木霉菌協(xié)同殺菌劑防治北蒼術(shù)白絹病的增效作用

賀字典，韓亞梅，金 歌，高玉峰，閔 康

（1.河北科技師范學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院/河北省作物逆境生物學(xué)重點實驗室，秦皇島 066600；2.河北科技師范學(xué)院學(xué)報編輯部，秦皇島 066600）

北蒼術(shù)Atractylodeschinensi主要分布在海拔50～2000 m 的燕山山脈，為河北省道地藥材之一。河北省北蒼術(shù)種植區(qū)域主要為秦皇島市青龍滿族自治縣和承德市隆化、灤平、平泉、寬城、豐寧、圍場等縣，因在新冠肺炎治療中發(fā)揮了重要作用，到2025 年，河北省北蒼術(shù)種植面積要達(dá)到3333 hm2，形成一地供全國的局面。由齊整小核菌Sclerotiumrolfsii侵染北蒼術(shù)發(fā)病后莖基部成爛麻狀，僅剩下纖維束，且在根莖表皮上長出白色菌絲和紅褐色菌核。該病菌不僅侵染北蒼術(shù)，還為害花生[1]、辣椒[2]、劍豆[3]、茅蒼術(shù)[4]、白術(shù)[5]、鐵皮石斛[6]、太子參[7]等作物、蔬菜和中藥材，白絹病已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上一種危害巨大的土傳病害。

目前，白絹病的防治仍以化學(xué)防治為主，10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑（water dispersible granule，WG）和10%三唑酮可濕性粉劑（wetting powders，WP）對齊整小核菌菌絲的抑菌率分別為79.9%和66.8%[8]。噻呋酰胺對北蒼術(shù)白絹病的防治效果為68.72%[9]。苯甲·嘧菌酯1500 倍液對鐵皮石斛白絹病的防治效果為90.27%[10]。50%異菌脲懸浮劑（suspension concentrate，SC）和24%噻呋酰胺SC 對花生白絹病的防治效果分別為44.6%～68.7%和66.1%～79.4%[11]。但齊整小核菌對多菌靈、嘧菌酯、腐霉利和嘧霉胺等多種殺菌劑均已產(chǎn)生了抗藥性[12]。為降低齊整小核菌的抗藥性，篩選和應(yīng)用生防菌防治白絹病已有報道。貝萊斯芽胞桿菌Bacillusvelezensis對齊整小核菌菌絲的抑菌率達(dá)到81.93%，對花生白絹病的田間防治效果為66.15%[13]。貝萊斯芽胞桿菌FJAT-17931 和暹羅芽胞桿菌BacillussiamensisFJAT-52595 對太子參白絹病菌的抑菌率分別為73.23%和71.16%[7]。哈茨木霉TrichodermaharzianumH2對齊整小核菌菌絲的抑菌率達(dá)到86.27%[14]。由于生防菌防治效果易受到環(huán)境條件、施用方法、殺菌劑等諸多因素的影響，導(dǎo)致防治效果不穩(wěn)定和速效性差，因此發(fā)揮化學(xué)殺菌劑與生防菌各自優(yōu)勢，將二者聯(lián)合應(yīng)用成為研究熱點。

木霉菌與代森錳鋅、三唑酮、啶酰菌胺等殺菌劑聯(lián)合使用不僅對香蕉枯萎病、百合貯存期鱗莖腐爛病、番茄灰霉病等病害防治效果提高了19.26%～29.29%[15-17]，而且能夠協(xié)同防治印度橡膠榕和魚腥草白絹病[18,19]，但木霉菌與殺菌劑協(xié)同防治北蒼術(shù)白絹病的報道很少[9]。因此為了進(jìn)一步提高木霉菌與殺菌劑協(xié)同對北蒼術(shù)白絹病防治效果，減少化學(xué)殺菌劑用量，本文采用生長速率法、平板對峙法和協(xié)同系數(shù)法從12 種殺菌劑中篩選出與7 種木霉菌具有生物相容性和增效作用的殺菌劑后，測定殺菌劑比對照減少50%用量時，木霉菌與殺菌劑協(xié)同對北蒼術(shù)白絹病的田間防治效果，以期為北蒼術(shù)白絹病綠色防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

木霉菌株：哈茨木霉T.harzianumT11、長枝木霉TrichodermalongibrachiatumT12、棘孢木霉Trichoderma asperellumT13、綠色木霉TrichodermavirideT14、深綠木霉TrichodermaatrovirideT15、棘孢木霉Trichoderma asperellumT16、粘綠木霉TrichodermavirenT17，由河北科技師范學(xué)院保存。

病原菌：齊整小核菌S.rolfsii, 由河北科技師范學(xué)院保存。

殺菌劑：30%噻唑鋅SC，浙江新農(nóng)化工股份有限公司；80%多菌靈WP，河北冠龍農(nóng)化有限公司；80%代森錳鋅WP，利民化工股份有限公司；250 g/L 嘧菌酯SC，先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司；30%噁霉靈水劑（aqueous solution，AS），四川國光農(nóng)化股份有限公司；20%噻菌銅SC，浙江龍灣化工有限公司；200 g/L氟酰羥·苯甲唑SC，瑞士先正達(dá)作物保護(hù)有限公司；62.5 g/L 精甲·咯菌腈懸浮種衣劑（flowable concentrate for seed coating，F(xiàn)S），先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司；43%唑醚·氟酰胺SC，巴斯夫（中國）有限公司；240 g/L 噻呋酰胺SC，河北三農(nóng)農(nóng)用化工有限公司；30%吡唑醚菌酯SC，華北制藥集團(tuán)愛諾有限公司；450 g/L咪鮮胺水乳劑（emulsion in water，EW），江蘇輝豐生物農(nóng)業(yè)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化 將4 ℃保存的木霉菌菌株和齊整小核菌分別接種于PDA 平板上，25 ℃培養(yǎng)至長滿培養(yǎng)皿，備用。

1.2.2 菌核的收集 將齊整小核菌菌餅接種于PDA 平板上，待菌絲表面長出菌核后，用無菌鑷子夾取菌核置于培養(yǎng)皿中，備用。

1.2.3 木霉菌對齊整小核菌菌絲和菌核萌發(fā)的抑制作用 待齊整小核菌和木霉菌長滿培養(yǎng)皿后，用直徑5 mm 的打孔器分別在齊整小核菌和木霉菌菌落邊緣打取菌餅。將木霉菌與病原菌同時接入PDA 平板上。二者相距3 cm，同時設(shè)只接種病原菌為對照，3 次重復(fù)，置于25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3 d 后測量病原菌指向木霉菌的菌落半徑，計算木霉菌對齊整小核菌菌絲的抑菌率[7]。抑菌率（%）＝（對照菌落直徑－處理菌落直徑）/（對照菌落直徑－菌餅直徑）×100。

將長滿培養(yǎng)皿的木霉菌，用5 mL無菌水清洗，用血球計數(shù)板測定分生孢子濃度達(dá)到1.27×108孢子/mL，吸取1.0 mL 孢子懸浮液均勻涂布于PDA 培養(yǎng)基表面。待懸浮液被PDA 完全吸收后，于每個平板上放置10 個菌核，以只接種菌核為對照，3 次重復(fù)。逐日記錄菌核萌發(fā)數(shù)量和萌發(fā)后菌絲菌落直徑，計算齊整小核菌菌核萌發(fā)率和對萌發(fā)菌絲的抑菌率[20]。菌核萌發(fā)率（%）=（萌發(fā)菌核數(shù)量/菌核總數(shù)量）×100。木霉菌對萌發(fā)菌絲的抑菌率（%）=（對照菌落直徑－處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100。

1.2.4 殺菌劑對齊整小核菌菌絲的毒力作用 采用菌絲生長速率法測定12 種殺菌劑對齊整小核菌菌絲的毒力作用。30%吡唑醚菌酯SC、30%噻唑鋅SC 和30%噁霉靈AS 的濃度均為3000、600、120、24 和4.80 μg/mL；80%多菌靈WP 濃度為1600、320、64、12.8 和2.56 μg/mL；80%代森錳鋅WP 濃度為10000、2000、400、80 和16 μg/mL；20%噻菌銅SC 的濃度為2000、400、80、16 和3.2 μg/mL；250 g/L 嘧菌酯SC 的濃度為1000、200、40、8.0 和1.6 μg/mL；200 g/L 氟酰羥·苯甲唑SC 的濃度為800、160、32、6.4 和1.28 μg/mL；62.5 g/L 精甲·咯菌腈FS 濃度為1250、250、50、10 和2 μg/mL；43%唑醚·氟酰胺SC 濃度為860、172、34.4、6.88 和1.38 μg/mL；240 g/L 噻呋酰胺SC 濃度為960、192、38.4、7.68 和1.54 μg/mL；450 g/L 咪鮮胺EW濃度分別為1800、360、72、14.4 和2.88 μg/mL。用PDA 培養(yǎng)基配制成含系列梯度濃度殺菌劑含藥平板，以加無菌水為對照。用直徑5 mm 的打孔器從培養(yǎng)5 d 病原菌的菌落邊緣打取菌餅，菌絲面向下接種于含不同濃度殺菌劑平板上，3 次重復(fù)。25 ℃黑暗培養(yǎng)3 d 后，采用十字交叉法測量菌落直徑，計算抑菌率和有效中濃度（effective concentration，EC50）。

1.2.5 殺菌劑和木霉菌生物相容性測定 采用菌絲生長速率法測定12種殺菌劑對3個木霉菌菌株T16、T15、T11的毒力作用。殺菌劑濃度同1.2.4。用PDA 培養(yǎng)基配制成含系列梯度濃度的殺菌劑培養(yǎng)基平板，以加無菌水為對照。用直徑5 mm 的打孔器從培養(yǎng)5 d 的新鮮木霉菌菌落邊緣打取菌餅，菌絲面向下接種于含不同濃度農(nóng)藥的平板上，3 次重復(fù)。25 ℃黑暗培養(yǎng)3 d 后，采用十字交叉法測菌落直徑，計算抑菌率和EC50。根據(jù)殺菌劑對木霉菌菌絲的EC50（TEC50）與該殺菌劑對齊整小核菌的EC50（REC50）比值（VEC50，VEC50=TEC50/REC50）篩選可與木霉菌協(xié)同使用的殺菌劑，若VEC50＞1，認(rèn)為該化學(xué)殺菌劑可與木霉菌協(xié)同使用[17]。

1.2.6 殺菌劑和木霉菌協(xié)同對齊整小核菌菌絲的抑制作用 采用平板對峙法測定與木霉菌相容性好的殺菌劑和木霉菌協(xié)同對齊整小核菌菌絲的抑制作用。用無菌水分別將30%噁霉靈AS 配制濃度為100.00、75.00、66.70 和50.00 μg/mL。80%代森錳鋅WP 的濃度梯度為0.94、0.71、0.63、0.47 μg/mL。240 g/L 噻呋酰胺SC 的濃度為24.00、18.00、16.00 和12.00 μg/mL。在含藥PDA 平板上同時接種直徑為5 mm 木霉菌和齊整小核菌的菌餅，二者間隔3 cm，以只接種齊整小核菌或木霉菌菌餅為對照，3 次重復(fù)。置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3 d，測量二者菌落的相向半徑。采用協(xié)同系數(shù)法[21]評價木霉菌與化學(xué)殺菌劑協(xié)同使用是否產(chǎn)生增效作用。協(xié)同系數(shù)（S）=（病菌對照菌落半徑－病菌拮抗菌落半徑）/（木霉菌對照菌落半徑－木霉菌拮抗菌落半徑）×100。S≥1.5，表示木霉菌和殺菌劑具有增效作用；1≤S＜1.5，表示木霉菌和殺菌劑具有相加作用；S＜1，表示木霉菌和殺菌劑具有拮抗作用。

1.2.7 殺菌劑和木霉菌協(xié)同對北蒼術(shù)白絹病的防治效果 將木霉菌用食用菌玉米粒培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d[22]，待長滿木霉菌后用蒸餾水洗出后用血球計數(shù)板計數(shù)，分生孢子數(shù)量調(diào)整到1×107孢子/mL，備用。

在秦皇島市盧龍縣燕河營鎮(zhèn)旭陽藥材種植園測定北蒼術(shù)白絹病防治效果。該基地種植北蒼術(shù)面積5.47 hm2，移栽2 年生苗，平作，株行距為15 cm×30 cm。該基地前茬種植玉米、白薯、辣椒等農(nóng)作物，調(diào)查該地農(nóng)田白絹病發(fā)生嚴(yán)重，地表20～30 cm 深處的菌核數(shù)可達(dá)5×105～1×107菌核/m2。

試驗小區(qū)分別為木霉菌與殺菌劑協(xié)同作用、殺菌劑單獨應(yīng)用對照、木霉菌單獨應(yīng)用對照和清水對照，每個小區(qū)長150 m，寬3 m，共19 個處理，3 次重復(fù)。協(xié)同作用分別為棘孢木霉T16與噻唑鋅、代森錳鋅、噻呋酰胺和噁霉靈；深綠木霉T15與代森錳鋅、噻呋酰胺和噁霉靈；哈茨木霉T11與噻唑鋅、代森錳鋅、噻呋酰胺和噁霉靈。

殺菌劑協(xié)同作用區(qū)木霉菌用量為37.5 L/hm2，對照區(qū)為75.0 L/hm2；30%噁霉靈AS、30%噻唑鋅SC、80%代森錳鋅WP 和240 g/L 噻呋酰胺SC 的用量在協(xié)同作用區(qū)均為7.5 kg/hm2，對照區(qū)均為15.0 kg/hm2。棘孢木霉T16、深綠木霉T15和哈茨木霉T11采用分生孢子懸浮液，孢子濃度為1×107孢子/mL。于2021年6 月2 日先將殺菌劑滴灌到北蒼術(shù)根際后，再滴施木霉菌孢子懸浮液直到根際土壤濕透，8 月7 日調(diào)查白絹病病情指數(shù)，調(diào)查時采用S 形取樣法，每個處理選取10 個點，每個點調(diào)查50 株，根據(jù)北蒼術(shù)白絹病病情指數(shù)分級標(biāo)準(zhǔn)[9]調(diào)查發(fā)病情況，計算病情指數(shù)和防治效果。

北蒼術(shù)白絹病病情指數(shù)分級標(biāo)準(zhǔn)：0 級，無??；1 級，根莖有輕微變褐；3 級，根莖組織變褐；5 級，根莖開始腐爛，腐爛面積占總面積的30%以下，并出現(xiàn)少量白色菌絲；7 級，腐爛部分占根莖30%以上，地上部植株萎蔫，產(chǎn)生大量菌核；9 級，整株枯死。病情指數(shù)=[∑（病級數(shù)×該病級植株數(shù)）]/（最大病級數(shù)×植株總株數(shù)）×100。防治效果（%）=（對照組病情指數(shù)-處理組病情指數(shù)）/對照組病情指數(shù)×100。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 試驗數(shù)據(jù)使用Excel 2019 和SPSS 24.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，利用LSD 法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉菌對齊整小核菌菌絲和菌核萌發(fā)的抑制效果

棘孢木霉T16菌株對齊整小核菌菌絲的抑菌率最高，為87.52%，其次深綠木霉T15和哈茨木霉T11對齊整小核菌菌絲的抑菌率分別為79.61%和77.67%，三者差異并不顯著。齊整小核菌菌核在深綠木霉T15和棘孢木霉T16中萌發(fā)率均為0，對菌核萌發(fā)后菌絲的抑菌率達(dá)到100%，顯著高于綠色木霉T17和哈茨木霉T11對菌核萌發(fā)后菌絲的抑菌率（表1，圖1）。

表1 木霉菌對齊整小核菌菌絲和菌核萌發(fā)的抑菌率Table 1 Inhibition rate of Trichoderma on mycelia and sclerotinia germination of S.rolfsii

圖1 木霉菌對齊整小核菌菌絲和菌核的抑制作用Fig.1 Inhibition effect of Trichoderma on mycelium and sclerotium of S.rolfsii

2.2 殺菌劑對齊整小核菌和木霉菌的EC50

通過測定比較12 種化學(xué)殺菌劑對齊整小核菌和木霉菌的EC50，噻呋酰胺、代森錳鋅和噁霉靈與棘孢木霉T16、深綠木霉T15和哈茨木霉T11間的生物相容性好，VEC50均大于1；噻唑鋅與棘孢木霉T16、哈茨木霉T11間VEC50均大于1，生物相容性好（表2）。

表2 化學(xué)殺菌劑與木霉菌的生物相容性Table 2 Bio-compatibility between chemicalfungicides and Trichoderma

2.3 化學(xué)殺菌劑與木霉菌協(xié)同對齊整小核菌的抑制作用

2.3.1 殺菌劑與木霉菌協(xié)同增效作用 棘孢木霉T16、深綠木霉T15和哈茨木霉T11與噁霉靈、噻呋酰胺和代森錳鋅協(xié)同應(yīng)用后對齊整小核菌菌絲的抑菌率均達(dá)到100%。噁霉靈、噻呋酰胺與3 種木霉菌間的協(xié)同系數(shù)均大于1，表現(xiàn)出增效作用。代森錳鋅、噻唑鋅與棘孢木霉T16、哈茨木霉T11的協(xié)同系數(shù)均大于1，表現(xiàn)出增效作用（表3）。

表3 殺菌劑與木霉菌對齊整小核菌菌絲的協(xié)同增效作用Table 3 Synergism between Trichoderma and fungicides to inhibit Sclerotium rolfsii mycelium

2.3.2 木霉菌與殺菌劑協(xié)同對北蒼術(shù)白絹病田間防治效果 噻呋酰胺與棘孢木霉T16、深綠木霉T15協(xié)同防治北蒼術(shù)白絹病的效果分別達(dá)到80.76%和78.82%，與噻呋酰胺對照相比，雖然防治效果差異未達(dá)到顯著水平，但防治效果分別增長了13.36%和10.64%；與2 種木霉菌對照的防治效果分別增長了33.47%和77.88%，均顯著高于各木霉菌對照處理。同樣，與代森錳鋅對照相比，代森錳鋅與棘孢木霉T16、深綠木霉T15和哈茨木霉T11協(xié)同防治效果差異并不顯著，但防治效果分別增加了37.12%、30.15%和15.38%（表4）。

表4 木霉菌和殺菌劑協(xié)同對北蒼術(shù)白絹病的田間防治效果Table 4 Synergistic control effect of Trichoderma and fungicide on sclerotium blight of A.rhizome in the field

3 討論

木霉菌的種類、孢子類型等均會影響木霉菌與殺菌劑的協(xié)同應(yīng)用效果。TRS060186 對多菌靈的耐藥性比哈茨木霉TRW079634 強(qiáng)[23]。哈茨木霉可以與五氯硝基苯協(xié)同使用，不能與多菌靈協(xié)同使用；長枝木霉可以與和甲霜靈協(xié)同使用，不能與戊唑醇協(xié)同使用[24]。本文從7 種木霉菌中篩選出了3 種可以與噻呋酰胺、代森錳鋅和噁霉靈均具有相容性的棘孢木霉、深綠木霉和哈茨木霉，可以進(jìn)一步研究菌藥協(xié)同對根腐病、立枯病、猝倒病等病害的防治效果。

同樣，殺菌劑的類型也會影響二者的協(xié)同應(yīng)用效果。己唑醇、丙環(huán)唑和氟菌唑?qū)哪久沟亩拘砸来谓档蚚25]。廣譜性殺菌劑如多菌靈、戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑?qū)哪久?10 的抑制作用比長枝木霉758 弱[24]。?；詺⒕鷦┤缜柘┚?、啶酰菌胺不僅與3 種木霉菌相容性好，聯(lián)合應(yīng)用還提高了對水稻惡苗病菌Fusariumfujikuroi的抑菌率[26]。同樣嘧菌酯和噻唑鋅也能與綠色木霉、長枝木霉和哈茨木霉聯(lián)合抑制水稻紋枯病菌Rhizoctoniasolani，協(xié)同系數(shù)達(dá)到2.47、3.00 和1.85[17]。雙炔酰菌胺分別與棘孢木霉Thz01 和深綠木霉TZ1105 混用后對減少了雙炔酰菌胺用量達(dá)到25%～35%[27]。啶氧菌酯與哈茨木霉聯(lián)合對齊整小核菌菌絲的抑菌率為92.11%，顯著高于啶氧菌酯對照[18]。哈茨木霉SH2303 和苯甲·丙環(huán)唑協(xié)同應(yīng)用后顯著降低了玉米小斑病的病斑面積[28]。本試驗?zāi)久咕甑姆乐涡Ч彩艿綒⒕鷦┑挠绊懀?2 種殺菌劑中代森錳鋅與棘孢木霉T16、深綠木霉T15和哈茨木霉T11均具有協(xié)同增效作用。噻呋酰胺與棘孢木霉T16和深綠木霉T15具有增效作用。噁霉靈只與棘孢木霉T16具有增效作用，但不同殺菌劑與同一種木霉菌間協(xié)同防治效果增長率卻各不相同。

此外，木霉菌與殺菌劑在田間的協(xié)同防治效果也會受到作物種類、施用方法、土壤營養(yǎng)、微生物多樣性、連作年限、病原菌數(shù)量等諸多因素的影響，因此為提高木霉菌與噻呋酰胺對北蒼術(shù)白絹病的防治效果，還需要進(jìn)一步研究這些因素對木霉菌與噻呋酰胺聯(lián)合增效作用的影響。