種子呼吸檢測方法及其應(yīng)用研究進(jìn)展

高 璐，李香格，祁亨年，臧 影，賈良權(quán)，趙光武，唐琦哲，鄭 雯,

（1. 湖州師范學(xué)院 信息工程學(xué)院，浙江 湖州 313000；2. 浙江農(nóng)林大學(xué) 現(xiàn)代農(nóng)學(xué)院，浙江 杭州 311300）

種子的呼吸作用是指在酶的參與下將種子本身的儲藏物質(zhì)進(jìn)行一系列的氧化分解，同時釋放二氧化碳、水以及能量的過程，是種子萌發(fā)過程中不可或缺的能量來源，其變化會直接影響種子的生理現(xiàn)象。種子的呼吸強(qiáng)度又稱呼吸速率是衡量其呼吸作用強(qiáng)弱的重要生理指標(biāo)[1]，反映了種子的活力與代謝等生理現(xiàn)象的強(qiáng)弱，與種子的儲藏存在密切關(guān)系。呼吸代謝途徑的順利啟動是種子萌發(fā)并健康成長為幼苗的關(guān)鍵因素，對植物的后續(xù)生長發(fā)育具有重要影響。儲藏過程中種子的呼吸作用會改變種子的質(zhì)量和品質(zhì)，影響種子活力，能否控制好種子呼吸是關(guān)系種子儲藏成敗的主要問題[2]，因此，對種子呼吸過程進(jìn)行精準(zhǔn)檢測十分必要。本研究對種子呼吸檢測方法及其原理進(jìn)行了綜述，分析了各種檢測方法的優(yōu)點(diǎn)與存在的問題，討論了種子呼吸檢測方法在種子呼吸代謝、種子儲藏和種子活力等方面的研究與應(yīng)用。

1 種子呼吸檢測方法

呼吸強(qiáng)度是種子生命活動最重要的指標(biāo)之一，有效檢測種子呼吸強(qiáng)度是研究種子呼吸作用的重要前提。種子呼吸消耗氧氣(O2)，釋放二氧化碳(CO2)，所以氧氣消耗量或者CO2釋放量可以在一定程度上反映種子的呼吸強(qiáng)度。檢測種子呼吸耗氧量的方法有瓦氏微量法、Clark氧電極法和氧傳感技術(shù)檢測法(Q2技術(shù))等；檢測種子呼吸CO2釋放量的方法有小籃子法、紅外線CO2分析儀法和可調(diào)諧二極管激光吸收光譜(TDLAS)技術(shù)檢測法等。種子呼吸檢測方法向著檢測速度快、效率高、重現(xiàn)性好的方向發(fā)展，并將成為研究熱點(diǎn)。

1.1 小籃子法

小籃子法主要通過測量種子在密閉容器中呼吸產(chǎn)生CO2增加量來測定種子呼吸的強(qiáng)度。將種子放入小籃子中，密封廣口瓶，利用飽和堿液氫氧化鋇[Ba(OH)2]吸收種子呼吸過程中產(chǎn)生的CO2。待測試結(jié)束后，再用草酸溶液滴定殘留的Ba(OH)2，記錄消耗的草酸溶液量為V1，另取空白組滴定記錄草酸溶液量為V0。根據(jù)呼吸過程中Ba(OH)2減少量可定量測出種子在整個檢測過程中CO2的增加量?；谛』@子法測定種子呼吸強(qiáng)度的計(jì)算公式為：種子呼吸強(qiáng)度(mg·g-1·h-1)=(V0-V1)/(mt)，其中：m為種子鮮質(zhì)量(g)，t為測定時間(h)。

在不同激素、藥物和生長環(huán)境下，種子萌發(fā)過程的呼吸作用會出現(xiàn)很大差異，利用小籃子法能夠直觀地研究種子在不同外界環(huán)境下呼吸作用的變化情況。張璇等[3]利用小籃子法觀測到適當(dāng)濃度的赤霉素浸種可以提高香果樹Emmenopterys henryi種子的呼吸速率；李佳等[4]利用小籃子法測定經(jīng)不同濃度赤霉素處理后的杜仲Eucommia ulmoides種子的呼吸強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)隨著赤霉素濃度上升，種子的呼吸速率下降；方能虎等[5]采用小籃子法對水稻Oryza sativa種子進(jìn)行呼吸檢測，觀察到種子萌發(fā)初期稀土元素對其呼吸速率動態(tài)變化具有影響；楊雪鵬等[6]利用小籃子法研究不同濃度的維生素吡咯喹啉醌對水芹Oenanthe javanica種子萌發(fā)的影響。上述研究表明：利用小籃子法測定種子呼吸，能夠簡單高效地獲取不同浸種環(huán)境下種子的呼吸變化規(guī)律，為不同環(huán)境因素對種子萌發(fā)生理效應(yīng)的探索奠定了基礎(chǔ)。

小籃子法操作簡便，但不能完全反映種子呼吸CO2濃度的動態(tài)變化過程，難以避免外界CO2的侵入和干擾，反應(yīng)不敏感，在一定程度上影響了種子呼吸強(qiáng)度檢測的精度，且計(jì)算相對復(fù)雜。李海霞等[7]對此做了改進(jìn)，以利于小籃子法的推廣。

1.2 瓦氏微量法

瓦氏呼吸儀(Warburg Respirometer)是測定生物因新陳代謝而產(chǎn)生的氣壓變化所用的裝置。其工作原理為在恒溫、恒體積的密閉系統(tǒng)中，用氫氧化鉀(KOH)溶液吸收CO2使得氣體壓力降低，利用測壓計(jì)顯示壓力值，從而得到種子呼吸過程中O2消耗量。利用瓦氏呼吸儀測量種子呼吸時，首先將種子稱量后放入反應(yīng)瓶中，并將反應(yīng)瓶放入恒溫控制器。實(shí)驗(yàn)開始后調(diào)節(jié)U型測壓管底部的旋鈕，使右側(cè)閉管內(nèi)測壓液的液面保持在h=150 mm，讀取左側(cè)開管液面高度值。關(guān)閉三通活塞使壓力計(jì)與反應(yīng)瓶相通，待種子呼吸一段時間后，將右側(cè)液面仍調(diào)節(jié)至原處，并記錄左側(cè)液面高度，然后關(guān)閉測壓管。瓦氏微量法具有微量和多組測定的特點(diǎn)，靈敏度較高，壓力計(jì)上只要有1 mm的測壓液水柱變化就可以進(jìn)行測定，比小籃子法的靈敏度和精確度好。

呂洪飛等[8]利用瓦氏呼吸儀對杉木Cunninghamia lanceolata不同無性系小孢子葉球的呼吸強(qiáng)度進(jìn)行了測量，比較不育株與可育株小孢子葉球及其子葉的呼吸強(qiáng)度，并將所測結(jié)果與Clark氧電極法進(jìn)行比較，2種方法所測結(jié)果趨勢一致。黃真池等[9]參照黃學(xué)林等[10]的瓦氏微量法，使用Shw-2型呼吸儀在25 ℃下測定不同活力等級的白菜Brassica pekinensis種子在不同吸水時間下的呼吸速率，發(fā)現(xiàn)了高活力種子和中等活力種子在吸水初期(1～12 h)呼吸速率相差不明顯，低活力種子的呼吸速率在吸水前4 h明顯低于前兩者，但隨著吸水時間延長，低活力種子的呼吸速率大小與高、中等級活力種子的呼吸速率逐漸接近。王亞文等[11]利用瓦氏呼吸儀測定在暗反應(yīng)與光反應(yīng)條件下黑豆Glycine max種子萌發(fā)時產(chǎn)生CO2和消耗O2之間的變化關(guān)系，發(fā)現(xiàn)黑豆種子的呼吸速率變化符合“S”形曲線，存在明顯的呼吸滯緩期。

利用瓦氏呼吸儀測定種子呼吸強(qiáng)度在一定程度上提高了測量的靈敏度和準(zhǔn)確性。需要注意的是在瓦氏實(shí)驗(yàn)過程中需要保持溫度恒定，進(jìn)行溫度校準(zhǔn)，并盡可能采用小的呼吸室。為了避免瓦氏呼吸儀中壓力和溫度對呼吸室的容積產(chǎn)生影響，瓦氏微量法要求所取樣品體積小，因此，難以用于大粒種子呼吸強(qiáng)度的測量。此外，Gilson差分呼吸儀和Warburg呼吸計(jì)根據(jù)呼吸作用產(chǎn)生的壓力變化測得種子的呼吸速率，也屬于瓦氏微量法，但目前Gilson差分呼吸儀在種子呼吸檢測領(lǐng)域應(yīng)用較少。

1.3 Clark氧電極法

Clark氧電極(Clark oxygen electrode)是一種極譜電極，最早用于測定水溶液中溶解氧的含量，在20世紀(jì)30年代就有人利用裸露的銀-鉑電極研究藻類的光合作用。CLARK[12]在1956年提出薄膜氧電極，1983年，日本學(xué)者首次采用微機(jī)械加工技術(shù)將氧電極微型化，使得測氧技術(shù)更加簡便穩(wěn)定[13]。Clark氧電極一般是用銀作陽極，鉑作陰極，加上一層氧分子可以通過但液體不能通過的薄膜以防止電極被污染，充以氯化鉀(KCl)作為電解液。2個電極之間加上0.07 V左右的恒定電壓，在極化電壓及溫度恒定的條件下，將擴(kuò)散電流的大小作為溶解氧定量測定的基礎(chǔ)，即電流大小反應(yīng)溶解氧含量。Clark氧電極具有反應(yīng)快、靈敏度高、可連續(xù)測量、能夠記錄O2的動態(tài)變化過程等優(yōu)點(diǎn)，因此常用于研究植物根系、芽、種子、果實(shí)、葉片等組織的呼吸速率和耗氧情況，分析糖酵解、三羧酸循環(huán)等呼吸代謝途徑，從而研究植物組織的休眠和休眠解除等變化過程。

線粒體與種子呼吸直接相關(guān)，是細(xì)胞進(jìn)行三羧酸循環(huán)和生物氧化的場所[14-15]。BENAMAR等[16]在25 ℃下用校準(zhǔn)氧電極檢測種子碎片和線粒體耗氧量，證實(shí)了線粒體功能與種子品質(zhì)之間具有相關(guān)性。王偉青等[17]利用Clark氧電極分別測定黃皮Clausena lansium種子胚軸、子葉和線粒體的耗氧速率，研究黃皮種子的脫水敏感性與種子呼吸速率顯著降低的關(guān)系。陶宗婭等[18]采用Clark氧電極測定大豆Glycine max和豌豆Pisum sativum種子子葉和去子葉胚的耗氧量，研究低溫吸脹對種子呼吸代謝的影響。

Clark氧電極法實(shí)現(xiàn)了種子呼吸的連續(xù)測量，提高了測量精度和靈敏度，但該方法對溫度變化較為敏感，在測定中需要維持溫度恒定。除此之外，測定前需要先從種胚中提取和純化線粒體，操作方法較為繁瑣，且需保持良好的線粒體結(jié)構(gòu)不被其他細(xì)胞器污染，對操作要求較高。

1.4 紅外線CO2分析儀法

20世紀(jì)50年代，為了克服傳統(tǒng)氣體測壓方法操作復(fù)雜、難以實(shí)現(xiàn)自動化等缺點(diǎn)，利用CO2氣體能夠強(qiáng)烈吸收紅外線特定波段能量的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)制造了紅外線CO2分析儀(Infrared CO2Analyzer)[19]，其工作原理為：由光源發(fā)出的紅外線經(jīng)反射鏡分成2束能量相等的平行光束，分別通過參比氣室與分析氣室2個氣室。由于氣體吸收紅外線能量，使得原來能量相等的2束紅外線產(chǎn)生了能量差，被電容檢測器接收后轉(zhuǎn)變成1個電信號，從而間接測量出待測CO2的濃度。紅外線CO2分析儀具有操作簡單，反應(yīng)靈敏，讀數(shù)直觀，數(shù)據(jù)可存儲等優(yōu)點(diǎn)，已被國內(nèi)外學(xué)者廣泛應(yīng)用于各種農(nóng)業(yè)和氣體監(jiān)測等領(lǐng)域[20-21]。

諸多學(xué)者利用紅外線CO2分析儀測定種子呼吸強(qiáng)度，探究種子呼吸與其萌發(fā)過程之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)了很多重要的呼吸現(xiàn)象。如陳潤政等[22]利用FQ-W-002型紅外線CO2分析儀對花生Arachis hypogaea種子呼吸強(qiáng)度進(jìn)行了研究，證實(shí)了種子呼吸強(qiáng)度與其生活力的密切相關(guān)。陳禪友等[23]使用GXH-3010E型便攜式紅外線CO2分析儀測定黃秋葵Hibiscus esculentus種子在萌發(fā)期間的呼吸速率，發(fā)現(xiàn)其呼吸速率變化曲線符合“快—慢—快”的規(guī)律，并且發(fā)芽率高的種子比發(fā)芽率低的種子呼吸速率更高。劉美[24]利用GXH-305型便攜式紅外線CO2分析儀測量不同溫度條件下小麥‘山農(nóng)17’Triticum aestivum‘Shannong 17’種子萌發(fā)期間呼吸速率變化，證明了溫度對種子的萌發(fā)進(jìn)程具有重要影響，溫度過高或過低均不利于種子萌發(fā)。

與小籃子法和瓦氏呼吸儀相比，利用紅外線CO2分析儀測定種子呼吸強(qiáng)度，精度較高，能夠在一定程度上減少人為干涉，提高種子呼吸強(qiáng)度測量的準(zhǔn)確度。目前，國內(nèi)紅外線CO2分析儀多是進(jìn)口儀器，價格較為昂貴，且在測量過程中環(huán)境溫度變化會影響紅外光源的穩(wěn)定，直接影響測量結(jié)果。

1.5 氧傳感技術(shù)檢測法(Q2技術(shù))

氧傳感技術(shù)(oxygen sensing technology)檢測法是在密閉環(huán)境中，通過測量種子萌發(fā)過程中氧氣的消耗情況來檢測種子呼吸強(qiáng)度，由荷蘭ASTEC Global公司開發(fā)。該技術(shù)基于熒光猝滅原理，由氧傳感檢測儀向含有熒光材料的種子萌發(fā)試管中釋放藍(lán)光，藍(lán)光被熒光物質(zhì)吸收并發(fā)出紅光返回傳感器。O2分子可以消耗紅光能量(即猝滅效應(yīng))。當(dāng)種子萌發(fā)消耗氧氣時，試管內(nèi)O2濃度降低，返回的紅光隨之增強(qiáng)，所以紅光的強(qiáng)度與O2分子的濃度成反比。在測量過程中，操作軟件會根據(jù)O2濃度和時間自動繪制成耗氧曲線，測定種子呼吸時消耗O2的濃度，得到種子呼吸強(qiáng)度。根據(jù)耗氧曲線的特征，設(shè)定不同的氧代謝值，通過種子萌發(fā)啟動時間(IMT)、萌發(fā)O2消耗速率(OMR)、臨界O2壓強(qiáng)(COP)、理論萌發(fā)時間(RGT)和理論萌發(fā)率(RGR)等值，快速區(qū)分不同活力種子。

諸多學(xué)者對不同植物種子進(jìn)行測量，分析了氧傳感技術(shù)測定種子呼吸的原理、測定方法和測定結(jié)果，取得了較多研究成果。陳能阜等[25]利用氧傳感技術(shù)測定了番茄Solanum lycopersicum、辣椒Capsicum annuum、黃瓜Cucumis sativus、茄Solanum melongena、杉木和馬尾松Pinus massoniana等6種植物種子耗氧情況，發(fā)現(xiàn)不同種類、活力等級相同的種子，其耗氧曲線形狀類似。利用耗氧曲線分析了IMT、OMR、COP和RGT等參數(shù)，全面分析了種子O2消耗曲線的特征。陳合云[26]選用浙江省主栽的秈稻和粳稻各20個品種，通過室內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗(yàn)、田間出苗試驗(yàn)和氧傳感檢測試驗(yàn)，確定了適用于常規(guī)秈稻種子和粳稻種子最佳氧傳感指標(biāo)分別為RGR和OMR，并且基于氧傳感技術(shù)研究了經(jīng)處理后種子活力的變化情況，表明氧傳感技術(shù)測定種子呼吸可以有效地將老化處理、未處理與引發(fā)處理的種子區(qū)分開。

氧傳感技術(shù)是集生物技術(shù)與信息技術(shù)于一體的自動化測定種子呼吸耗氧能力的新技術(shù)，目前已經(jīng)被應(yīng)用于多種類型種子的活力水平測定[27-28]。該方法可以測量單粒種子在萌發(fā)過程中的呼吸速率，然而該方法需要對種子進(jìn)行萌發(fā)，屬于有損檢測，檢測時間較長，需要每間隔30 min或1 h對種子呼吸耗氧數(shù)據(jù)進(jìn)行1次采樣，無法展示種子耗氧曲線的細(xì)節(jié)。

1.6 TDLAS技術(shù)檢測法

可調(diào)諧二極管激光吸收光譜技術(shù)(tunable diode laser absorption spectroscopy, TDLAS)利用激光器發(fā)出的光被待測氣體選擇性吸收來測量氣體的濃度。HINKLEY[29]和REID等[30]在20世紀(jì)中期最早提出通過吸收光譜來檢測氣體濃度。1981年，REID等[31]利用波長調(diào)制技術(shù)采集數(shù)據(jù)，最終得到了和氣體濃度成正比的二次諧波表達(dá)式，從而推動了TDLAS技術(shù)向高精度氣體濃度檢測的研究方向發(fā)展。由于TDLAS技術(shù)目前已經(jīng)能夠達(dá)到10-9級別甚至10-12級別的檢測限，因此，很多學(xué)者利用TDLAS技術(shù)檢測CO2的濃度[32-33]。目前，TDLAS技術(shù)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的研究主要包括：土地排放的氣體濃度和通量的檢測[34]、植物葉片水分蒸騰速率的測量[35]、農(nóng)產(chǎn)品運(yùn)輸冷藏車內(nèi)CO2濃度的檢測[36]等方面，而對種子呼吸檢測的研究較少。種子代謝產(chǎn)物成為種子活力檢測的新思路[37]。

賈良權(quán)等[38]基于TDLAS技術(shù)自主搭建了一套種子呼吸檢測系統(tǒng)。相較于近紅外光譜技術(shù)、高光譜技術(shù)和 X 光譜技術(shù)，該系統(tǒng)檢測成本較低，能夠反演出水稻和玉米Zea mays種子呼吸過程中產(chǎn)生的CO2濃度曲線。通過與發(fā)芽試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，證明種子呼吸強(qiáng)度與種子活力等級的之間存在高度相關(guān)性。從水稻和玉米等種子呼吸與活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，TDLAS技術(shù)可以對種子呼吸強(qiáng)度進(jìn)行連續(xù)實(shí)時的監(jiān)測，檢測精度可以達(dá)到10-6。通過優(yōu)化設(shè)計(jì)光路和選擇合適波長，可以進(jìn)一步提高檢測精度，實(shí)時監(jiān)測單粒種子的呼吸情況?？梢娫摲椒ň哂休^廣闊的發(fā)展前景。此外，理論上TDLAS技術(shù)既可以檢測CO2，也可以檢測O2，因此，該方法也可以通過測定耗氧量來檢測種子的呼吸強(qiáng)度，但在實(shí)際測量時參數(shù)選擇會直接影響最終檢測結(jié)果，選擇實(shí)驗(yàn)參數(shù)的依據(jù)仍有待完善。

表1歸納了上述幾種種子呼吸檢測方法的原理及優(yōu)缺點(diǎn)，小籃子法、瓦氏微量法、Clark氧電極法、紅外線CO2分析儀法等由于其檢測精度限制，只能檢測批量種子的呼吸強(qiáng)度或者長時間累計(jì)種子的呼吸強(qiáng)度。新興技術(shù)如氧傳感技術(shù)檢測法和TDLAS技術(shù)檢測法等在種子呼吸檢測領(lǐng)域具有較好的發(fā)展?jié)摿ΑＦ渲校』@子法、瓦氏微量法、Clark氧電極法等單次最小樣本檢測量通常為1批或數(shù)克，其檢測精度取決于溶液或滴定反應(yīng)沉淀物稱量的準(zhǔn)確性，檢測時間取決于人為操作時間。

表 1 種子呼吸檢測方法比較Table 1 Comparison of respiration detection methods for seeds

2 種子呼吸及其應(yīng)用研究

2.1 種子呼吸與代謝關(guān)系研究

呼吸代謝是生命活動的中心，種子內(nèi)存在多條呼吸代謝途徑，最基本的3條途徑為糖酵解(EMP)途徑、三羧酸(TCA)循環(huán)和磷酸戊糖(PPP)途徑。不同的代謝途徑提供不同的能荷和還原力，在各發(fā)育階段有不同的代謝途徑與之相適應(yīng)。呼吸代謝各途徑的強(qiáng)弱與呼吸速率和種子萌發(fā)密切相關(guān)[40-41]，通過探索種子的代謝途徑及其各階段呼吸強(qiáng)度的變化，研究呼吸代謝在種子休眠與萌發(fā)中的作用，有助于找到打破種子休眠機(jī)制的依據(jù)，從而控制種子的休眠與萌發(fā)，縮短育種年限，提高育種效率[42]。

在研究種子休眠與萌發(fā)過程各呼吸代謝途徑的變化規(guī)律中，種子的呼吸速率是重要的測定指標(biāo)[43]。SIMMONDS等[44]在驗(yàn)證PPP途徑在種子休眠解除起重要作用的研究中，利用Warburg呼吸儀測量不同后熟期種子0～10 h的呼吸變化。利用此測定方法只能對收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，計(jì)算種子呼吸速率，不能實(shí)時反映種子呼吸連續(xù)變化情況。浦心春等[45]在研究休眠及打破休眠種子的發(fā)芽過程中加入了各種呼吸抑制劑，得出各代謝途徑呼吸速率占總呼吸速率的比例，分析結(jié)果表明：TCA途徑及PPP途徑?jīng)]有充分活化是導(dǎo)致休眠種子不能發(fā)芽的原因之一。采用小籃子法測定種子呼吸CO2的釋放速率，雖操作簡便，但受環(huán)境影響較大，并且只能人工讀取結(jié)果，容易造成誤差。陳麗培等[46]將培養(yǎng)過程中的油松Pinus tabuliformis種子每隔9 h取出并放入LI-6400光合作用呼吸儀中測量其呼吸速率，獲得呈“S”形曲線的呼吸速率變化結(jié)果，并結(jié)合代謝途徑關(guān)鍵酶活性的測定，得出種子在培養(yǎng)初期以EMP途徑為主，而中后期由EMP途徑轉(zhuǎn)向PPP途徑和TCA途徑。該研究采用的LI-6400光合作用呼吸儀基于紅外線CO2測量原理，可以有效地測定種子呼吸速率，具有測量相對精確、自動化程度高等優(yōu)點(diǎn)，但該方法需要間隔較長時間(9 h)取出樣品進(jìn)行測量，時間分辨率較低，對獲得的呼吸曲線質(zhì)量有一定影響。

呼吸代謝由EMP/TCA途徑轉(zhuǎn)向PPP途徑對種子休眠的解除具有重要作用，通過呼吸速率測定可以了解種子各代謝途徑的活化程度。為了進(jìn)一步探究種子休眠與萌發(fā)機(jī)制，需要綜合分析多種因素及其相互作用，結(jié)合種子呼吸速率、酶活性和內(nèi)源激素調(diào)控，全面把握種子生理變化，使呼吸代謝的研究具有更大的理論意義和實(shí)際效益。種子呼吸檢測方法在種子休眠解除與促進(jìn)萌發(fā)的研究中具有關(guān)鍵作用，研究者們采用不同的呼吸代謝檢測方法對種子呼吸代謝途徑的呼吸速率進(jìn)行測定。傳統(tǒng)方法受環(huán)境因素影響較大，靈敏度低，時間分辨率有限，并且由人工讀取測量結(jié)果容易造成實(shí)驗(yàn)誤差，合理選取或研究新型高靈敏度且自動化程度高的種子呼吸代謝測定方法有助于提高種子呼吸代謝效率以及結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.2 種子呼吸與儲藏關(guān)系研究

種子儲藏是種質(zhì)資源離體保存、年度間用種余缺調(diào)劑與應(yīng)急用種的有效措施[47]。種子的呼吸作用是種子儲藏期間的重要生理活動，控制好種子的呼吸作用，減少儲藏物質(zhì)的消耗，保持種子旺盛的生命力，才能達(dá)到種子安全儲藏的目的[48]。測定種子的呼吸強(qiáng)度可以衡量其呼吸作用的強(qiáng)弱，有利于了解儲藏過程中種子生理狀態(tài)、環(huán)境影響因素與種子呼吸強(qiáng)度之間的關(guān)系，為改善儲藏條件提供必要數(shù)據(jù)支撐。胡小榮等[49]將儲藏12個月的大蔥Allium fistulosum和油菜Brassica campestris種子分別存于50、35、20和-18 ℃環(huán)境下，并利用GC-7AG氣相色譜儀測定種子呼吸速率，研究發(fā)現(xiàn)：隨著儲藏溫度的升高，大蔥和油菜種子的CO2釋放量增大，同一儲藏溫度下，隨著含水量的降低，種子CO2釋放量減少。LIU等[50]在常溫與低溫2種環(huán)境下，用小籃子法測定儲藏第4年的馬尾松種子的呼吸強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)在常溫開放儲藏環(huán)境下，種子呼吸旺盛、養(yǎng)分消耗快，易喪失生活力，而采用低溫密封法可以較好地保持種子的生活力?？梢?，在一定范圍內(nèi)，呼吸作用的強(qiáng)度會隨溫度的上升而增強(qiáng)。在儲藏期間，溫度變化導(dǎo)致的種子呼吸變化還可能影響種子的感官品質(zhì)。王道營等[51]將玉米種子在不同溫度條件下儲藏一段時間后，取出放入密閉玻璃瓶中，通過GXH-3010D型紅外CO2分析儀測定一段時間內(nèi)種子的呼吸變化情況，發(fā)現(xiàn)在不同溫度下含糖量遞減速率隨溫度的升高而加大，在較低儲藏溫度下甜玉米含糖量較高，呼吸強(qiáng)度和失水量較低，能夠保持較高的食用品質(zhì)。種子的水分含量與空氣成分同樣是種子呼吸的重要影響因素。王若蘭等[52]取適量預(yù)處理后的小麥種子放入SKW-3儀器的呼吸瓶內(nèi)，測定在不同溫度、水分和氧氣濃度下小麥種子呼吸速率的變化。結(jié)果表明：在一定條件下，小麥種子呼吸作用的強(qiáng)度隨著溫度或水分的升高而加強(qiáng)，隨著氧氣濃度的降低而逐漸被抑制。

部分學(xué)者指出：種子呼吸作用在儲藏期間受溫度、濕度及環(huán)境中O2、CO2等因素的影響[53]，通過降溫、干燥、缺氧儲藏等手段能夠有效抑制種子的呼吸作用[54]，使種子處于極微弱的呼吸狀態(tài)，保持種子品質(zhì)，延長儲藏時間，減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的經(jīng)濟(jì)損失。然而在不同環(huán)境中，部分呼吸檢測儀器同樣會受到環(huán)境因素變化的影響，如小籃子法難以避免外界CO2氣體的干擾，且僅能測量取出后儲藏種子的呼吸強(qiáng)度，無法及時反映不同儲藏環(huán)境下種子的呼吸情況；Gilson差分呼吸儀和Warburg呼吸計(jì)2種儀器對壓強(qiáng)或溫度變化都極為敏感，設(shè)置不同溫度與O2濃度環(huán)境，都需要對儀器進(jìn)行平衡，且耗費(fèi)時間較長；紅外線CO2分析儀和TDLAS技術(shù)等方法可以通過調(diào)節(jié)氣室環(huán)境來測量不同溫度、氣體濃度下種子的呼吸作用，能有效避免環(huán)境因素對儀器產(chǎn)生的影響。可見，在儲藏環(huán)境因素對種子呼吸強(qiáng)度影響的研究中，所采用的種子呼吸檢測方法不僅要結(jié)果精確、自動化程度高，還需盡量減少環(huán)境因素干擾，才可以實(shí)時反映不同儲藏環(huán)境下種子的呼吸變化情況。

2.3 種子呼吸與活力關(guān)系研究

種子活力作為衡量種子質(zhì)量的一個重要指標(biāo)，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和自然環(huán)境等民生問題有著重要影響[55]。種子的呼吸強(qiáng)度與其活力存在一定的正相關(guān)性[56-57]。國內(nèi)外學(xué)者嘗試采用不同的檢測技術(shù)對種子呼吸過程中O2的消耗量或產(chǎn)生的CO2量進(jìn)行檢測，研究種子呼吸與活力相關(guān)性。在種子活力研究中采用測定耗氧量的方法有：Gilson差分呼吸儀法、瓦氏微量法、Clark氧電極法[58]和氧傳感技術(shù)檢測法等。

WOODSTOCK等[59]將玉米種子置于裝有5 mL水的反應(yīng)瓶中并連接Gilson差分呼吸儀，測量種子吸水開始后2～30 h的耗氧情況，得出在空氣環(huán)境下種子的呼吸速率與根長、芽長的相關(guān)系數(shù)分別為0.82和0.79，表明種子呼吸速率與發(fā)芽和幼苗生長之間呈顯著正相關(guān)。趙光武等[37]探討了氧傳感測定指標(biāo)與杉木種子發(fā)芽測定指標(biāo)之間的相關(guān)性，應(yīng)用氧傳感技術(shù)軟件自動繪制耗氧曲線并計(jì)算，得到COP，指出呼吸強(qiáng)度開始降低時O2濃度與發(fā)芽率呈顯著負(fù)相關(guān)。鐘希瓊等[60]在水稻種子萌發(fā)進(jìn)行到80～88 h時，用滴定法(同小籃子法)測定種子呼吸速率，研究發(fā)現(xiàn)：其生活力、發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)均與呼吸速率呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.847、0.931、0.937和0.870。賈良權(quán)等[38]基于TDLAS檢測技術(shù)選取3個活力等級的甜玉米種子，將預(yù)處理后的種子放入基于TDLAS技術(shù)的種子呼吸容器中，啟動設(shè)備自動存儲數(shù)據(jù)并繪制呼吸產(chǎn)生的CO2濃度曲線圖，計(jì)算得到第3～8小時各時刻種子的呼吸強(qiáng)度與活力指數(shù)的相關(guān)系數(shù)均大于0.900。這表明種子的呼吸強(qiáng)度可以快速反映種子的活力水平。

上述研究結(jié)果表明：玉米、水稻、杉木等種子的呼吸強(qiáng)度與其發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)等呈現(xiàn)一定的正相關(guān)性。但目前還存在一些科學(xué)問題尚未解決，如在同一遺傳品系內(nèi)部種子呼吸強(qiáng)度與種子活力的定量關(guān)系，以及不同遺傳品系間種子的活力與呼吸強(qiáng)度相關(guān)度等具體問題。針對上述問題，可通過種子呼吸檢測及發(fā)芽試驗(yàn)，定量研究種子呼吸強(qiáng)度與種子活力之間的相關(guān)關(guān)系，以期通過呼吸強(qiáng)度的檢測來準(zhǔn)確判定種子活力的高低，從而提高制種效率。氧傳感技術(shù)與TDLAS技術(shù)在種子呼吸檢測領(lǐng)域的應(yīng)用，使得種子活力檢測向著快速、準(zhǔn)確且自動化程度高的方向發(fā)展。相比發(fā)芽、田間出苗等試驗(yàn)，氧傳感技術(shù)與TDLAS技術(shù)操作更加簡便、耗時較短、效率更高，可將呼吸強(qiáng)度作為鑒定種子活力的生理指標(biāo)，并在種子選擇、檢驗(yàn)、儲藏等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。

3 展望

種子呼吸強(qiáng)度的檢測可以用于研究種子休眠解除過程中各代謝途徑，了解種子的活力情況及收獲后的生理狀態(tài)，指導(dǎo)選用和生產(chǎn)高活力種子，在研究種子呼吸代謝、種子活力和種子儲藏等方面具有重要的意義與價值。結(jié)合目前種子呼吸檢測方法和應(yīng)用領(lǐng)域的研究進(jìn)展，筆者認(rèn)為應(yīng)著力從以下幾個方面開展進(jìn)一步研究：①小籃子法、瓦氏微量法等目前常用的種子呼吸檢測方法多數(shù)存在不能實(shí)時反映種子呼吸變化等缺陷且屬于有損檢測。新型技術(shù)如紅外線CO2分析儀法、氧傳感技術(shù)法等近年得到了較好的應(yīng)用與發(fā)展，這些方法能夠獲得種子呼吸檢測的變化曲線，然而這些方法多針對批量種子長時間呼吸積累量進(jìn)行檢測，對單粒種子以及種子萌發(fā)前的呼吸檢測尚無能為力，因此具有一定的應(yīng)用局限?？傮w種子呼吸檢測方法的研究進(jìn)展緩慢，對種子生理生化的深入研究產(chǎn)生了一定的影響。以TDLAS技術(shù)為代表的新型光學(xué)檢測方法具有高靈敏度、快速檢測等優(yōu)點(diǎn)，其檢測精度能夠達(dá)10-6以下，通過選用強(qiáng)吸收線的激光器光源并配合長光程種子吸收池，種子呼吸CO2檢測精度甚至可以達(dá)到10-9，種子呼吸消耗O2檢測精度達(dá)10-6級別?？梢?，TDLAS技術(shù)是一種頗具前途的種子呼吸檢測方法，能夠有效地避免上述問題，且TDLAS技術(shù)可以進(jìn)行CO2和O2等多種氣體的同步監(jiān)測，能夠全面掌握種子呼吸代謝過程變化情況。因此，隨著種子呼吸與生理生化、儲藏環(huán)境等相關(guān)領(lǐng)域的研究進(jìn)展，基于TDLAS等光學(xué)檢測技術(shù)的研究，同時開展呼吸代謝中CO2和O2的同步監(jiān)測，研究出靈敏度更高、操作更為簡單的種子呼吸檢測方法及裝備具有可行性。②目前，種子呼吸研究主要集中在種子呼吸代謝與休眠、萌發(fā)、代謝途徑等相關(guān)領(lǐng)域。隨著技術(shù)手段的提升，可以進(jìn)一步加強(qiáng)種子休眠、種子早期萌發(fā)機(jī)制以及鹽堿、溫度等環(huán)境脅迫與種子呼吸代謝關(guān)系研究，深入分析種子呼吸代謝及其影響因素的關(guān)系，從而完善種子呼吸代謝相關(guān)理論。③保持種子儲藏活力的關(guān)鍵因素之一在于降低種子的呼吸強(qiáng)度和減緩劣變進(jìn)程。在種子儲藏倉庫中除了設(shè)置測溫儀、水分測定儀、發(fā)芽箱等設(shè)備，還應(yīng)該增加呼吸檢測儀器，監(jiān)測儲藏過程中種子的呼吸強(qiáng)度，及時了解種子的生理活動狀態(tài)。開展低成本種子儲藏呼吸CO2在線氣體監(jiān)測系統(tǒng)研制具有重要價值。④目前種子呼吸與種子活力的研究主要為定性研究，定量研究還相對較少。兩者定量關(guān)系模型的研究和建立可為利用種子呼吸進(jìn)行種子活力檢測提供重要的理論支撐。此外，在種子呼吸與種子活力關(guān)系研究中，應(yīng)將種子呼吸指標(biāo)和種子活力參數(shù)(種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù))以及種子發(fā)育過程中內(nèi)含物的變化情況相結(jié)合，全面分析種子呼吸強(qiáng)度與種子活力的定量關(guān)系，并以此為依據(jù)，探尋能夠?qū)⒎N子呼吸強(qiáng)度作為有效判定種子活力的方法，特別應(yīng)加強(qiáng)種子萌發(fā)前的呼吸與活力相關(guān)指標(biāo)的研究。