• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    疏風解毒膠囊經(jīng)miR-155/JAK1-STAT1信號通路發(fā)揮對甲型流感病毒H1N1肺炎模型小鼠的保護作用*

    2022-08-05 03:03:40李振華陳建麗謝林森
    中國病理生理雜志 2022年7期
    關鍵詞:組肺流感病毒通路

    李振華, 張 華△, 陳建麗, 徐 超, 謝林森, 張 藝, 張 倩

    (1鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科,河南 鄭州 450007;2鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院檢驗科,河南 鄭州 450007)

    甲型流感病毒H1N1 肺炎是由單股RNA 病毒引起的急性呼吸道傳播疾病,可通過飛沫、氣溶膠、接觸傳染,傳染性強,感染后患者重癥轉歸不良的風險較高,部分患者惡化后造成呼吸窘迫或衰竭,危及生命[1],及時有效的干預對于患者至關重要。以往研究主要以西藥治療為主,奧司他韋作為其中一種西藥,由于廣泛使用,患者體內往往產(chǎn)生了耐藥性,造成效果不佳[2],而中藥藥效持久且副作用小,為甲型流感病毒H1N1 肺炎提供了新的治療方向。疏風解毒膠囊(Shufeng-Jiedu capsule,SFJDC)中有虎杖、連翹等多種中藥成分,對病原菌具有廣泛抑制作用[3-5],能夠減輕感染導致的局部炎癥,增強組織抵抗力和修復能力[6],但鮮有關于甲型流感病毒H1N1 肺炎的研究。微小RNA(microRNA,miR)-155 參與肺部損傷過程[7],可通過調控 Janus 激酶(Janus kinase,JAK)-信號轉導及轉錄激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)通路介導炎癥反應,影響牙周炎發(fā)生[8]。本研究探討SFJDC對甲型流感病毒H1N1肺炎模型小鼠的影響,并初步探討其作用機制。

    材料和方法

    1 動物及病毒株

    50 只 SPF 級雄性 BALB/c 小鼠,6~7 周齡,體重(20±2)g,購自北京維通利華實驗動物有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2016-0006。在溫度(26±1)℃、濕度(55±5)%、12 h 光照12 h 黑暗環(huán)境中飼養(yǎng)。本實驗經(jīng)本院倫理委員會審核并通過。甲型流感病毒鼠肺適應株(A/FM/1/47-MA)由中國預防醫(yī)學科學院病毒研究所提供。

    2 主要藥品及試劑

    SFJDC 由天津藥物研究所有限公司提供,每粒0.52 g,由虎杖、連翹、板藍根、馬鞭草、敗醬草、柴胡、蘆根和甘草組成,各藥材均符合2015 年版《中國藥典》相關標準。miR-155 siRNA及miR-155和U6引物由上海生工生物有限公司合成;蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);小鼠轉化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)、白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒,抗 JAK1、p-JAK1、STAT1 和 p-STAT1抗體,羊抗兔Ⅱ抗,BCA蛋白試劑盒(Abcam);cDNA 第一條鏈合成試劑盒(上海佰易聚生物有限公司);2× SYBR qPCR Mix(北京莊盟國際生物有限公司);DAB 工作液(杭州浩克生物科技有限公司)。QuantStudio 3 實時熒光定量PCR 儀(ABI);UVP Gel-Solo蛋白凝膠成像儀(Jenapharm)。

    3 主要方法

    3.1 分組及建模 小鼠按隨機數(shù)字法分為對照組、模型組、低劑量SFJDC 組、高劑量SFJDC 組和SFJDC+miR-155 siRNA 組,每組10 只。除對照組外,其余各組參考文獻[9]將小鼠用乙醚輕度麻醉,以15×LD50流感病毒液鼻滴感染小鼠,每只0.035 mL,對照組鼻滴等體積蒸餾水。從感染當天起,低、高劑量SFJDC 組分別灌胃0.1 和0.5 g/(kg·d)SFJDC[10],SFJDC+miR-155 siRNA 組灌胃0.5 g/(kg·d)SFJDC并尾靜脈注射miR-155 siRNA,對照組和模型組灌胃等體積蒸餾水,每天1次,連續(xù)5 d。

    3.2 肺指數(shù)檢測 立即處死小鼠,迅速解剖摘取肺,生理鹽水清洗干凈,吸干表面水分,稱重,參考文獻[11]檢測各組小鼠肺指數(shù)。肺指數(shù)=小鼠肺質量(mg)/體質量(g)。

    3.3 HE 檢測肺組織病理情況 部分肺組織置于4%多聚甲醛中固定,經(jīng)脫水、二甲苯透明后,石蠟包埋,切片機切片,切片厚度4 μm。切片經(jīng)染色,依次進入二甲苯和乙醇中脫蠟,蘇木精染色、1%鹽酸乙醇分化、伊紅復染,二甲苯透明、中性樹膠封片,顯微鏡下觀察肺組織情況。

    3.4 ELISA 檢測肺組織中 TGF-β、IL-6 和 TNF-α 水平 部分肺組織添加蛋白裂解液,冰上勻漿并充分裂解20 min,11 180×g、4 ℃離心20 min,上清液為總蛋白。參考小鼠TGF-β、IL-6和TNF-α ELISA 試劑盒檢測肺組織中TGF-β、IL-6和TNF-α水平。

    3.5 實時熒光定量PCR 檢測肺組織中miR-155 水平 部分肺組織手術剪在冰上剪碎、添加Trizol冰上研磨,提取總RNA,cDNA 第一條鏈合成試劑盒合成cDNA,實時熒光定量PCR 檢測肺組織中miR-155 水平。miR-155的上游引物序列為5'-CGGCGGTTAATGCTAATTGTGAT-3',下游引物序列為5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3';U6 的上游引物序列為5'-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3',下游引物序列為5'-AAATATGGAACGCTTCACGA-3'。20 μL 反應體系:2 μL cDNA,10 μL 2×SYBR qPCR Mix,上、下游引物(均為 10 μmol/L)各 1 μL,6 μL ddH2O。反應條件:94 ℃ 20 s;95 ℃ 10 s,60 ℃ 20 s,40個循環(huán)。2-ΔΔCt法計算miR-155相對表達水平。

    3.6 蛋白免疫印跡檢測肺組織中JAK1、p-JAK1、STAT1 和p-STAT1 蛋白水平 部分肺組織手術剪剪碎,添加蛋白裂解液冰上研磨并裂解,11 180×g、4 ℃離心20 min,上清為總蛋白,BCA 蛋白試劑盒檢測蛋白濃度,20 μg 上樣量經(jīng)凝膠電泳分離蛋白,硝酸纖維素膜280 mA轉膜,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,對應加入 JAK1、p-JAK1、STAT1、p-STAT1 和 GAPDH 抗體,4 ℃孵育過夜;加入對應Ⅱ抗,室溫孵育1 h。DAB 工作液避光顯色,蛋白凝膠成像儀拍照和灰度分析。

    4 統(tǒng)計學處理

    采用GraphPad Prism 7 軟件進行統(tǒng)計學分析。計量數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。多組間比較行單因素方差分析,進一步兩兩比較行SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    結 果

    1 SFJDC對肺指數(shù)的影響

    與對照組相比,模型組肺指數(shù)顯著升高(P<0.05);與模型組相比,低、高劑量SFJDC 組肺指數(shù)顯著降低(P<0.05);與SFJDC 低劑量組相比,SFJDC 高劑量組肺指數(shù)顯著降低(P<0.05);與SFJDC 高劑量組相比,SFJDC+miR-155 siRNA 組肺指數(shù)顯著升高(P<0.05),見圖1。

    Figure 1. Comparison of lung index in the 5 groups. Mean±SD.n=10.*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs model group;△P<0.05 vs low-dose SFJDC group;▲P<0.05 vs high-dose SFJDC group.圖1 5組肺指數(shù)水平比較

    2 SFJDC對肺組織的影響

    對照組小鼠肺組織肺泡結構完整、清晰,間質間無充血、壞死、炎癥浸潤等病理現(xiàn)象;模型組小鼠肺結構消失,肺泡出現(xiàn)明顯斷裂、融合、滲出,肺間質出現(xiàn)明顯炎癥浸潤、水腫、充血現(xiàn)象;隨著SFJDC 劑量的升高,肺泡斷裂現(xiàn)象減少,肺泡融合及肺間質炎癥浸潤現(xiàn)象減輕,組織水腫緩解;在高劑量SFJDC 基礎上使用miR-155 siRNA 后,大鼠肺組織病變較SFJDC高劑量組加重,見圖2。

    Figure 2. Morphological changes of lung tissues of the mice in the 5 groups. The scale bar=50 μm. Control group:the structure was complete without pathological phenomenon;model group:lungs showed destruction of the structure,and the arrow showed generous phenomenon of inflammatory infiltration and congestion;low-dose SFJDC group:alveolus pulmonis appeared,and arrow showed that phenomena of inflammatory infiltration and congestion were reduced;high-dose SFJDC group:the phenomenon of alveolar rupture was basically disappeared,and arrow showed there was almost no phenomenon of inflammatory infiltration and congestion,and the bronchial wall became significantly thinner than that in low-dose SFJDC group;SFJDC+miR-155 siRNA group:arrow showed that inflammatory infiltration and congestion increased compared with highdose SFJDC group.圖2 5組小鼠肺組織形態(tài)

    3 SFJDC 對肺組織中 TGF-β、IL-6 和 TNF-α 水平的影響

    與對照組相比,模型組肺組織中TGF-β、IL-6 和TNF-α 水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,低、高劑量SFJDC 組肺組織中TGF-β、IL-6和TNF-α水平顯著降低(P<0.05);與低劑量SFJDC 組相比,高劑量SFJDC 組肺組織中 TGF-β、IL-6 和 TNF-α 水平顯著降低(P<0.05);與高劑量SFJDC 組相比,SFJDC+miR-155 siRNA 組肺組織中 TGF-β、IL-6 和 TNF-α 水平顯著升高(P<0.05),見圖3。

    4 SFJDC 對肺組織中 miR-155 及 JAK1、p-JAK1、STAT1和p-STAT1蛋白水平的影響

    與對照相比,模型組肺組織中miR-155 水平顯著降低(P<0.05),p-JAK1/JAK1 和 p-STAT1/STAT1比值顯著升高(P<0.05);與模型組相比,低、高劑量SFJDC 組肺組織中miR-155 水平顯著升高(P<0.05),p-JAK1/JAK1 和 p-STAT1/STAT1 比值顯著降低(P<0.05);與低劑量SFJDC 組相比,高劑量SFJDC組肺組織中 miR-155 水平顯著升高(P<0.05),p-JAK1/JAK1 和 p-STAT1/STAT1 比值顯著降低(P<0.05);與高劑量SFJDC 組相比,SFJDC+miR-155 siRNA 組肺組織中miR-155 水平顯著降低(P<0.05),p-JAK1/JAK1 和 p-STAT1/STAT1 比值顯著升高(P<0.05),見圖4。

    討 論

    甲型流感病毒H1N1 肺炎在2009 年全球爆發(fā),患者表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、惡心、嘔吐等流感樣癥狀。中醫(yī)認為這屬于“寒毒疫”,邪毒侵入人體,正邪相爭而發(fā)熱,故發(fā)熱而口微渴或不渴,飲水少,后期高熱耗傷而出現(xiàn)口渴喜飲;吳又可《溫病條辨》指出:“世多言寒疫者,究其病狀,則憎寒狀熱,頭痛骨節(jié)煩疼,雖發(fā)熱而不甚渴……”[12]。為探索治療甲型流感病毒H1N1 肺炎的有效藥物,本研究利用H1N1 流感病毒建立該疾病的小鼠模型,顯示小鼠肺部肺泡出現(xiàn)明顯斷裂、融合、滲出,肺間質出現(xiàn)明顯炎癥浸潤、充血、水腫,這些病理改變導致肺部重量增加,導致肺指數(shù)升高,提示模型中小鼠肺組織出現(xiàn)明顯的病理損傷,模型建立成功。

    Figure 3. The levels of TGF-β(A),IL-6(B)and TNF-α(C)in lung tissues of the mice in the 5 groups. Mean±SD. n=10.*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs model group;△P<0.05 vs low-dose SFJDC group;▲P<0.05 vs high-dose SFJDC group.圖3 5組肺組織中TGF-β、IL-6和TNF-α水平比較

    中醫(yī)在治療甲型流感病毒H1N1 肺炎中表現(xiàn)出獨特優(yōu)勢,中藥SFJDC 以虎杖和連翹為君藥,虎杖具有祛風、利濕、破淤、清肝涼血之功效,連翹可清熱解毒、散結、涼血清腫;諸藥配伍,板藍根清熱解毒、清血利咽,馬鞭草活血化瘀,敗醬草祛瘀止痛、除癰腫結熱,柴胡結表,蘆根清降肺胃、生津止渴;甘草為使,調和諸藥[13]。本研究檢測顯示,經(jīng) SFJDC 治療后,模型小鼠肺組織炎癥浸潤、充血、水腫現(xiàn)象減少,肺指數(shù)降低,提示SFJDC 能夠減輕肺組織損傷,實現(xiàn)對甲型流感病毒H1N1肺炎小鼠肺損傷的緩解,具體機制尚需進一步研究。

    TGF-β、IL-6 和 TNF-α 與甲型 H1N1 流感病毒關系密切,甲型H1N1流感病毒侵入機體后募集多種免疫細胞,免疫細胞中單核巨噬細胞可產(chǎn)生TGF-β、IL-6 和TNF-α,逐步入侵肺部,刺激內皮細胞和白細胞釋放一系列炎癥因子,引起免疫損傷[14-15]。本研究結果亦顯示,模型組肺組織中炎癥因子TGF-β、IL-6 和TNF-α均處于高表達狀態(tài),SFJDC能夠降低以上因子水平,起到抑炎作用。有研究觀察到miR-155 作為多功能miRNA,可參與天然免疫、特異性免疫過程,可調控小膠質 BV-2 細胞炎癥因子分泌[16];JAK1-STAT1 通路是眾多細胞因子信號轉導中的共同途徑,參與細胞增殖、分化、凋亡、炎癥等多種過程,參與炎癥因子的傳導與調控[17],其激活在甲型流感病毒FM1 誘導肺炎發(fā)生過程中發(fā)揮促進作用[18]。此外,miR-155 可調控下游靶標SOCS1 表達,導致JAK1-STAT1 通路磷酸化激活,進而使巨噬細極化、釋放炎癥因子,促進動脈粥樣硬化進展[19]。以上研究表明,miR-155/JAK1-STAT1 可是在甲型流感病毒FM1 誘導肺炎發(fā)生發(fā)展機制中發(fā)揮重要作用。本研究顯示,模型組肺組織中miR-155 低表達,JAK1-STAT1 通路處于激活狀態(tài),提示miR-155/JAK1-STAT1 通路參與肺損傷炎癥過程,與上述研究一致。另添加SFJDC 后,隨著劑量的升高,小鼠肺組織中miR-155 水平逐漸升高,JAK1-STAT1 通路激活程度降低,提示SFJDC 可升高miR-155、抑制JAK1-STAT1通路,這可能是SFJDC 緩解甲型流感病毒H1N1肺炎小鼠體內炎癥發(fā)應的調控途徑。故本研究在高劑量SFJDC 基礎上進一步使用miR-155 siRNA 下調miR-155,結果顯示JAK1-STAT1通路激活程度升高,炎癥因子水平升高,SFJDC 對甲型流感病毒H1N1 肺炎小鼠的肺組織損傷的緩解作用減弱,表明SFJDC 通過升高miR-155,進而抑制JAK1-STAT1通路激活,降低炎癥反應,緩解甲型流感病毒H1N1肺炎。

    Figure 4. The miR-155 level,and the JAK1,p-JAK1,STAT1 and p-STAT1 protein levels in lung tissues of the mice in the 5 groups. Mean±SD. n=10.*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs model group;△P<0.05 vs low-dose SFJDC group;▲P<0.05 vs high-dose SFJDC group.圖4 5組肺組織中miR-155及JAK1、p-JAK1、STAT1和p-STAT1蛋白水平

    綜上所述,SFJDC 可緩解甲型流感病毒H1N1 肺炎小鼠炎癥損傷,其機制與升高miR-155、抑制JAK1-STAT1通路有關。

    猜你喜歡
    組肺流感病毒通路
    異甘草酸鎂對博來霉素誘導肺纖維化大鼠治療作用及其機制
    抗甲型流感病毒中藥活性成分的提取
    山莨菪堿預處理對大鼠肝缺血再灌注誘發(fā)肺損傷的影響
    高原地區(qū)流感病毒培養(yǎng)的條件優(yōu)化
    流感病毒分子檢測技術的研究進展
    基于HRP直接標記的流感病毒H1N1電化學免疫傳感器
    Kisspeptin/GPR54信號通路促使性早熟形成的作用觀察
    proBDNF-p75NTR通路抑制C6細胞增殖
    通路快建林翰:對重模式應有再認識
    Hippo/YAP和Wnt/β-catenin通路的對話
    遺傳(2014年2期)2014-02-28 20:58:11
    亚洲国产av新网站| 国产成+人综合+亚洲专区| 精品视频人人做人人爽| av电影中文网址| 最新美女视频免费是黄的| 久久人妻熟女aⅴ| 亚洲熟女毛片儿| 久久久久精品国产欧美久久久| 最新在线观看一区二区三区| 国产黄色免费在线视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 亚洲专区字幕在线| 色综合婷婷激情| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产单亲对白刺激| 麻豆国产av国片精品| 国产又色又爽无遮挡免费看| a级毛片黄视频| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 久久天堂一区二区三区四区| 免费少妇av软件| 久久久久久免费高清国产稀缺| 99国产精品99久久久久| 午夜成年电影在线免费观看| a在线观看视频网站| 欧美黑人欧美精品刺激| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲三区欧美一区| 我要看黄色一级片免费的| 成人精品一区二区免费| 成年女人毛片免费观看观看9 | 国产aⅴ精品一区二区三区波| 最黄视频免费看| 午夜福利在线观看吧| 久久精品人人爽人人爽视色| 99在线人妻在线中文字幕 | 两个人看的免费小视频| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 一区在线观看完整版| 久久免费观看电影| 国产成人精品久久二区二区91| 99国产精品免费福利视频| av在线播放免费不卡| 亚洲成人免费av在线播放| 日韩欧美国产一区二区入口| 女同久久另类99精品国产91| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 国产精品一区二区免费欧美| 一本色道久久久久久精品综合| 日韩中文字幕视频在线看片| 韩国精品一区二区三区| 动漫黄色视频在线观看| www日本在线高清视频| 午夜福利影视在线免费观看| 精品一区二区三区av网在线观看 | 人妻久久中文字幕网| 精品熟女少妇八av免费久了| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 91字幕亚洲| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产在视频线精品| 日本av手机在线免费观看| 久久久国产一区二区| 亚洲国产av新网站| 桃红色精品国产亚洲av| 男女下面插进去视频免费观看| 久久久国产精品麻豆| 久久中文看片网| 国产不卡一卡二| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 日韩中文字幕欧美一区二区| 无限看片的www在线观看| 一级毛片精品| 免费av中文字幕在线| 狂野欧美激情性xxxx| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 欧美在线一区亚洲| 国产精品免费一区二区三区在线 | 亚洲成人手机| 国产成人免费无遮挡视频| 成人影院久久| 免费av中文字幕在线| 国产精品免费大片| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 中文欧美无线码| 波多野结衣一区麻豆| 青草久久国产| a在线观看视频网站| 青草久久国产| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 免费在线观看黄色视频的| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 国产黄频视频在线观看| 亚洲五月婷婷丁香| 1024视频免费在线观看| 亚洲黑人精品在线| 成在线人永久免费视频| videosex国产| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产精品久久久av美女十八| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲精品在线观看二区| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 一级黄色大片毛片| 又黄又粗又硬又大视频| 色老头精品视频在线观看| 午夜91福利影院| 亚洲精品乱久久久久久| cao死你这个sao货| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲国产成人一精品久久久| 丝袜在线中文字幕| 日本黄色视频三级网站网址 | 国产精品99久久99久久久不卡| 不卡一级毛片| 亚洲精品在线美女| 亚洲熟女毛片儿| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 曰老女人黄片| 在线 av 中文字幕| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| av电影中文网址| 午夜91福利影院| 中文字幕高清在线视频| 怎么达到女性高潮| 色视频在线一区二区三区| 精品国内亚洲2022精品成人 | 69av精品久久久久久 | √禁漫天堂资源中文www| 国产精品欧美亚洲77777| 亚洲国产欧美网| 国产精品一区二区精品视频观看| 亚洲色图av天堂| 一二三四在线观看免费中文在| 国产精品久久久久久精品古装| 国产在线一区二区三区精| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲国产看品久久| 99在线人妻在线中文字幕 | 国产欧美亚洲国产| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲av欧美aⅴ国产| 大香蕉久久成人网| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 女警被强在线播放| 国产单亲对白刺激| 国产精品久久电影中文字幕 | 久久精品成人免费网站| 最新的欧美精品一区二区| 亚洲五月婷婷丁香| 一区二区av电影网| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 亚洲伊人久久精品综合| 亚洲国产欧美在线一区| 国产高清videossex| 久久久久久久久免费视频了| 久久精品国产综合久久久| 成年人午夜在线观看视频| 国产精品99久久99久久久不卡| 欧美+亚洲+日韩+国产| 欧美av亚洲av综合av国产av| 久久狼人影院| 国产91精品成人一区二区三区 | av又黄又爽大尺度在线免费看| 亚洲avbb在线观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 久久热在线av| 亚洲精品av麻豆狂野| 精品高清国产在线一区| 一区二区三区乱码不卡18| 岛国在线观看网站| 欧美日韩亚洲高清精品| www.自偷自拍.com| 两个人免费观看高清视频| 女人久久www免费人成看片| 国产精品av久久久久免费| a级毛片在线看网站| 最黄视频免费看| 欧美国产精品一级二级三级| 黄片播放在线免费| 下体分泌物呈黄色| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 飞空精品影院首页| 免费少妇av软件| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 交换朋友夫妻互换小说| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产激情久久老熟女| 国产99久久九九免费精品| 激情在线观看视频在线高清 | 一本大道久久a久久精品| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 在线 av 中文字幕| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲精品国产区一区二| 老司机靠b影院| 欧美性长视频在线观看| 高清在线国产一区| 国产熟女午夜一区二区三区| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产xxxxx性猛交| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 久久人妻av系列| 国产极品粉嫩免费观看在线| 香蕉丝袜av| 亚洲成人国产一区在线观看| 18禁观看日本| 欧美激情久久久久久爽电影 | 久久天堂一区二区三区四区| 国产精品国产av在线观看| 老汉色av国产亚洲站长工具| 久久人妻熟女aⅴ| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 99热国产这里只有精品6| 日本一区二区免费在线视频| 久久精品成人免费网站| 日韩视频一区二区在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 久久九九热精品免费| 成人国产av品久久久| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 日韩免费av在线播放| 国产日韩欧美在线精品| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产精品欧美亚洲77777| 中文字幕高清在线视频| 精品福利观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 久久亚洲真实| 正在播放国产对白刺激| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲熟女毛片儿| 99国产极品粉嫩在线观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 国产精品.久久久| 亚洲av欧美aⅴ国产| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 久久久国产一区二区| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 午夜91福利影院| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 久久婷婷成人综合色麻豆| 日韩精品免费视频一区二区三区| 天堂动漫精品| 啪啪无遮挡十八禁网站| 女警被强在线播放| 男女高潮啪啪啪动态图| 精品国产国语对白av| 国产视频一区二区在线看| 免费黄频网站在线观看国产| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 大型av网站在线播放| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产单亲对白刺激| 国产麻豆69| 欧美成狂野欧美在线观看| 最新的欧美精品一区二区| 18禁美女被吸乳视频| 极品教师在线免费播放| 成在线人永久免费视频| 黄频高清免费视频| av有码第一页| 啦啦啦 在线观看视频| 99在线人妻在线中文字幕 | 超碰97精品在线观看| 中文亚洲av片在线观看爽 | 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 人人澡人人妻人| 丝袜在线中文字幕| 久久亚洲精品不卡| 99国产综合亚洲精品| 久久久国产成人免费| 免费在线观看日本一区| 日本五十路高清| 久久久水蜜桃国产精品网| 久久九九热精品免费| 国产片内射在线| 女同久久另类99精品国产91| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 69av精品久久久久久 | 中文字幕制服av| 国产亚洲欧美在线一区二区| 制服诱惑二区| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 成人特级黄色片久久久久久久 | 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产单亲对白刺激| 搡老熟女国产l中国老女人| 涩涩av久久男人的天堂| 一个人免费在线观看的高清视频| 在线观看免费午夜福利视频| 国产99久久九九免费精品| 超碰97精品在线观看| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 1024视频免费在线观看| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产日韩欧美视频二区| 一区福利在线观看| 日韩人妻精品一区2区三区| 国产亚洲欧美精品永久| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 久久狼人影院| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 最新在线观看一区二区三区| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 国产日韩欧美在线精品| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | av线在线观看网站| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 久久久精品94久久精品| 亚洲精品在线观看二区| 丝袜美腿诱惑在线| 亚洲免费av在线视频| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 男女午夜视频在线观看| 天天添夜夜摸| 国产精品亚洲av一区麻豆| 九色亚洲精品在线播放| 国产免费av片在线观看野外av| av网站免费在线观看视频| 成人18禁在线播放| 亚洲熟女毛片儿| 亚洲,欧美精品.| 大香蕉久久成人网| 亚洲精品av麻豆狂野| 欧美+亚洲+日韩+国产| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 成人国产av品久久久| 亚洲精品在线观看二区| 国产在线免费精品| 国产精品偷伦视频观看了| 午夜成年电影在线免费观看| 亚洲熟女毛片儿| 亚洲中文av在线| 久久这里只有精品19| 成人永久免费在线观看视频 | 妹子高潮喷水视频| 老汉色av国产亚洲站长工具| 亚洲天堂av无毛| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久av网站| 十八禁人妻一区二区| 人人澡人人妻人| 无遮挡黄片免费观看| 叶爱在线成人免费视频播放| 777米奇影视久久| 国产亚洲精品一区二区www | 精品国产乱子伦一区二区三区| 欧美人与性动交α欧美软件| 久久亚洲精品不卡| 免费看十八禁软件| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲熟女毛片儿| 亚洲第一青青草原| 国产黄色免费在线视频| 国产人伦9x9x在线观看| 在线观看66精品国产| 蜜桃在线观看..| 十八禁人妻一区二区| 91老司机精品| 亚洲精品在线观看二区| 一夜夜www| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 热re99久久精品国产66热6| 国产亚洲欧美在线一区二区| 性少妇av在线| netflix在线观看网站| 亚洲欧美色中文字幕在线| 视频在线观看一区二区三区| 久久影院123| 动漫黄色视频在线观看| 久久久国产精品麻豆| 精品午夜福利视频在线观看一区 | 国产成人欧美| 色94色欧美一区二区| 在线av久久热| 精品福利观看| 99在线人妻在线中文字幕 | 18禁黄网站禁片午夜丰满| 91精品国产国语对白视频| 99久久人妻综合| 久久中文字幕一级| 黑人猛操日本美女一级片| 国产视频一区二区在线看| 99国产精品免费福利视频| 人人妻人人澡人人看| 亚洲专区字幕在线| 日韩视频在线欧美| 欧美在线一区亚洲| 91大片在线观看| 蜜桃国产av成人99| 女人久久www免费人成看片| 日本vs欧美在线观看视频| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲欧美色中文字幕在线| 嫁个100分男人电影在线观看| 窝窝影院91人妻| 免费黄频网站在线观看国产| 十八禁人妻一区二区| 丝袜美足系列| 国产高清激情床上av| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 日韩免费高清中文字幕av| 欧美黑人精品巨大| 国产av又大| 一本综合久久免费| 亚洲精品一二三| 99香蕉大伊视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 精品乱码久久久久久99久播| tocl精华| 欧美精品啪啪一区二区三区| 91精品三级在线观看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 亚洲专区国产一区二区| 高清视频免费观看一区二区| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲精品美女久久av网站| 桃花免费在线播放| 九色亚洲精品在线播放| 亚洲中文av在线| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 三上悠亚av全集在线观看| 久久中文字幕一级| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 51午夜福利影视在线观看| 久久久精品94久久精品| 18禁观看日本| 久久久久久久精品吃奶| 人人澡人人妻人| 国产在线一区二区三区精| 咕卡用的链子| 亚洲成国产人片在线观看| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 一个人免费在线观看的高清视频| 久久热在线av| 丝袜喷水一区| 国产黄频视频在线观看| 黑人操中国人逼视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 这个男人来自地球电影免费观看| 色播在线永久视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 波多野结衣一区麻豆| 免费日韩欧美在线观看| 亚洲,欧美精品.| 99热网站在线观看| 一级黄色大片毛片| 国产三级黄色录像| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 亚洲精品国产区一区二| 天天添夜夜摸| 91大片在线观看| 他把我摸到了高潮在线观看 | 在线观看免费视频日本深夜| 国产三级黄色录像| 亚洲欧洲日产国产| 大型黄色视频在线免费观看| 交换朋友夫妻互换小说| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 午夜精品久久久久久毛片777| 欧美精品啪啪一区二区三区| 十八禁网站网址无遮挡| 777米奇影视久久| 飞空精品影院首页| 99国产精品一区二区蜜桃av | 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 亚洲成人手机| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 免费人妻精品一区二区三区视频| 一级毛片女人18水好多| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 久久国产精品影院| 黄色视频,在线免费观看| 中文字幕最新亚洲高清| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 老司机午夜十八禁免费视频| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 精品高清国产在线一区| 欧美黄色片欧美黄色片| 2018国产大陆天天弄谢| 97在线人人人人妻| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 欧美成人午夜精品| 亚洲黑人精品在线| 精品高清国产在线一区| 欧美黄色片欧美黄色片| 美女扒开内裤让男人捅视频| 亚洲精品在线观看二区| 波多野结衣一区麻豆| 国产精品1区2区在线观看. | 国产日韩欧美视频二区| 国产免费福利视频在线观看| 看免费av毛片| 国产精品久久久人人做人人爽| 久久久久视频综合| 亚洲国产成人一精品久久久| 青草久久国产| 一级黄色大片毛片| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 国产一区二区三区综合在线观看| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产在线观看jvid| 一区二区av电影网| 婷婷成人精品国产| 国产成人影院久久av| 欧美日韩av久久| av网站免费在线观看视频| 女性被躁到高潮视频| 国产av精品麻豆| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 欧美国产精品一级二级三级| 嫩草影视91久久| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 久久久久久久久久久久大奶| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 中文字幕人妻丝袜制服| 一本综合久久免费| 久久中文字幕一级| 成人精品一区二区免费| 91精品三级在线观看| av天堂久久9| 久热这里只有精品99| 久久久久国产一级毛片高清牌| 韩国精品一区二区三区| 一区在线观看完整版| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲一码二码三码区别大吗| 在线观看舔阴道视频| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲精品久久午夜乱码| 亚洲,欧美精品.| 久久久久精品国产欧美久久久| 日韩精品免费视频一区二区三区| 亚洲精品乱久久久久久| 日韩欧美国产一区二区入口| 精品熟女少妇八av免费久了| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 热99久久久久精品小说推荐| 欧美另类亚洲清纯唯美| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 欧美一级毛片孕妇| 精品国产一区二区三区四区第35| 中文字幕色久视频| 国产成人系列免费观看| 欧美黄色淫秽网站| 国产在线一区二区三区精| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产精品九九99| 亚洲 欧美一区二区三区| 99re6热这里在线精品视频| 欧美大码av| 国产免费av片在线观看野外av| 久久久国产一区二区| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 女人精品久久久久毛片| 乱人伦中国视频| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 丝袜喷水一区| 久久久久国产一级毛片高清牌| 涩涩av久久男人的天堂| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 丁香欧美五月| 婷婷丁香在线五月| avwww免费| 色尼玛亚洲综合影院| 两个人免费观看高清视频| svipshipincom国产片| 国产精品久久久人人做人人爽| www.熟女人妻精品国产| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产高清videossex| 亚洲男人天堂网一区| 久久热在线av| 亚洲久久久国产精品| 国精品久久久久久国模美| 91精品三级在线观看| 免费在线观看日本一区| 在线天堂中文资源库| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 色94色欧美一区二区| netflix在线观看网站| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产亚洲av高清不卡| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 乱人伦中国视频| e午夜精品久久久久久久| 97在线人人人人妻| 一本色道久久久久久精品综合| 无遮挡黄片免费观看| 欧美一级毛片孕妇| 一区福利在线观看| 国产人伦9x9x在线观看| 亚洲男人天堂网一区| 脱女人内裤的视频|