城市綠地中立枯絲核菌和齊整小核菌的qPCR快速檢測方法

雒淑紅，駱玉珍，趙鶯鶯，張維維,3，劉 文，何山文，安 磊，王永杰，韓繼剛

（1. 上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 200120；2. 上海市園林科學(xué)規(guī)劃研究院，上海 200232；3. 東北大學(xué) 資源與土木工程學(xué)院，遼寧 沈陽 110819）

城市綠地是生態(tài)城市建設(shè)的基礎(chǔ)和重要組成部分[1]。植物病害特別是土傳病害已經(jīng)對綠地生態(tài)系統(tǒng)健康造成了嚴(yán)重威脅[2-3]，由真菌引起的植物病害占全部植物病害的2/3以上[4]，其中土傳植物病原真菌是造成植物病害的主要類群[5]。研究表明：立枯絲核菌Rhizoctonia solani和齊整小核菌Sclerotium rolfsii是上海綠地土壤中最常見的土傳植物病原真菌[6]。立枯絲核菌屬于無孢科Agonomycetaceae絲核菌屬Rhizoctonia[7]，在自然界中廣泛存在，是引起植物根腐和莖腐癥狀的重要病原菌，被認(rèn)為是最具破壞力的土傳植物病原菌之一[8]。海桐Pittosporum tobira、八角金盤Fatsia japonica、高羊茅Festuca arundinacea和女貞Ligustrum lucidum等360個屬的園林綠化植物均能被立枯絲核菌感染[9]。齊整小核菌屬于無孢科小核菌屬Sclerotium[6]，是一種世界性傳播的土傳病原真菌，可以引起植物白絹病，致使植物腐爛死亡[10]。木棉屬Bombax和紫檀屬Pterocarpus植物以及樟樹Cinnamomum camphora和夾竹桃Nerium oleander等園林綠化植物常被齊整小核菌侵染[11]。

土傳病原真菌的傳統(tǒng)檢測方法主要是根據(jù)病原菌形態(tài)特征、選擇性平板計數(shù)等方法進(jìn)行[12-13]，但耗時費力、效率較低，時效性較差，已不能滿足實際工作需求。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，實時熒光定量PCR (qPCR)因具有特異性強、靈敏度高等特點，已經(jīng)越來越多地被應(yīng)用于土傳病原真菌的檢測。目前，已經(jīng)有應(yīng)用該技術(shù)對農(nóng)田土壤中立枯絲核菌和齊整小核菌進(jìn)行定性、定量檢測的報道[14-16]。但是，尚缺乏應(yīng)用qPCR技術(shù)對城市綠地土壤進(jìn)行立枯絲核菌和齊整小核菌定量檢測的研究。與農(nóng)田土壤存在明顯差異，城市綠地土壤異質(zhì)性高，普遍面臨著重金屬和有機(jī)污染物等的威脅[1,17]，因此，針對城市綠地土壤中立枯絲核菌和齊整小核菌，探索建立具有較強特異性、較高靈敏性和較好重復(fù)性的分子生物學(xué)檢測方法，對于及時了解上海城市綠地土壤中立枯絲核菌和齊整小核菌的分布，保障植物和城市綠地生態(tài)系統(tǒng)健康具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

立枯絲核菌和齊整小核菌標(biāo)準(zhǔn)菌株購買于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(Agricultural Culture Collection of China, ACCC)，編號分別為ACCC37615和ACCC37946。菌株的培養(yǎng)參照《絲狀真菌分子細(xì)胞生物學(xué)與實驗技術(shù)》[18]。

1.2 綠地土壤樣品采集

2018年7月，采用多點混合采樣法，在上海市隨機(jī)采集綠地0～20 cm表層土壤樣品。采樣點信息見表1。每個采樣點設(shè)置5個子樣點，每個土壤樣品由5個子樣點樣品混合而成。土壤樣品充分混合后，去除石塊、草根等雜物，-20 ℃保存，用于后續(xù)試驗[17]。

1.3 DNA提取

采用AntGene DNA提取試劑盒 (武漢安特捷生物技術(shù)有限公司)提取立枯絲核菌和齊整小核菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA。采用土壤基因組DNA提取試劑盒(FastDNA spin kit for soil, MP Biomedicals, 美國)提取綠地土壤樣品DNA。使用NanoDrop 2000微量分光光度計(Thermo Fisher Scientific, 美國)測定DNA的吸光度比值D(260)/D(280)及D(260)/D(230)，確定DNA質(zhì)量及濃度，之后于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.4 qPCR引物的篩選及在線特異性驗證

通過文獻(xiàn)檢索，根據(jù)已有報道選擇了ST-RS1/ ITS4、ITS1/GMRS-3等引物進(jìn)行擴(kuò)增立枯絲核菌的特異性引物的篩選，選擇SCR-F/SCR-R、SRITSF/SRITSR等引物進(jìn)行擴(kuò)增齊整小核菌的特異性引物的篩選(表2)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。通過美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)中Primer-BLAST功能將4對引物分別與Non-Redundant Protein Sequence(NR)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對，在線篩選和驗證引物的特異性。

表 1 綠地土壤樣品信息Table 1 Information of green space soil samples

表 2 用于立枯絲核菌和齊整小核菌qPCR的引物信息Table 2 qPCR primer sets of R. solani and S. rolfsii

1.5 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

以2種病原菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA為模板，分別使用篩選的特異性引物對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收目的條帶，使用通用型DNA純化試劑盒[天根生化科技(北京) 有限公司，中國北京]對目的條帶進(jìn)行純化回收。按照pGM-T Fast連接試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司，中國北京]說明書將回收所得片段連接到pGEM-T Easy載體上(Promega, 美國)，轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞中(Promega, 美國)，經(jīng)藍(lán)白斑篩選陽性克隆子，并進(jìn)行菌落PCR驗證后，按照質(zhì)粒抽提試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司，中國北京]說明書進(jìn)行質(zhì)粒抽提，提取所得重組質(zhì)粒送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序。使用NanoDrop 2000 微量分光光度計(Thermo Fisher Scientific, 美國)測定質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度，計算質(zhì)?？截悢?shù)[23]。

1.6 qPCR檢測方法的建立和優(yōu)化

1.6.1 反應(yīng)條件的優(yōu)化 qPCR反應(yīng)體系包含有10 μL GoTaqq-PCR Master Mix (Promega，美國)，DNA模板用量分別設(shè)置為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)分別設(shè)置為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 μL，加無菌重蒸水補足至20 μL。陰性對照使用無菌重蒸水代替DNA模板。使用Roche Light Cycle 480Ⅱ型qPCR儀(羅氏醫(yī)學(xué)儀器公司，瑞士)。qPCR反應(yīng)程序：95 ℃ 預(yù)變性5 min；95 ℃變性 15 s，退火溫度下退火40 s [退火溫度在文獻(xiàn)中引物Tm值(表2)上下浮動3 ℃范圍內(nèi)設(shè)置7個溫度梯度]，72 ℃延伸40 s，45個循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后進(jìn)入熔解曲線程序：65 ℃升溫至95 ℃，隔1 ℃采集熒光信號。

表 3 qPCR引物在線比對結(jié)果Table 3 On-line blast results of qPCR primers

1.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將立枯絲核菌和齊整小核菌質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行10倍梯度稀釋，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度范圍為108～101(×106拷貝·L-1)，分別得到8個稀釋濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品模板，使用1.6.1中優(yōu)化后的qPCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 方法特異性評價

以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和綠地土壤樣品DNA為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，通過熔解曲線判斷qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物是否單一。qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物利用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%瓊脂糖凝膠電泳(110 V, 40 min)檢測，通過紫外凝膠成像系統(tǒng)對電泳條帶進(jìn)行觀察和分析。將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和土壤樣品擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行克隆測序，并利用NCBI數(shù)據(jù)庫對質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和土壤樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果進(jìn)行序列比對。

1.8 方法靈敏性評價

分別將2種病原真菌的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋，從108×106拷貝·L-1稀釋至101×106拷貝·L-1，取稀釋好的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，按照1.6中優(yōu)化后的qPCR條件進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)試驗結(jié)果確定方法的最低檢測限，驗證此方法的靈敏性。

1.9 方法重復(fù)性評價

隨機(jī)選擇5個不同類型綠地土壤樣品DNA作為模板，按照1.6中優(yōu)化后的方法進(jìn)行立枯絲核菌和齊整小核菌qPCR擴(kuò)增，每個反應(yīng)重復(fù)2次。隨后根據(jù)每個樣品組內(nèi)重復(fù)間拷貝數(shù)的變異系數(shù)，驗證方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.10 上海綠地土壤中立枯絲核菌和齊整小核菌的定量檢測

采用1.6中優(yōu)化后的qPCR方法對21份上海綠地土壤樣品進(jìn)行立枯絲核菌和齊整小核菌定量檢測，每個反應(yīng)設(shè)置3個平行試驗，計算土壤樣品中病原菌ITS基因的拷貝數(shù)，y=c×n×v/s。其中：y為基因拷貝數(shù)(拷貝·g-1)，c為濃度(×106拷貝·L-1)，n為模板稀釋倍數(shù)，v為DNA洗脫體積(μL)，s為土壤干質(zhì)量(g)。

1.11 數(shù)據(jù)處理

運用Excel 2016軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 qPCR引物的篩選及NCBI在線特異性驗證

使用NCBI中Primer-BLAST功能將表2的4對引物分別與NR數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對。結(jié)果顯示：引物ST-RS1/ITS4和ITS1/GMRS-3均可有效匹配目的序列900余條，錯配率分別為7.7%和6.3%，在理論上均可實現(xiàn)對立枯絲核菌種水平特異性擴(kuò)增(表3)。與引物ITS1/GMRS-3相比，引物ST-RS1/ITS4擴(kuò)增目的片段長度小于200 bp，更適用于在qPCR方法中的應(yīng)用，因此，本研究僅保留引物ST-RS1/ITS4用于后續(xù)立枯絲核菌定量檢測方法的建立。引物SRITSF/SRITSR可有效匹配目的序列429條，錯配率為8.1%，理論上可以實現(xiàn)對齊整小核菌種水平特異性擴(kuò)增，而引物SCR-F/SCR-R僅匹配30條目的序列，覆蓋率相對低于引物SRITSF/SRITSR，且該引物錯配率較高，因此，本研究僅保留引物SRITSF/SRITSR用于后續(xù)齊整小核菌定量檢測方法的建立(表3)。

2.2 qPCR檢測方法的建立和優(yōu)化

2.2.1 反應(yīng)條件的優(yōu)化 以2種病原菌質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行qPCR反應(yīng)條件的優(yōu)化。結(jié)果表明：引物ST-RS1/ITS4最佳退火溫度為60 ℃，引物SRITSF/SRITSR最佳退火溫度為52 ℃。在上述退火溫度下，2種病原菌qPCR擴(kuò)增效率最高。因此，最終確定立枯絲核菌qPCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，45個循環(huán)。齊整小核菌qPCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，45個循環(huán)。

2種 病 原 菌qPCR反 應(yīng) 體 系 中 最 適 引 物 用 量 均 為0.3 μL (10 μmol·L-1)，DNA模 板 用 量 均 為2 μL (10 mg·L-1)，在該反應(yīng)條件下熒光信號最強。因此，最終確定2種病原菌qPCR反應(yīng)體系(20 μL)為：模板2 μL(10 mg·L-1)，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.3 μL，GoTaq?q-PCR Master Mix (Promega，美國)10 μL，無菌重蒸水7.4 μL。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以10倍梯度稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，使用2.2.1優(yōu)化后的qPCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。立枯絲核菌標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系表達(dá)式為y=-3.319x+33.98 (y為Ct值，x為模板量)，決定系數(shù)(R2)為0.999 5，擴(kuò)增效率為100.1%。齊整小核菌標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系表達(dá)式為y=-3.552x+33.65 (y為Ct值，x為模板量)，決定系數(shù)(R2)為0.997 9，擴(kuò)增效率為91.2%。結(jié)果表明：2種病原菌qPCR 的Ct值與質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)均具有良好的線性關(guān)系，擴(kuò)增效率符合qPCR定量檢測方法的要求，表明本研究建立的2種病原菌定量檢測方法具有較高的準(zhǔn)確度和有效性，可作為立枯絲核菌和齊整小核菌快速定量檢測的方法。對立枯絲核菌的線性檢測范圍為2.42×101～2.42×108(×106拷貝·L-1)，對齊整小核菌的線性檢測范圍為2.20×101～2.20×108(×106拷貝·L-1)。

2.3 方法特異性評價

以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和綠地土壤樣品DNA為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示：熔解曲線均為單一熔解峰，無雜峰，表明qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物單一且未產(chǎn)生引物二聚體。qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示：引物ST-RS1/ITS4擴(kuò)增得到約200 bp的片段，引物SRITSF/SRITSR擴(kuò)增得到約450 bp的片段，均與目的片段大小一致(圖1)。利用NCBI數(shù)據(jù)庫對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆測序的結(jié)果進(jìn)行序列比對，結(jié)果見表4。采用引物ST-RS1/ITS4從質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品及土壤樣品擴(kuò)增到的產(chǎn)物分別與立枯絲核菌R. solaniBTRFB1(登錄號: MZ158299)和R. solaniAG-F(登錄號：JQ343829)序列相似度最高，相似度為99.4%。采用引物SRITSF/SRITSR從質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品及土壤樣品擴(kuò)增到的產(chǎn)物分別與齊整小核菌S. rolfsiiNTNM(登錄號: MT126473)和S. rolfsiiSR1(登錄號: MG847186)序列相似度最高，分別為99.5%和98.8%。擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果說明：利用引物ST-RS1/ITS4和SRITSF/SRITSR擴(kuò)增到的DNA序列均與目的片段序列一致，具有較強的特異性。

表 4 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和土壤樣品測序比對結(jié)果Table 4 Sequencing alignment result of plasmid standard and soil sample

圖 1 立枯絲核菌和齊整小核菌 DNA的PCR擴(kuò)增Figure 1 PCR amplification of R. solani and S. rolfsii DNA

2.4 方法靈敏性評價

以10倍梯度稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，使用2.2.1優(yōu)化后的qPCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)行qPCR靈敏性驗證。結(jié)果顯示：本研究建立的qPCR定量檢測方法對立枯絲核菌和齊整小核菌的檢測限分別可達(dá)24×106和22×106拷貝·L-1(圖2)。

圖 2 qPCR的靈敏性Figure 2 Sensitivity test of qPCR

2.5 方法重復(fù)性評價

隨機(jī)選擇5個綠地土壤樣品DNA作為模板，使用本研究建立的方法對樣品中立枯絲核菌和齊整小核菌ITS基因拷貝數(shù)進(jìn)行測定。結(jié)果表明：綠地土壤樣品立枯絲核菌和齊整小核菌ITS基因拷貝數(shù)2次檢測結(jié)果的變異系數(shù)范圍分別為3.37%～4.61%和0.66%～8.61%(表5)，變異系數(shù)均低于10%，表明本研究建立的立枯絲核菌和齊整小核菌定量檢測方法具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

表 5 qPCR的重復(fù)性Table 5 Repeatability of qPCR

2.6 上海綠地土壤中立枯絲核菌和齊整小核菌的定量檢測

將本研究建立的立枯絲核菌和齊整小核菌定量檢測方法應(yīng)用于上海綠地土壤樣品的檢測。檢測結(jié)果表明：立枯絲核菌的檢出率為100%， ITS基因拷貝數(shù)最高為2.61×106拷貝·g-1；齊整小核菌的檢出率為19%，檢出樣品的ITS基因拷貝數(shù)最高為2.94×105拷貝·g-1。說明立枯絲核菌在上海綠地表層土壤中廣泛存在。

3 討論

引物的特異性是對土傳病原真菌進(jìn)行qPCR檢測的關(guān)鍵[24]。真菌ITS序列目前已被廣泛用于真菌的親緣關(guān)系分析，為病原菌的分子檢測提供了較為理想的分子標(biāo)記[25]。本研究通過檢索文獻(xiàn)[19,22]及數(shù)據(jù)庫，篩選得到了基于真菌ITS區(qū)域設(shè)計的立枯絲核菌和齊整小核菌種水平特異性引物ST-RS1/ITS4和SRITSF/SRITSR。NCBI NR數(shù)據(jù)庫在線比對結(jié)果顯示：ST-RS1/ITS4和SRITSF/SRITSR目的片段錯配率分別為7.7%和8.1%，理論上可實現(xiàn)對立枯絲核菌和齊整小核菌種水平特異性擴(kuò)增；同時，qPCR熔解曲線均為單一熔解峰，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小與序列均與目的片段一致。上述結(jié)果均表明：本研究建立的立枯絲核菌和齊整小核菌熒光定量檢測方法具有較強的特異性。此外，qPCR檢測方法的靈敏性是評價其是否可行的另一個關(guān)鍵因素，一般是指可以準(zhǔn)確測量的樣品最小拷貝數(shù)[26]。前人的研究表明：對農(nóng)田土壤立枯絲核菌和大豆莖褐腐病菌Phialophora gregata等土傳病原菌qPCR檢測的靈敏性可以達(dá)26.7～100.0 (×106拷貝·L-1)[13,27-28]。本研究針對立枯絲核菌和齊整小核菌檢測限分別可達(dá)24×106和22×106拷貝·L-1，具有較高的靈敏性。因此，本研究所建立的qPCR檢測方法可以用于城市綠地土壤中立枯絲核菌和齊整小核菌的定量檢測。

立枯絲核菌和齊整小核菌是寄主范圍廣、危害性強的土傳病原真菌，可侵染一些重要經(jīng)濟(jì)植物，例如水稻Oryza sativa、花生Arachis hypogaea、樟樹和海桐等，造成植物根腐病和白絹病等病害的發(fā)生[7,10]。鑒于這2種病原菌分布的廣泛性，因此有必要了解其在城市綠地土壤中的分布情況，從而有效預(yù)防園林植物立枯病、根腐病和白絹病等病害的發(fā)生。本研究中上海綠地表層土壤立枯絲核菌的檢出率達(dá)100%，表明立枯絲核菌在上海綠地土壤中廣泛存在。齊整小核菌檢出率較低，為19%。齊整小核菌檢出率低，可能有兩方面的原因。一方面，隨著對城市綠地養(yǎng)護(hù)技術(shù)和措施的不斷提高和加強，齊整小核菌在土壤中的存在范圍可能縮小了；另一方面，也可能是由于采樣點的局限性，還不足以反映上海綠地土壤中齊整小核菌整體的存在情況，后期需要通過擴(kuò)大綠地土壤樣品采集范圍，更為全面地檢測齊整小核菌在上海綠地土壤中的分布情況。同時應(yīng)該看到，應(yīng)用qPCR方法檢測土壤中病原菌的數(shù)量時，并不能有效區(qū)分活體和死體病原菌的DNA，檢測結(jié)果可能會過高估計土壤中病原菌基因的豐度[29]。因此，如何準(zhǔn)確、快速測定城市綠地土壤中活體立枯絲核菌和齊整小核菌基因的豐度，尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究通過立枯絲核菌和齊整小核菌qPCR引物的篩選和特異性驗證、qPCR反應(yīng)條件的建立及靈敏性和重復(fù)性評價，建立了針對立枯絲核菌和齊整小核菌的快速、特異且靈敏性較高的qPCR檢測方法，可用于城市綠地土壤中這2種病原菌的定量檢測。