一株小核菌多糖高產(chǎn)菌及其發(fā)酵特征

張永剛，董學(xué)前，王 偉，張艷敏

(山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，山東 濟(jì)南 250013)

一株小核菌多糖高產(chǎn)菌及其發(fā)酵特征

張永剛，董學(xué)前*，王 偉，張艷敏

(山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院，山東 濟(jì)南 250013)

從感染白腐病的馬鈴薯中分離篩選了一株高產(chǎn)小核菌多糖菌株，命名為齊整小核菌SCL2010(SclerotiumrolfsiiSCL2010)，對(duì)菌株SCL2010發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源、有機(jī)氮源進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)發(fā)酵過(guò)程中pH值的變化進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，以葡萄糖為碳源、玉米漿為有機(jī)氮源對(duì)菌株SCL2010進(jìn)行發(fā)酵，小核菌多糖的產(chǎn)量、碳源轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物合成速率分別達(dá)到28 g·L-1、56%和0.39 g·L-1·h-1，顯著高于已有研究報(bào)道。在發(fā)酵產(chǎn)小核菌多糖的過(guò)程中，其pH值的變化與已有研究報(bào)道顯著不同：其pH值從發(fā)酵開(kāi)始迅速下降至3.0以下后開(kāi)始緩慢上升至3.5～4.0；如果控制pH值則使小核菌多糖的產(chǎn)量顯著降低，而草酸含量升高，以此推測(cè)小核菌多糖的合成可能與pH值的變化有關(guān)，后續(xù)將進(jìn)行深入研究。

小核菌多糖；齊整小核菌；高產(chǎn)菌株；發(fā)酵特征

小核菌多糖(scleroglucan)是由絲狀真菌齊整小核菌產(chǎn)生的非離子水溶性胞外多糖。其分子由含有β-D-(1,6)-葡萄糖殘基側(cè)鏈的線(xiàn)性β-D-(1，3)-葡萄糖殘基鏈組成。小核菌多糖具有良好的流變性、耐酸堿(pH 1～12)、礦化度適應(yīng)性強(qiáng)(0～200 000 mg·L-1)、耐高溫(130 ℃)[1-2]，在食品與石油工業(yè)具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。小核菌多糖能提高原油采收率，在當(dāng)前普遍進(jìn)入三次、四次采油的趨勢(shì)下，具有廣闊的市場(chǎng)前景。但是小核菌多糖的產(chǎn)量不高使其價(jià)格居高不下，嚴(yán)重限制了其市場(chǎng)發(fā)展。因此，提高小核菌多糖的產(chǎn)量是目前的研究重點(diǎn)。目前，主要通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基、發(fā)酵條件、發(fā)酵罐設(shè)計(jì)以及高產(chǎn)菌株誘變等方法實(shí)現(xiàn)小核菌多糖高產(chǎn)的目的[3]。

從感染白腐病的馬鈴薯中分離篩選出一株顯著高產(chǎn)小核菌多糖的絲狀真菌，通過(guò)18S rDNA序列比對(duì)分析，該菌株屬于齊整小核菌，命名為齊整小核菌SCL2010(SclerotiumrolfsiiSCL2010)。為提高小核菌多糖的發(fā)酵產(chǎn)量，對(duì)菌株SCL2010發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源和有機(jī)氮源進(jìn)行了優(yōu)化，并研究了該菌株發(fā)酵過(guò)程中pH值的變化規(guī)律。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種和培養(yǎng)基

齊整小核菌SCL2010(SclerotiumrolfsiiSCL2010),保藏于中國(guó)典型微生物保藏中心(CCTCC No.M 2014325)。

基本發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖50.0，酵母膏2.0，NaNO32.0，K2HPO4·3H2O 1.0，檸檬酸0.7，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 0.5，pH值4.5。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵過(guò)程

搖瓶發(fā)酵：500 mL搖瓶裝液量80 mL，接種量10%，發(fā)酵溫度28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速300 r·min-1。

10 L發(fā)酵罐發(fā)酵：裝液量7 L，接種量10%，發(fā)酵溫度28 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速350 r·min-1。

1.2.2 小核菌多糖產(chǎn)量和生物量的測(cè)定

取10 mL發(fā)酵液中和，用蒸餾水稀釋3～4倍，80 ℃水浴30 min，均質(zhì)1～2 min后10 000g離心30 min。上清液加2倍體積的95%乙醇沉淀小核菌多糖，過(guò)濾，再用95%乙醇洗滌，所得沉淀于105 ℃干燥，稱(chēng)重，測(cè)定小核菌多糖產(chǎn)量。離心所得沉淀用蒸餾水重溶洗滌后10 000g離心30 min，所得沉淀于105 ℃干燥，稱(chēng)重即為生物量。

1.2.3 發(fā)酵液表觀黏度與1.0%(質(zhì)量體積比，下同)多糖溶液黏度的測(cè)定

發(fā)酵液表觀黏度采用NDJ-1型黏度計(jì)、4號(hào)轉(zhuǎn)子、60 r·min-1、25 ℃測(cè)定。

1.0%多糖溶液黏度采用NDJ-1型黏度計(jì)、3號(hào)轉(zhuǎn)子、60 r·min-1、25 ℃測(cè)定。

1.2.4 發(fā)酵液殘?zhí)呛康臏y(cè)定

采用費(fèi)林法測(cè)定以淀粉和葡萄糖為碳源時(shí)的殘?zhí)呛俊２捎米贤夥止夤舛确y(cè)定以蔗糖為碳源時(shí)的殘?zhí)呛俊?/p>

1.2.5 發(fā)酵液草酸含量的測(cè)定(HPLC法)

色譜條件：Shimadzu/Agilent 1100 液相分析系統(tǒng)，G1311A 四元泵，示差折光檢測(cè)器(RID)，進(jìn)樣量為10 μL；Agilent HPLC 2D色譜工作站；色譜柱為Bio-Rad Aminex HPX-87H多孔陰離子交換柱(7.8 mm×300 mm)，柱溫為55 ℃，流動(dòng)相為10 mmol·L-1H2SO4，流速為0.4 mL·min-1。以保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。

樣品處理：沸水浴10 min，12 000g離心10 min，經(jīng)0.22 μm水相濾膜過(guò)濾。

2 結(jié)果與討論

目前關(guān)于小核菌多糖發(fā)酵生產(chǎn)的相關(guān)研究所采用的菌株主要有SclerotiumrolfsiiATCC 201126、ATCC 15205、MTCC 2156，發(fā)酵培養(yǎng)基成分基本相同，碳源為蔗糖，有機(jī)氮源為酵母膏，發(fā)酵產(chǎn)量多在20 g·L-1左右[4-6]。

2.1 碳源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)小核菌多糖的影響

分別采用淀粉、蔗糖、葡萄糖作為菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源，濃度均為50 g·L-1，發(fā)酵時(shí)間為72 h，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 碳源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)小核菌多糖的影響Fig.1 Effect of carbon source on fermentativescleroglucan production

由圖1可以看出，以淀粉為碳源時(shí)，小核菌多糖的產(chǎn)量高達(dá)30 g·L-1，但產(chǎn)生的多糖黏度較低，即平均分子量低，分子鏈短；以葡萄糖為碳源時(shí)，小核菌多糖的產(chǎn)量(28 g·L-1)和黏度都較高；而以蔗糖為碳源時(shí),多糖產(chǎn)量較低，僅為22 g·L-1左右，這與目前大量以蔗糖為碳源發(fā)酵產(chǎn)小核菌多糖的研究結(jié)果基本吻合。Faria等[4]采用150 g·L-1蔗糖為碳源，小核菌多糖的產(chǎn)量達(dá)到28 g·L-1，雖然產(chǎn)量高但碳源轉(zhuǎn)化率遠(yuǎn)低于本研究中以淀粉和葡萄糖為碳源的碳源轉(zhuǎn)化率。綜合考慮，選擇適宜碳源為葡萄糖。

進(jìn)一步研究葡萄糖濃度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)小核菌多糖的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可以看出，隨著葡萄糖濃度的增大，小核菌多糖產(chǎn)量呈上升趨勢(shì)，但當(dāng)葡萄糖濃度超過(guò)50 g·L-1后，碳源轉(zhuǎn)化率開(kāi)始下降，殘?zhí)呛可仙@著。因此，該菌株發(fā)酵產(chǎn)小核菌多糖適宜碳源濃度為50 g·L-1，小核菌多糖產(chǎn)量達(dá)到28 g·L-1以上，碳源轉(zhuǎn)化率達(dá)到56%。

圖2 葡萄糖濃度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)小核菌多糖的影響Fig.2 Effect of glucose concentration onfermentative scleroglucan production

2.2 有機(jī)氮源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)小核菌多糖的影響

分別采用酵母膏、玉米漿、蛋白胨、大豆蛋白胨、水解豆粉作為菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的有機(jī)氮源，濃度均為1 g·L-1，發(fā)酵時(shí)間為72 h，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 有機(jī)氮源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)小核菌多糖的影響Fig.3 Effect of organic nitrogen source onfermentative scleroglucan production

由圖3可以看出，以玉米漿為有機(jī)氮源時(shí)，小核菌多糖產(chǎn)量和菌體生物量均高于其它4種有機(jī)氮源，而有機(jī)氮源的種類(lèi)對(duì)1.0%多糖溶液的黏度影響并不明顯，即不影響產(chǎn)品質(zhì)量。綜合考慮，選擇適宜的有機(jī)氮源為玉米漿。

進(jìn)一步研究玉米漿濃度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)小核菌多糖的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

從圖4可以看出，隨著玉米漿濃度的增大，菌體生物量呈上升趨勢(shì)；小核菌多糖產(chǎn)量在玉米漿濃度超過(guò)1.0 g·L-1后變化不明顯；當(dāng)玉米漿濃度超過(guò)2.0 g·L-1后，小核菌多糖的產(chǎn)量開(kāi)始下降。因此，玉米漿適宜濃度為1.0 g·L-1。

圖4 玉米漿濃度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)小核菌多糖的影響Fig.4 Effect of corn steep liquor concentration onfermentative scleroglucan production

2.3 發(fā)酵特征

圖5、6為菌株SCL2010的10 L發(fā)酵罐發(fā)酵過(guò)程曲線(xiàn)。

圖5 發(fā)酵產(chǎn)小核菌多糖過(guò)程中生物量、殘?zhí)呛亢投嗵钱a(chǎn)量變化Fig.5 Changes of biomass，residual sugar content,and polysaccharide production in the process offermentative scleroglucon production

圖6 發(fā)酵產(chǎn)小核菌多糖過(guò)程中pH值、發(fā)酵液表觀黏度和草酸含量變化Fig.6 Changes of pH value,fermentation broth viscosity,and oxalic acid content in the process offermentative scleroglucan production

從圖5、6可以看出，小核菌多糖與菌株的生長(zhǎng)具有一定相關(guān)性，在發(fā)酵前期(0～24 h)pH值迅速降低，但小核菌多糖產(chǎn)量和生物量增加緩慢，葡萄糖消耗速率較慢；到發(fā)酵中期(24～56 h)后，小核菌多糖產(chǎn)量和生物量迅速增加，葡萄糖迅速消耗，草酸大量生成，但pH值上升緩慢，發(fā)酵液表觀黏度隨著小核菌多糖的積累迅速上升；在發(fā)酵后期各參數(shù)變化趨緩。小核菌多糖的最高產(chǎn)量(28 g·L-1)顯著高于已有研究報(bào)道。大量研究表明[4-6]，發(fā)酵產(chǎn)小核菌多糖的過(guò)程中pH值的自然變化是由初始4.5逐漸降低至2.0左右；但在菌株SCL2010發(fā)酵產(chǎn)小核菌多糖過(guò)程中，pH值下降至2.8(30 h)左右后，開(kāi)始緩慢回升，直至發(fā)酵結(jié)束，可達(dá)到3.8左右(圖6)。菌株SCL2010發(fā)酵過(guò)程中pH值的變化和其它菌株顯著不同，推測(cè)這一獨(dú)特的pH值變化過(guò)程可能是該菌株高產(chǎn)小核菌多糖的主要原因。

2.4 pH值變化與小核菌多糖的高產(chǎn)

pH值對(duì)菌體內(nèi)生物酶的活性影響顯著。在小核菌多糖發(fā)酵過(guò)程中pH值對(duì)菌體生長(zhǎng)和小核菌多糖的生物合成均有顯著影響。有研究表明pH值為2時(shí)對(duì)菌體生長(zhǎng)有利，而pH值為4.5時(shí)對(duì)小核菌多糖的生物合成具有促進(jìn)效果[7]。在pH值上升期，控制發(fā)酵液pH值維持在不同值(2.0、2.5、3.0、3.5、3.8、4.0)，以pH值自然變化作為對(duì)照，考察pH值對(duì)發(fā)酵產(chǎn)小核菌多糖的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 不同pH值對(duì)發(fā)酵產(chǎn)小核菌多糖的影響Fig.7 Effect of different pH values onfermentative scleroglucan production

由圖7可以看出，pH值在3.5和3.8時(shí)小核菌多糖產(chǎn)量較高，但仍低于自然pH值變化的發(fā)酵產(chǎn)量水平，且合成了較多的草酸。原因有待于通過(guò)代謝流分

析實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

菌株SclerotiumrolfsiiSCL2010是具有顯著特異性的小核菌多糖高產(chǎn)菌，其發(fā)酵適宜的碳源和有機(jī)氮源分別為葡萄糖和玉米漿。發(fā)酵過(guò)程的最顯著特征是pH值在發(fā)酵前期迅速降至3.0以下，而在進(jìn)入產(chǎn)糖期后則開(kāi)始逐漸回升至3.5～4.0，小核菌多糖產(chǎn)量可達(dá)28 g·L-1。后續(xù)將通過(guò)菌株發(fā)酵過(guò)程中代謝流的變化特征的研究，分析該pH值變化規(guī)律的機(jī)理，以闡釋pH值變化與該菌株高產(chǎn)小核菌多糖的關(guān)系。

[3] SCHMID J,MEYER V,SIEBER V.Scleroglucan：biosynthesis，production and application of a versatile hydrocolloid[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2011，91(4):937-947.

[5] SCHILLING B M,RAU U,MAIER T，et al.Modeling and scale-up of the unsterile scleroglucan production process withSclerotiumrolfsiiATCC 15205[J].Bioprocess Engineering，1999,20(3)：195-201.

[6] SURVASE S A,SAUDAGAR P S,SINGHAL R S.Use of complex media for the production of scleroglucan bySclerotiumrolfsiiMTCC 2156[J].Bioresource Technology，2007，98(7):1509-1512.

AScleroglucanHigh-YieldingStrainandItsFermentationCharacteristics

ZHANG Yong-gang，DONG Xue-qian*，WANG Wei，ZHANG Yan-min

(ShandongFoodFermentIndustryResearchamp;DesignInstitute,Jinan250013，China)

We isolated a scleroglucan high-yielding strain namedSclerotiumrolfsiiSCL2010 from potatoes suffered white rot,optimized carbon source and organic nitrogen source of fermentation medium,and investigated pH value change in the fermentation process.The results showed that，in the fermentation with glucose as a carbon source and corn steep liquor as a nitrogen source，scleroglucan yield，nitrogen source conversion rate，and product synthetic rate were 28 g·L-1,56%,and 0.39 g·L-1·h-1,respectively，which were significantly higher than those of previous studies.Different from the previous studies，the pH value dropped to below 3.0 at the initial stage while rose slowly to 3.5～4.0.When the pH value was controlled at a certain value，the scleroglucan production decreased significantly but the oxalic acid content increased，which revealed the scleroglucan synthesis might be associated with the pH value change,and further study is required.

scleroglucan;Sclerotiumrolfsii;high-yielding strain;fermentation characteristics

山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2015GGX102015)

2017-07-03

張永剛(1985-)，男，內(nèi)蒙古突泉人，工程師，研究方向：微生物聚合物發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)與產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用,E-mail：zyg8500@126.com；通訊作者：董學(xué)前，研究員,E-mail：dxqn@163.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.11.005

張永剛，董學(xué)前，王偉，等.一株小核菌多糖高產(chǎn)菌及其發(fā)酵特征[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(11)：19-22.

TQ922

A

1672-5425(2017)11-0019-04