整為2.5×106個(gè)/ml，用200 μl 懸浮液檢測M2標(biāo)志物。用AF647 CD206或PEcy7 CD23抗體標(biāo)記M2 標(biāo)志物。極化分析心臟組織中巨噬細(xì)胞，將組織碎塊置于0.1%Ⅳ型膠原酶溶液中孵育40 min，經(jīng)70 μm 濾網(wǎng)過濾。取上清液300 g 離心5 min，棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液冰上孵育15 min，300 g 離心5 min，棄上清經(jīng)200 目濾器過篩，細(xì)胞計(jì)數(shù)，再懸浮在染色緩沖液中。隨后，加入FcR阻斷試劑以提高抗體的特異性。細(xì)胞首先用表面標(biāo)志物（F4/80）染色，用固定/滲透緩沖液固定和滲透，然后用FITC 偶聯(lián)的CD11c（M1 標(biāo)志）和APC 偶聯(lián)的CD206（M2標(biāo)志）染色，通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.2.3 AP模型建立 為研究CSA在AP中的作用，將雄性C57BL/6J 小鼠隨機(jī)分為3 組（n=15），即對照組、AP 模型組和AP+CSA 組。參照文獻(xiàn)［8］方法，對AP 組和AP+CSA 組小鼠腹腔注射L-精氨酸建立AP模型。L-精氨酸溶解在生理鹽水中，并在注射前將pH 調(diào)節(jié)至7.0。小鼠以4 g/kg 劑量腹腔注射2 次L-精氨酸，每次注射間隔1 h。第1次注射后，所有小鼠可以自由獲得食物和水。第2次注射L-精氨酸指定時(shí)間點(diǎn)為0。對于CSA治療，在首次注射L-精氨酸前30 min，小鼠皮下注射20 mg/kg CSA（溶于橄欖油）。AP 誘導(dǎo)24 h 后，在戊巴比妥鈉全麻下經(jīng)眼眶靜脈叢出血法采集血樣于離心管靜置。處死小鼠，將每只小鼠的胰腺、心臟組織用10%甲醛固定，進(jìn)行病理學(xué)檢查，同時(shí)將血樣在3 000 g 下離心10 min。將血清置于-80 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 小鼠血清胰腺、心肌損傷指標(biāo)測定 用生化分析儀測定AP 誘導(dǎo)24 h 后血清肌酸激酶同工酶、乳酸脫氫酶水平。采用ELISA 試劑盒檢測肌鈣蛋白（cTnT）、TNF-α、血清淀粉酶、脂肪酶水平。

1.2.5 組織病理學(xué)檢查及免疫組化分析 AP誘導(dǎo)24 h 后處死小鼠。立即采集胰腺和心臟組織，用多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE 染色，在Aperio S2 Leica 生物系統(tǒng)顯微鏡下檢查組織病理變化。采用TUNEL檢測試劑盒檢測組織切片中細(xì)胞凋亡。

1.2.6 RNA 提取與定量實(shí)時(shí)PCR 分析 用Trizol試劑從巨噬細(xì)胞裂解物和小鼠心臟中分離總RNA，并使用cDNA 合成試劑盒在37 ℃下反轉(zhuǎn)錄15 min。cDNA 采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ和ABI 7500 PCR 系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算靶基因相對表達(dá)。目標(biāo)基因序列見表1。

表1 目標(biāo)基因序列Tab.1 Target gene sequence

1.2.7 細(xì)胞熱位移分析（CETSA） 根據(jù)文獻(xiàn)［9］進(jìn)行CETSA。采用激酶緩沖液溶解收集的巨噬細(xì)胞，12 000 g 離心20 min，取上清液。巨噬細(xì)胞裂解液分為DMSO 組和20 nmol/L CSA 組。將各組分為7 等份，分別在46、50、54、58、62、66、70 ℃下熱處理3 min，然后將DMSO 組和20 nmol/L CSA 組快速轉(zhuǎn)移到冰上，用低溫離心機(jī)在1 2000 g 離心10 min，取上清液，加入負(fù)載緩沖液，CETSA分析。

1.2.8 免疫印跡分析 收集細(xì)胞，通過裂解緩沖液裂解30 min，BCA 蛋白檢測試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度，10%SDS-PAGE 分離，電泳轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。在室溫下用3%BSA封閉細(xì)胞膜1 h，4 ℃下用相應(yīng)抗體：PKM2（1∶4 000 稀釋）、HIF1α（1∶1 000 稀釋）、p-STAT1（1∶1 000 稀釋）、p-STAT6（1∶2 000 稀釋）和GAPDH（1∶5 000 稀釋）在4 ℃下孵育過夜，次日用HRP 偶聯(lián)的二抗孵育1 h。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)觀察蛋白條帶。通過GAPDH 免疫印跡法驗(yàn)證樣品的等載量。用圖像測量軟件對譜帶強(qiáng)度進(jìn)行量化。

2 結(jié)果

2.1 CSA對RAW264.7細(xì)胞M2極化的影響 為了探討CSA 對M2 極化的影響，用不同劑量的CSA（0、5、10 和20 nmol/L）刺激RAW264.7 細(xì)胞24 h。然后收集細(xì)胞并對M2 表型的CD206 和CD23 標(biāo)志物進(jìn)行染色。流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)顯示，M2標(biāo)志物標(biāo)志的巨噬細(xì)胞數(shù)量以劑量依賴性的方式增加（圖1）。此外，還檢測了M1 標(biāo)志物一氧化氮合酶（iNOS）的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示在CSA 刺激的細(xì)胞中iNOS mRNA表達(dá)減少（圖2）。

圖1 CSA對RAW264.7細(xì)胞M2極化的影響Fig.1 Effects of CSA on M2 polarization in RAW264.7 cells

圖2 RT-qPCR檢測iNOS mRNA水平Fig.2 mRNA levels of iNOS determined by RT-qPCR

2.2 CSA可改善實(shí)驗(yàn)性AP胰腺損傷 評估CSA對L-精氨酸誘導(dǎo)的AP 的影響，結(jié)果表明，AP 組24 h病死率為33.3%（5/15）。對照組、AP+CSA組小鼠均存活24 h。AP 組胰腺組織出現(xiàn)明顯的組織病理學(xué)改變，包括水腫、出血和腺泡細(xì)胞變性，組織病理學(xué)評分明顯高于對照組，CSA預(yù)處理顯著改善胰腺結(jié)構(gòu)，降低胰腺組織病理學(xué)評分（圖3A、B）。此外，還評估了血清淀粉酶、脂肪酶和胰腺TNF-α變化。AP顯著提高了血清淀粉酶和脂肪酶水平以及胰腺TNF-α水平，表明AP小鼠模型胰腺損傷嚴(yán)重。CSA預(yù)處理顯著降低了參數(shù)的水平（P<0.05，圖3C～E）。結(jié)果表明CSA給藥對L-精氨酸誘導(dǎo)的AP有保護(hù)作用。

圖3 CSA改善實(shí)驗(yàn)性AP損傷（×200）Fig.3 CSA ameliorate pancreatic damage in experimental AP （×200）

2.3 CSA 減輕AP 模型小鼠心臟損傷 HE 染色顯示心肌損傷的病理特征，AP 組心肌纖維壞死、炎癥細(xì)胞浸潤、出血和梗死區(qū)結(jié)構(gòu)破壞，CSA預(yù)處理顯著減輕心肌損傷程度（圖4A）。此外，AP 模型組顯著提高了血清CK-MB、LDH 和cTnT 水平，表明AP 小鼠模型心肌損傷嚴(yán)重，CSA 預(yù)處理顯著降低了這些參數(shù)的水平（P<0.05，圖4B～D）。與這些結(jié)果一致，AP 模型組心肌TUNEL 陽性細(xì)胞多于對照組，CSA預(yù)處理顯著減少TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)量（圖4E）。表明CSA對AP模型小鼠的心臟損傷具有保護(hù)作用。

圖4 CSA減輕AP模型小鼠心臟損傷Fig.4 CSA attenuates cardiac injury in AP model mice

2.4 CSA抑制AP模型小鼠的心肌炎癥反應(yīng) 通過檢測心肌組織中炎癥物質(zhì)的表達(dá)水平，探討CSA 對AP模型小鼠的心肌炎癥反應(yīng)的影響。如圖5A、B所示，與對照組相比，AP 模型組中心肌炎癥細(xì)胞因子IL-1β 和iNOS mRNA 表達(dá)顯著增加，CSA 預(yù)處理顯著抑制了IL-1β 和iNOS mRNA 表達(dá)。M1 表型巨噬細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子，如前所述，CSA在體外調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化，進(jìn)一步檢測心肌巨噬細(xì)胞功能。CD11c+F4/80+為M1 表型，CD206+F4/80+為M2 表型。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，CSA預(yù)處理顯著降低AP誘導(dǎo)的心肌巨噬細(xì)胞中CD11c+F4/80+比例，提高CD206+F4/80+比例（圖5C～E）。

圖5 CSA抑制AP小鼠心肌炎癥反應(yīng)Fig.5 CSA inhibits myocardial inflammatory response in AP mice

2.5 PKM2 作為CSA 的潛在靶點(diǎn) 本研究進(jìn)一步考察CSA 是否能抑制LPS 誘導(dǎo)的PKM2 激活并防止巨噬細(xì)胞炎癥。結(jié)果表明，LPS+CSA 處理顯著抑制LPS 誘導(dǎo)PKM2 表達(dá)（圖6A）。此外，PKM2 還可以通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用發(fā)揮生物學(xué)功能。20 nmol/L CSA+LPS 顯著抑制HIF1α 表達(dá)，同時(shí)伴隨著巨噬細(xì)胞中p-STAT1 表達(dá)降低和p-STAT6 表達(dá)增加（圖6A）。為了驗(yàn)證CSA 與PKM2 靶蛋白的結(jié)合，使用CETSA 驗(yàn)證目標(biāo)。當(dāng)靶蛋白與小分子結(jié)合時(shí)，結(jié)構(gòu)向低能高穩(wěn)定性方向變化，耐高溫能力增強(qiáng)。如圖6B 所示，在CSA 處理的細(xì)胞裂解液中，PKM2對高溫有較強(qiáng)的耐受性，在高溫下PKM2 條帶強(qiáng)度較DMSO組增強(qiáng)，說明PKM2是CSA的靶標(biāo)。

圖6 PKM2作為CSA的潛在目標(biāo)Fig.6 PKM2 serves as a potential target for CSA

3 討論

AP 是一種致命的臨床疾病，其特點(diǎn)為進(jìn)展迅速，目前沒有特效的方法可以阻止胰腺壞死的發(fā)生與發(fā)展，通常伴有多器官損傷，一旦發(fā)病其病死率高達(dá)50%～60%［1］。因此，通過改變過度炎癥反應(yīng)是一種有效的治療手段［10］。大量研究發(fā)現(xiàn)，各種炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在AP 模型小鼠誘發(fā)的多器官損傷中起重要作用［2］。在較多的炎癥模型中，有研究發(fā)現(xiàn)，用L-精氨酸制備AP模型，24 h時(shí)到高峰，均與眾多臨床上分析該疾病的結(jié)果近似，因此本實(shí)驗(yàn)采用L-精氨酸制備AP 模型小鼠作為研究對象［11］。CSA在多種炎癥性疾病方面有較好的治療作用。該研究采用CSA 作為預(yù)防給藥處理。為了進(jìn)一步研究，本研究分析了CSA 在AP 模型小鼠合并心臟損傷中的潛在作用，結(jié)果表明，CSA 減輕了胰腺損傷，改善了心功能和組織學(xué)。此外，CSA 抑制胰腺和系統(tǒng)性促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，其作用機(jī)制與降低M1巨噬細(xì)胞比例和提高M(jìn)2 巨噬細(xì)胞比例有關(guān)。因此，CSA可能是治療AP的一種有前途的藥物。

在AP 的多器官系統(tǒng)功能障礙中，心臟損傷是相關(guān)表現(xiàn)的一部分，甚至致?。?2］。AP期間可觀察到心肌病變的改變。CK-MB、LDH和cTnT是心臟損傷高度可靠的生物標(biāo)志物［13］。在本研究中，小鼠腹腔注射L-精氨酸刺激胰腺可引起胰腺明顯的病理改變，血清淀粉酶和脂肪酶水平（胰腺損傷標(biāo)志物）升高。此外，AP 動(dòng)物表現(xiàn)出明顯的心臟損害，心肌細(xì)胞凋亡和心肌相關(guān)酶CK-MB、LDH、cTnT 增加。以上結(jié)果表明，本研究成功建立了伴有心臟損傷的AP模型，與文獻(xiàn)［14］一致。本研究結(jié)果提示CSA 預(yù)處理可明顯改善胰腺和心臟組織病理學(xué)變化，逆轉(zhuǎn)血清淀粉酶、脂酶和心臟相關(guān)酶變化。對AP 誘導(dǎo)的心臟損傷具有有益的作用。

越來越多的證據(jù)表明，參與AP 誘導(dǎo)的多器官功能障礙的致病因素包括全身炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和循環(huán)蛋白水解酶［14］。炎癥細(xì)胞因子在AP 的炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。一方面，AP開始于局限性胰腺和胰周炎癥。過度釋放炎癥介質(zhì)將輕度AP 轉(zhuǎn)化為重度AP，并進(jìn)一步導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征［14］。另一方面，隨著AP、細(xì)菌和內(nèi)毒素從腸道侵入血液系統(tǒng)，腸黏膜的免疫屏障受損，進(jìn)一步誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)釋放［15］。許多促炎癥細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β，被認(rèn)為參與了AP 發(fā)生，循環(huán)中這些介質(zhì)的高水平表達(dá)可導(dǎo)致進(jìn)一步的多器官衰竭［14］。已有研究表明CSA 在體內(nèi)外均有抗炎作用。CSA 治療降低了脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞TNF-α 和IL-6 的產(chǎn)生［16］。XIAO等［17］報(bào)道CSA對LPS介導(dǎo)的炎癥性肺損傷具有治療潛力。與以上結(jié)果一致，本研究證明了CSA 預(yù)處理可顯著降低全身炎癥細(xì)胞因子，包括TNF-α 和IL-1β。因此，CSA 的心臟保護(hù)作用可能歸因于其抗炎特性。QIAN等［18］證明，CSA對急性壞死性胰腺炎大鼠腦損傷的保護(hù)作用。本研究進(jìn)一步證實(shí)了CSA在AP相關(guān)心臟損害中的有益作用。

在AP 情況下，宿主會產(chǎn)生極端的免疫反應(yīng)。免疫功能障礙被認(rèn)為是AP 全身炎癥中的一個(gè)重要因素［14］。巨噬細(xì)胞是一種重要的免疫細(xì)胞類型，通過影響炎癥和免疫功能在AP 多個(gè)階段發(fā)揮關(guān)鍵作用。M1 和M2 巨噬細(xì)胞的可塑性隨AP 的發(fā)展而變化。M2 巨噬細(xì)胞參與炎癥溶解和組織修復(fù)，這對AP 的治療至關(guān)重要［5］。本研究分析了CSA 對膿毒癥巨噬細(xì)胞M1/M2 極化的調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果表明，CSA 在體外以劑量依賴的方式增加CD206 和CD23標(biāo)志的巨噬細(xì)胞數(shù)量。在體內(nèi)，CSA 誘導(dǎo)心臟巨噬細(xì)胞M2 極化，即F4/80+CD206+巨噬細(xì)胞占F4/80+細(xì)胞（總巨噬細(xì)胞）比例升高。以上發(fā)現(xiàn)與先前的研究一致，即表觀遺傳修飾物可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表型［19］。PKM2 是巨噬細(xì)胞糖酵解重編程的關(guān)鍵決定因素［10］。PKM2 的單體和二聚體形式具有不活躍的丙酮酸激酶活性，促進(jìn)巨噬細(xì)胞糖酵解和炎癥反應(yīng)。而PKM2的四聚體形式具有活性的酶丙酮酸激酶活性，可誘導(dǎo)TCA 循環(huán)、OXPHOS 和抗炎反應(yīng)［10］。研究發(fā)現(xiàn)，通過內(nèi)源性分子和合成化合物抑制PKM2 可以減輕巨噬細(xì)胞引起的炎癥性疾?。?0-24］。因此，研究進(jìn)一步觀察PKM2 是否作為CSA 的潛在靶點(diǎn)。結(jié)果顯示CSA 預(yù)處理可能通過下調(diào)PKM2促進(jìn)M2-巨噬細(xì)胞極化。

本研究結(jié)果表明，CSA 可以顯著改善L-精氨酸誘導(dǎo)的AP 和相關(guān)心臟損害的嚴(yán)重程度。以PKM2為靶點(diǎn)的CSA 在AP 中的作用可能與增加M2 巨噬細(xì)胞數(shù)量、抑制促炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生有關(guān)。因此，CSA可為胰腺疾病提供治療潛力。