山莨菪堿預處理對大鼠肝缺血再灌注誘發(fā)肺損傷的影響

薛小紅，李 璐，周榮勝

肝臟手術特別是肝移植手術中常出現(xiàn)肝缺血/再灌注(I/R)的操作過程，這可導致肺臟等多器官的損傷，嚴重者出現(xiàn)功能衰竭。肝臟手術I/R所致急性肺損傷的發(fā)病機制目前尚不清楚。山莨菪堿為M膽堿受體拮抗劑，研究[1]證實其對多個器官I/R損傷具有良好的保護作用。本研究制作70%肝臟I/R損傷模型，以山莨菪堿進行預處理，旨在探討山莨菪堿預處理對大鼠肝I/R誘發(fā)肺損傷的影響，為臨床防治研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑、儀器 本實驗選擇健康清潔成年雄性SD大鼠48只，體質量210～280 g，由西安交通大學醫(yī)學部動物實驗中心提供。鹽酸消旋山莨菪堿注射液(天津金耀氨基酸有限公司，批號：1409051)；SP試劑盒購自北京中山生物技術有限公司；丙二醛(MDA)、髓過氧化物酶(MPO)與超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購自南京生物建成工程研究所；圖像采集系統(tǒng)、光學顯微鏡等由西安交通大學醫(yī)學院病理學實驗室提供。

1.2 動物分組和模型制備 48只大鼠按隨機數(shù)字表法平均分成3組，分別為假手術組(S組)、肝臟缺血再灌注組(IR組)和山莨菪堿預處理組(A組)，每組16只。S組：大鼠開腹后分離肝門不做結扎；IR組：大鼠開腹后結扎肝門，60 min后恢復肝臟血流，開放血流3 h后處死大鼠；A組：制模過程同IR組，阻斷入肝血流前30 min，自尾靜脈注射稀釋成1 mL的山莨菪堿(約2 mg/kg)，其余同IR組。S組和IR組自尾靜脈注射等劑量的0.9%氯化鈉溶液。

按NAUTA等[2]的方法制作70%肝臟I/R模型：動物于術前禁食12 h，自由飲水，采用腹腔內注射10%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉大鼠，2～4 min后以鉗夾四肢無反應作為麻醉成功標志，然后將大鼠仰臥位固定于操作臺上。經(jīng)陰莖背靜脈注入稀釋肝素(200 U/kg)，使其肝素化。自腹下部沿正中線縱行向上剪開皮膚，直至胸腹交界處。逐層打開腹腔，分離肝門及肝十二指腸韌帶，尋找到肝門，IR組和A組用小動脈夾夾閉肝左葉和肝中葉部分肝門，30 min后松開小動脈夾肝臟恢復血流，然后逐層關閉腹腔，3 h后處死大鼠。S組只解剖，肝門不作血管夾閉。

1.3 標本的采集 大鼠處死后，取右肺上葉置于10%中性甲醛溶液浸泡固定，待行HE染色和免疫組織化學(免疫組化)。取右肺下葉組織，稱重為濕重，然后放入70 ℃烤箱中烘烤48 h后，稱重為干重，計算肺組織濕重/干重(W/D)比值。取部分右肺組織用濾紙吸干，置于-70 ℃冰箱保存，待進一步檢測MDA含量、MPO和SOD活性。

1.4 指標檢測

1.4.1 組織形態(tài)學觀察(HE染色) 取部分肺組織經(jīng)過脫蠟，水化，染色，脫水，透明，封片，在100倍和400倍光鏡下觀察肺組織病理形態(tài)學變化，采集圖像。

1.4.2 免疫組化法檢測HO-1和iNOS蛋白 取部分右上葉肺組織標本，石蠟包埋，制成3 μm厚的切片。SP法免疫組化染色按SP試劑盒操作說明實施。隨機抽取上述切片，以PBS代替HO-1和iNOS多克隆抗體作為陰性對照(其余步驟不變)。全自動圖像分析系統(tǒng)對陽性染色進行分析，測定HO-1和iNOS陽性表達的吸光度值，隨機測定5個高倍視野，計算其平均值作為該切片的代表值。

1.4.3 肺組織MDA、SOD和MPO的測定 取部分肺組織50 mg用冷0.9%氯化鈉溶液制成肺組織勻漿，4℃ 3 000 r/min離心10 min，上清液-80 ℃保存，檢測前再次離心取上清液；用試劑盒分別采用硫代巴比妥酸法測定MDA含量、黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性和過氧化氫還原法測定MPO活性，嚴格按照試劑盒說明書操作步驟進行檢測。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用單因素方差分析和q檢驗。

2 結果

2.1 大鼠肺組織病理形態(tài)學觀察

2.1.1 肺臟組織大體觀察 S組雙肺組織表面光滑，呈淡粉紅色，打開胸腔后很快萎縮；IR組肺臟體積增大顏色變深，組織包膜下可見點狀、片狀出血灶，肺泡腔有滲出液；A組肺組織輕度增大，肺組織可見點狀、片狀出血灶，但較IR組輕。

2.1.2 光鏡下肺組織HE染色結果 S組肺組織結構完整，未見明顯的異常，肺泡腔完整，由單層肺泡上皮細胞組成；IR組肺組織血管充血，肺泡腔破裂且大小不一，可見紅色滲出液，肺間質增厚水腫，有大量炎性細胞浸潤；A組肺組織可見充血水腫，肺間質增厚有炎性細胞浸潤，但較IR組輕(見圖1)。

2.2 大鼠肺組織HO-1和iNOS表達

2.2.1 肺組織HO-1表達 光鏡下，IR組、A組大鼠肺組織肺泡上皮細胞、肺間質炎性細胞及血管內皮細胞等細胞內HO-1的表達呈陽性(呈棕黃色)，A組表達最強，S組表達最弱(呈弱陽性)。與S組比較，IR組和A組肺組織HO-1蛋白表達均明顯增加(P<0.01)；與IR組比較，A組肺組織HO-1蛋白表達明顯增加(P<0.01)(見表1、圖2)。

2.2.2 肺組織iNOS蛋白表達 光鏡下，IR組和A組大鼠肺組織中肺泡間質的血管平滑肌細胞、單核-巨噬細胞、支氣管上皮細胞、血管內皮細胞等胞內iNOS的表達呈陽性(呈棕黃色)，IR組表達最強，S組表達最弱(呈弱陽性)。與S組比較，IR組和A組肺組織iNOS蛋白表達均明顯增加(P<0.01)；與IR組比較，A組肺組織iNOS蛋白表達明顯降低(P<0.01)(見表1、圖3)。

表1 3組大鼠肺組織HO-1和iNOS蛋白表達的比較

2.3 肺組織W/D比值、MDA含量、SOD和MPO活性的變化 與S組比較，IR組和A組肺組織W/D比值、MDA含量、MPO活性均明顯增高(P<0.01)，SOD活性均明顯降低(P<0.01)；與IR組相比較，A組肺組織W/D比值、MDA含量、MPO活性均明顯降低(P<0.01)，SOD活性明顯增高(P<0.01)(見表2)。

3 討論

肝臟I/R損傷在臨床上十分常見，創(chuàng)傷、休克、肝葉切除、肝移植等過程中都有可能發(fā)生,不僅引起肝臟本身的損害，還可導致遠隔器官如肺、腎、小腸等器官的功能受損，肺臟是其中最易受累的器官之一。我們的前期研究[3]發(fā)現(xiàn)，肝I/R損傷能加重大鼠肺損傷，上調肺組織中的HO-1及iNOS表達。本實驗研究結果顯示，與S組比較，IR組和A組肺組織HE染色病理改變顯著加重，肺葉W/D比顯著升高，肺組織MDA、MPO表達顯著升高，而SOD顯著降低，表明肝I/R過程中造成了肺損傷。

表2 3組肺組織W/D比值 、MDA含量、MPO和SOD活性的比較

山莨菪堿是提取自茄科植物山莨菪中的一種生物堿，與阿托品等莨菪烷類藥物同屬于M膽堿受體拮抗劑[4]。主要用于治療胃腸道痙攣收縮所引起的腹痛、感染中毒性休克等[5]。近年來研究[6]發(fā)現(xiàn)山莨菪堿對生命重要器官腦、肝、腎、心等器官的I/R損傷具有良好的保護作用，但其機制尚不清楚。研究[7-8]證實山莨菪堿對大鼠肝臟I/R損傷有保護作用，其機制可能是山莨菪堿能改善再灌注后的肝臟微循環(huán)障礙、減少氧自由基的生成。山莨菪堿可能通過抑制細胞因子腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6、白細胞介素-1等的釋放，抑制中性粒細胞聚集和氧自由基的產生、穩(wěn)定細胞膜和溶酶體膜、改善和疏通微循環(huán)等作用，對重要器官I/R損傷發(fā)揮保護作用[9]。實驗過程中我們發(fā)現(xiàn)，山莨菪堿對I/R的肝臟具有保護作用。山莨菪堿是否對肝臟I/R損傷過程中肺損傷具有保護作用，目前尚少報道。因此，本實驗首先建立70%肝臟I/R損傷模型，探討山莨菪堿預處理對大鼠肝I/R誘發(fā)肺損傷的保護作用。

本研究參照文獻[7-8]確定山莨菪堿劑量為2 mg/kg進行預處理，結果表明，與IR組比較，A組肺組織HE染色病理改變顯著減輕，肺葉W/D比顯著降低，肺組織MDA、MPO表達顯著降低，而SOD表達顯著升高，表明山莨菪堿預處理對肝臟I/R后肺損傷具有一定的保護作用。

HO-1又稱熱休克蛋白32 (HSP32)，是血紅素的限速酶和關鍵酶，有研究[10]表明HO-1活性的上調，可產生抗炎、抗氧化、抗凋亡等生物學效應，對肝臟I/R損傷起重要的保護作用[10]。iNOS主要存在炎性細胞中，是一種重要炎性介質，病理狀態(tài)下iNOS受炎性介質誘導生成增加，可產生大量NO，然而病理情況下大量的NO參與介導許多病理過程如肝臟I/R損傷、炎癥及休克等，導致器官損傷[11]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，與S組比較，IR組和A組的HO-1和iNOS蛋白表達顯著增加；與IR組比較，A組的HO-1蛋白表達顯著增加，而iNOS蛋白表達顯著降低。表明肝臟I/R損傷后肺組織中HO-1和iNOS蛋白表達都顯著增加，而山莨菪堿預處理可以顯著增加HO-1蛋白表達和減少iNOS蛋白表達，這可能與山莨菪堿預處理能減輕肝臟I/R后肺損傷的機制有關。

綜上所述，山莨菪堿預處理可減輕大鼠肝I/R肺損傷，其機制可能與上調肺組織中的HO-1及下調iNOS蛋白表達有關。但肝臟I/R肺損傷是個多環(huán)節(jié)構成、多因素參與的復雜過程，是否存在其他方面的因素，有待我們進一步研究。