黃曲霉毒素B1高靈敏定性定量免疫層析檢測(cè)方法的建立

章 先，王繼璇，程高釧，李 可，張曉峰，孫孟嬌，程昌勇，宋厚輝

（1. 浙江大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310058；2. 浙江農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院/動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 311300；3. 浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，浙江 杭州 311202；4. 浙江大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，浙江 杭州 310058）

黃曲霉毒素(aflatoxins, AFs)主要是由黃曲霉Aspergillus flavus和寄生曲霉Aspergillus parasiticus產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝物，可通過污染食品和飼料進(jìn)入食物鏈，嚴(yán)重威脅動(dòng)物和人類健康[1]。目前，國(guó)內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)超20種AFs，其中黃曲霉毒素B1(AFB1)毒性最強(qiáng)，危害最大，已被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)列為Ⅰ類致癌物[2-4]。AFB1具有強(qiáng)烈的“致突變、致癌和致畸作用”和免疫毒性，過量攝入可破壞人和動(dòng)物的肝臟組織，引發(fā)急性中毒，長(zhǎng)期攝入則會(huì)引發(fā)各組織器官癌變[5-6]。建立快速、高靈敏的AFB1檢測(cè)方法對(duì)于保障食品安全具有重要意義。在AFB1檢測(cè)手段中，儀器法如高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)等雖靈敏度高，準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性較好，但設(shè)備耗材昂貴且操作繁瑣，難以用于樣本的初篩和在基層使用[7-10]；相比儀器分析法，基于抗原抗體反應(yīng)的免疫分析法因操作簡(jiǎn)單、靈敏度高且特異性好，在真菌毒素檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用較廣，特別是免疫層析法，省時(shí)高效且無需借助復(fù)雜儀器，尤其適合大量樣本的現(xiàn)場(chǎng)篩查[11-16]。本研究基于免疫層析技術(shù)原理，采用金顆粒標(biāo)記AFB1單克隆抗體，在競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)模式下，優(yōu)化金顆粒尺寸、層析體系各組成材料及相關(guān)緩沖液配方，最終建立AFB1高靈敏定性定量免疫層析檢測(cè)法，通過肉眼直接對(duì)檢測(cè)結(jié)果定性判定，或借助便攜式信號(hào)讀取設(shè)備實(shí)現(xiàn)定量分析，以滿足對(duì)AFB1污染情況快速篩查的檢測(cè)需求。

1 材料與方法

1.1 材料

牛血清白蛋白(BSA)、卵白蛋白(OVA)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、羧甲基羥胺半鹽酸鹽(CMO)、N,N-二環(huán)已基碳二亞胺(DCC)、二甲基亞砜(DMSO)、各真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司；AFB1單克隆抗體(Anti-AFB1)、硝酸纖維素膜和玻璃纖維等免疫層析耗材購自奧唯生物；黃曲霉毒素B1商品化檢測(cè)試劑盒購自無錫景麒生物；其他試劑購自上海國(guó)藥；谷物樣本由浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院提供。

1.2 AFB1完全抗原的制備與鑒定

選取不同載體蛋白(BSA和OVA)制備AFB1完全抗原。步驟：AFB1標(biāo)準(zhǔn)品(2 mg)溶解于甲醇-吡啶溶液(體積比1∶1)，加入5 mg CMO震蕩至完全溶解，70 ℃下攪拌活化2 h；活化產(chǎn)物自然干燥后，加入1 mL蒸餾水并使用氫氧化鈉溶液(1 mol·L-1)調(diào)pH至8.0，為去除體系中未反應(yīng)的AFB1，使用5 mL苯溶液抽提3次，pH調(diào)至3.0 (0.2 mol·L-1鹽酸)，產(chǎn)物經(jīng)5 mL乙酸乙酯抽提3次后干燥得到AFB1肟化物AFB1O；所得AFB1O溶解于2 mL二甲基甲酰胺(DMF)，分別加入DCC (8.9 mg)和NHS(5.0 mg)室溫?cái)嚢杌罨? h；BSA (14.0 mg)或OVA (9.3 mg)溶解于1 mL碳酸氫鈉溶液(0.1 mol·L-1，pH 9.5)，將上一步所得的AFB1O活化產(chǎn)物緩慢滴加至載體蛋白溶液，室溫混勻反應(yīng)2 h；反應(yīng)結(jié)束后在磷酸鹽緩沖液(0.01 mol·L-1，pH 7.4)中4 ℃透析72 h，每12 h換液，產(chǎn)物即為AFB1完全抗原，經(jīng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)法(ELISA)鑒定后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 金顆粒的制備與鑒定

采用檸檬酸鈉還原法分別制備不同粒徑的金顆粒(20和40 nm)用于單克隆抗體的標(biāo)記[17]。具體步驟：250 mL三角燒瓶(在濃硫酸-重鉻酸鉀溶液中浸泡并使用去離子水沖洗干凈)置于磁力攪拌加熱器，加入100 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%氯金酸溶液加熱至沸騰，迅速加入0.750或0.375 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的檸檬酸鈉溶液分別制備20和40 nm粒徑的金顆粒，攪拌加熱至混合液顏色至酒紅色，調(diào)低功率繼續(xù)加熱5 min，室溫自然冷卻后即得到金顆粒溶液，采用目測(cè)法和透射電鏡掃描鑒定后備用。

1.4 金顆粒標(biāo)記單克隆抗體的制備

金顆粒標(biāo)記抗體最佳pH和抗體標(biāo)記最佳結(jié)合質(zhì)量濃度參考文獻(xiàn)[18]。金顆粒標(biāo)記抗體步驟：使用10 mmol·L-1Tris-HCL溶液(pH 7.4)稀釋單克隆抗體Anti-AFB1至最佳結(jié)合質(zhì)量濃度，金顆粒溶液經(jīng)0.2 mol·L-1碳酸鉀調(diào)節(jié)至抗體標(biāo)記最佳pH；取50 mL已調(diào)節(jié)pH的金顆粒溶液，邊攪拌邊加入待標(biāo)記抗體，室溫混勻30 min；反應(yīng)結(jié)束后加入BSA溶液(終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%)，混勻30 min后4 ℃ 2 000g離心30 min，棄沉淀；上清8 000g離心30 min，將所得沉淀重懸于10 mL 2 mmol·L-1含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%BSA的硼酸鹽緩沖液(pH 7.4)，8 000g離心20 min去除未結(jié)合的抗體，重復(fù)2次；所得沉淀溶解于5 mL硼酸鹽緩沖液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 定性定量免疫層析檢測(cè)法原理

定性定量免疫層析檢測(cè)法如圖1所示。檢測(cè)線包被AFB1完全抗原，質(zhì)控線包被山羊抗鼠二抗，金顆粒標(biāo)記的Anti-AFB1固定于金標(biāo)墊。滴加待檢樣品，經(jīng)層析作用后，可通過肉眼觀察檢測(cè)線與質(zhì)控線顏色差異進(jìn)行定性判定或經(jīng)便攜式信號(hào)讀取儀檢測(cè)線信號(hào)值進(jìn)行定量分析。

圖 1 黃曲霉毒素B1定性定量免疫層析檢測(cè)法示意圖Figure 1 Schematic diagram of the qualitative and quantitative immunochromatographic assay for the detection of aflatoxin B1

1.6 定性定量免疫層析檢測(cè)體系的優(yōu)化

免疫層析法檢測(cè)效果受多種參數(shù)影響，如標(biāo)記抗體所用金顆粒粒徑、檢測(cè)線包被抗原類型、層析各組分材料品種(包括硝酸纖維素膜、金標(biāo)抗體固定墊和樣品墊)和各組分材料前處理液的類型和濃度[19-21]。優(yōu)化策略：采用不同粒徑金顆粒標(biāo)記單克隆抗體，評(píng)價(jià)穩(wěn)定性和敏感性，選取最優(yōu)；對(duì)不同硝酸纖維素膜(Millipore 135、Millipore 180、Pall 170和Sartorius CN 140)、金標(biāo)抗體固定墊(Ahlstrom 8964、Ahlstrom 6613、國(guó)產(chǎn)GF06和國(guó)產(chǎn)GF08)和樣品墊(國(guó)產(chǎn)SB08和SB06)層析效果進(jìn)行比較；以金標(biāo)抗體穩(wěn)定性和檢測(cè)效果為標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)化金標(biāo)抗體保存液、抗原包被液、金標(biāo)抗體固定墊和樣品墊前處理液的最佳配方與濃度；確定樣本萃取液稀釋倍數(shù)，在消除基質(zhì)影響的同時(shí)，獲得最佳檢測(cè)靈敏度。上述各參數(shù)優(yōu)化均參考文獻(xiàn)[22]進(jìn)行。

1.7 定性定量免疫層析檢測(cè)方法的建立

優(yōu)化處理后的樣品墊、金標(biāo)固定墊、硝酸纖維素膜和吸水板按圖2所示粘貼于PVC底板，相鄰部分依次重疊，壓實(shí)并切割成條(寬0.5 cm)。取100 μL梯度質(zhì)量濃度的AFB1標(biāo)準(zhǔn)液滴至加樣孔，15 min后判定檢測(cè)結(jié)果。

圖 2 免疫層析體系各組分組成結(jié)構(gòu)示意圖Figure 2 Sketch map of the immunochromatographic system

1.8 樣本萃取與加標(biāo)試驗(yàn)

樣本萃取：取待檢樣本5 g置于250 mL三角燒瓶，分別加入1 g氯化鈉和25 mL甲醇-水溶液(體積比7∶3)，劇烈震蕩15 min，4 000g離心5 min后過濾，所得萃取液經(jīng)超純水稀釋后待檢。樣本加標(biāo)：陰性樣本烘干后研磨過篩，加入AFB1標(biāo)準(zhǔn)品溶液，充分混勻后，室溫過夜放置后待檢。

1.9 免疫層析檢測(cè)法穩(wěn)定性試驗(yàn)

采用37 ℃加速試驗(yàn)判定穩(wěn)定性[18]。組裝密封好的試紙條置于37 ℃恒溫箱，不同天數(shù)(7、15、30 d)后取出，對(duì)其檢測(cè)靈敏度進(jìn)行評(píng)價(jià)，預(yù)測(cè)常溫儲(chǔ)存保存期。

1.10 免疫層析檢測(cè)法與LC-MS/MS比較試驗(yàn)

采用免疫層析檢測(cè)法、商品化檢測(cè)試劑盒和LC-MS/MS平行檢測(cè)天然AFB1陽性樣本，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果的一致性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFB1完全抗原的鑒定

采用AFB1單克隆抗體對(duì)AFB1-BSA/OVA進(jìn)行ELISA鑒定，結(jié)果如圖3所示，完全抗原組D(450)與對(duì)照比值(BSA/OVA)遠(yuǎn)大于2.1，表明制備成功，可用于免疫學(xué)方法的建立。

2.2 金顆粒的鑒定

制備的金顆粒溶液顏色澄清鮮艷，40 nm金顆粒溶液顏色較20 nm深，無顆粒沉淀(圖4A)，透射電鏡掃描結(jié)果顯示顆粒粒徑與預(yù)期相符，尺寸均勻(圖4B)，可用于后續(xù)抗體的標(biāo)記。

圖 3 AFB1完全抗原AFB1-BSA和AFB1-OVA的ELISA鑒定Figure 3 Absorbance of the AFB1 conjugates by indirect ELISA using their specific monoclonal antibodies

圖 4 目測(cè)法(A)和透射電鏡(B)對(duì)金顆粒的鑒定Figure 4 Colloidal solution of 20 nm and 40 nm diameter gold nanoparticles by visualization by naked eye (A) and images from TEM (B)

2.3 定性定量免疫層析檢測(cè)法相關(guān)條件的確定

2.3.1 不同粒徑金顆粒標(biāo)記單克隆抗體效果評(píng)價(jià) 40和20 nm金顆粒標(biāo)記物層析效果相當(dāng)，但4 ℃儲(chǔ)存時(shí)前者性質(zhì)更穩(wěn)定，可保存4周，因此綜合考慮靈敏度和穩(wěn)定性，后續(xù)試驗(yàn)將采用40 nm金顆粒進(jìn)行單克隆抗體的標(biāo)記。

2.3.2 檢測(cè)線包被抗原的選擇 包被AFB1-BSA時(shí)，檢測(cè)線顯色清晰且靈敏度更好，后續(xù)試驗(yàn)將采用AFB1-BSA作為檢測(cè)線包被抗原。

2.3.3 層析各組分材料種類和處理液的確定 層析組分材料會(huì)影響層析靈敏度、時(shí)間和穩(wěn)定性。對(duì)各組分材料進(jìn)行篩選，硝酸纖維素膜的比較結(jié)果顯示：Sartorius CN 140相較于其他，流動(dòng)性更佳且檢測(cè)線不易彌散，層析15 min后即可判定結(jié)果，背景值低，為最優(yōu)，封閉液為含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%吐溫20(Tween-20)、1%聚乙二醇2000 (PEG 2000)、2%BSA和0.01%疊氮鈉(NaN3)的10 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH 7.4，PBS)；金標(biāo)抗體固定墊的比較結(jié)果顯示：Ahlstrom 8 964上固定的金標(biāo)抗體可在15 min內(nèi)釋放完全且無聚沉，為最優(yōu)，處理液為含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%蔗糖、1%BSA和0.25%表面活性劑TritonX-100的50 mmol·L-1硼酸鹽緩沖液(pH 7.4，BB)；樣品墊的比較結(jié)果顯示：國(guó)產(chǎn)SB08對(duì)含甲醇、纖維素和蛋白質(zhì)的樣本承載能力和緩沖能力更強(qiáng)，為最優(yōu)，前處理液種類與金標(biāo)固定墊相同。

2.3.4 金標(biāo)抗體儲(chǔ)存稀釋液以及抗原包被液的確定 對(duì)含不同質(zhì)量濃度海藻糖、NaN3和OVA的10mmol·L-1硼酸鹽緩沖液(pH 7.4，BB)在4 ℃條件下對(duì)金標(biāo)抗體的儲(chǔ)存和稀釋效果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示：在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%海藻糖、1% BSA的條件下，金標(biāo)抗體復(fù)溶效果較好且可穩(wěn)定保存30 d，最終確定金標(biāo)抗體存儲(chǔ)稀釋液為含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%海藻糖、1%BSA和0.05%NaN3的10 mmol·L-1的硼酸鹽緩沖液(pH 7.4，BB)。抗原包被液優(yōu)化結(jié)果顯示：含體積分?jǐn)?shù)為3%甲醇的10 mol·L-1硼酸鹽緩沖液(pH 9.0，BB)可使檢測(cè)線顏色更加均勻和清晰。

2.3.5 金標(biāo)抗體和包被抗原質(zhì)量濃度的確定 為獲得最佳的檢測(cè)效果，對(duì)完全抗原包被質(zhì)量濃度和金標(biāo)抗體的使用質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化，最終確定AFB1-BSA的包被質(zhì)量濃度為0.4 g·L-1，10倍稀釋后的金標(biāo)AFB1單克隆抗體噴涂量為20 μL·cm-2。

2.4 定性定量免疫層析法的檢測(cè)限與特異性

2.4.1 定性定量免疫層析檢測(cè)法靈敏度的確定 如圖5所示：與對(duì)照相比，隨著AFB1質(zhì)量濃度的升高，檢測(cè)線逐漸變淺直至消失，肉眼條件下，使檢測(cè)線質(zhì)量濃度發(fā)生明顯變化的最低標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度即為檢測(cè)限，因此，本免疫層析法的檢測(cè)限為0.10 μg·L-1。配制系列梯度質(zhì)量濃度的AFB1標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行檢測(cè)，層析結(jié)束后使用便攜式信號(hào)讀取儀分析檢測(cè)線信號(hào)強(qiáng)度。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，檢測(cè)線信號(hào)強(qiáng)度抑制率(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，進(jìn)行線性回歸分析(圖6)，線性方程為y=0.631 9x+1.159 1，R2=0.984 3，定量區(qū)間為0.03～0.27 μg·L-1，檢測(cè)下限為0.02 μg·L-1。

圖 5 免疫層析法對(duì)黃曲霉毒素B1的定性檢測(cè)限Figure 5 Detection limits of immunochromatographic assay for aflatoxin B1

圖 6 免疫層析法對(duì)黃曲霉毒素B1的抑制曲線(A)和定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(B)Figure 6 Tri-parametric curve fitting of log concentration of aflatoxin B1 vs inhibition rate by immunochromatographic assay (A) and the calibration curve for quantification of aflatoxin B1 (B)

2.4.2 定性定量免疫層析檢測(cè)法交叉反應(yīng)性的確定 以谷物類樣本中其他常見真菌毒素如赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、伏馬毒素B1(FB1)和嘔吐毒素(DON)作為競(jìng)爭(zhēng)抗原，進(jìn)行特異性驗(yàn)證，結(jié)果如圖7所示，建立的免疫層析檢測(cè)法對(duì)上述毒素均不存在交叉反應(yīng)，特異性較好，質(zhì)量濃度均為5.00 μg·L-1。

2.4.3 定性定量免疫層析檢測(cè)法對(duì)加標(biāo)樣本的檢測(cè) 如圖8所示：對(duì)玉米Zea mays樣本進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，當(dāng)AFB1加標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5 μg·kg-1可使檢測(cè)線變化明顯，說明該免疫層析檢測(cè)法在實(shí)際樣本中的定性檢測(cè)限為2.5 μg·kg-1。

圖 7 定性定量免疫層析法對(duì)其他真菌毒素的交叉反應(yīng)性Figure 7 Cross-reactivities of the qualitative and quantitative immunochromatographic assay for different mycotoxins

圖 8 免疫層析法對(duì)黃曲霉毒素B1加標(biāo)樣本的定性檢測(cè)Figure 8 Qualitative detection of aflatoxin B1 spiked samples by immunochromatography

當(dāng)AFB1加標(biāo)質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為1.0、2.5、5.0和15.0 μg·kg-1時(shí)，如表1所示，該免疫層析法在玉米樣本中的加標(biāo)回收率為89.62%～110.43%，批內(nèi)變異系數(shù)為4.51%～6.58%，批間變異系數(shù)為7.28%～9.72%，說明該方法準(zhǔn)確率較高且穩(wěn)定性較好。

2.5 定性定量免疫層析檢測(cè)法穩(wěn)定性驗(yàn)證

37 ℃加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：建立的免疫層析試紙條放置30 d后仍能對(duì)AFB1進(jìn)行定性檢測(cè)與定量分析，靈敏度未受影響，表明穩(wěn)定性良好，推測(cè)室溫可穩(wěn)定保存1 a。

表 1 免疫層析法對(duì)黃曲霉毒素B1加標(biāo)樣本的定量檢測(cè)Table 1 Quantitative detection of aflatoxin B1 spiked samples by immunochromatography assay

2.6 免疫層析檢測(cè)法與LC-MS/MS結(jié)果的比對(duì)

如表2和圖9所示：免疫層析法檢測(cè)結(jié)果與LC-MS/MS的相關(guān)性一致性較好(R2=0.863 1)，與商品化試劑盒的檢測(cè)結(jié)果經(jīng)SPSS軟件分析，同樣顯示顯著相關(guān)(P＜0.01)。綜上表明：本研究建立的免疫層析檢測(cè)法可適用于實(shí)際樣本中AFB1的快速定量檢測(cè)與分析。

圖 9 免疫層析法與LC-MS/MS定量結(jié)果相關(guān)性分析Figure 9 Correlation of results obtained by immunochromatography assay and LC-MS/MS for AFB1 detection in natural samples

表 2 免疫層析法、商品化試劑盒和LC/MS/MS對(duì)天然樣本中黃曲霉毒素B1的定量檢測(cè)結(jié)果Table 2 Quantitative detection of AFB1 in natural samples by the developed immunochromatography assay, commercial ELISA kit and LC-MS/MS

3 結(jié)論與討論

常規(guī)免疫層析檢測(cè)法采用膠體金顆粒作為抗體標(biāo)記物，通過在檢測(cè)線和質(zhì)控線形成明顯的顏色反應(yīng)，因此金顆粒粒徑對(duì)抗體標(biāo)記效率和檢測(cè)靈敏度影響較大。本研究中，40 nm金顆粒標(biāo)記AFB1單克隆抗體后，與20 nm相比，雖在檢測(cè)靈敏度上無明顯優(yōu)勢(shì)，但穩(wěn)定性更佳，故確定為最終的抗體標(biāo)記物。作為免疫層析系統(tǒng)的重要組成部分，不同類型硝酸纖維素膜、金標(biāo)抗體固定墊和樣品墊，會(huì)直接影響檢測(cè)效果[21]。本研究經(jīng)對(duì)比，選用Sartorius CN 140、聚酯膜Ahlstrom 8964和玻璃纖維SB08分別作為硝酸纖維素膜、金標(biāo)抗體固定墊和樣品墊使用。層析體系中各緩沖液的種類和質(zhì)量濃度同樣影響檢測(cè)效果，如檢測(cè)線或質(zhì)控線信號(hào)強(qiáng)度和清晰度、金標(biāo)抗體釋放效率和穩(wěn)定性以及樣本在硝酸纖維素膜上的遷移速率等[23-24]，并且適量質(zhì)量分?jǐn)?shù)蔗糖/海藻糖、BSA、PEG 2000、NaN3以及表面活性劑TritonX-100或Tween-20的加入有助于獲得更好的檢測(cè)效果和穩(wěn)定性[23-26]。本研究制備的AFB1免疫層析檢測(cè)法在實(shí)際樣本中的定性和定量檢測(cè)限分別為2.5和0.5 μg·kg-1，滿足谷物及飼料中AFB1快速定性檢測(cè)和定量分析需求。相比ELISA，該定性定量免疫層析法更加簡(jiǎn)單快速且成本低，適用于大量樣本的快速初篩，樣本結(jié)果疑似陽性再選用儀器法進(jìn)行確認(rèn)分析，可大大提升檢測(cè)效率。