多粘類芽胞桿菌JE53對香梨采后黑斑病菌抑制效果及貯藏品質(zhì)的影響

郝金輝，林勝楠，吳梓菲，王 寧，詹發(fā)強(qiáng)，史應(yīng)武，何亞芳，楊 蓉，侯新強(qiáng)，包慧芳*

（1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物重點(diǎn)實驗室，烏魯木齊 830091；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

庫爾勒香梨PyrussinkiangensisYü 是新疆優(yōu)質(zhì)特色品種，距今已有1400 多年栽培歷史[1]，其具有皮薄肉脆、風(fēng)味濃郁、汁多渣少、營養(yǎng)豐富等優(yōu)良品質(zhì)，在國內(nèi)外市場上享有盛譽(yù)。庫爾勒香梨屬于典型的呼吸躍變型果實[2]，在采后貯藏過程中果實軟化、品質(zhì)下降，進(jìn)而發(fā)生腐敗變質(zhì)，從而降低果實品質(zhì)和商品價值，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。其中由互隔交鏈孢引起的黑斑病是其采后貯期的主要病害之一。因此，有效保持果實品質(zhì)和減少病害發(fā)生是亟待解決的問題。

目前，香梨采后貯藏保鮮手段主要包括1-甲基環(huán)丙烯（1-MCP）[3]、低溫[4]、氣調(diào)保鮮[5]等。1-MCP處理可以延緩果實的衰老過程，延長貯藏期，相關(guān)研究表明，1-MCP 處理能夠延緩果實色度角[6]、硬度[7]下降，抑制丙二醛含量上升，提高抗氧化酶的活性[8]，有效提高果實的貯藏期，延緩果實衰老，但對病原真菌的抑制效果不佳[9]。低溫能抑制果實呼吸強(qiáng)度、保持良好感官品質(zhì)、延緩衰老[10]，但長時間的低溫冷藏容易使果實發(fā)生冷害而腐敗。目前，生物保鮮尤其是微生物保鮮作為一種安全健康且性價比高應(yīng)對果蔬采后保鮮問題的途徑，成為國內(nèi)外研究熱點(diǎn)，也成為果蔬采后保鮮的重要發(fā)展方向。

微生物保鮮是指利用微生物菌體本身或其次級代謝產(chǎn)物來抑制或殺死果蔬中的有害微生物，從而達(dá)到防腐保鮮的效果。近年來，越來越多的研究報道表明，拮抗微生物可以抑制水果采后的生理代謝，保持果實的貯藏品質(zhì)[11]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，拮抗微生物能夠通過調(diào)節(jié)水果抗氧化系統(tǒng)，減少自由基的產(chǎn)生，從而保持水果品質(zhì)[12]。

多粘類芽胞桿菌JE53 為本研究團(tuán)隊在前期研究中篩選獲得，對梨黑斑病菌互隔交鏈孢具有顯著抑制效果，前期研究結(jié)果表明，JE53 可分泌纖維素酶、蛋白酶、葡聚糖酶，可抑制梨黑斑病菌孢子萌發(fā)，還可造成菌絲畸形、表面粗糙、扭曲凹陷[13]。本論文在此基礎(chǔ)上測定了JE53 發(fā)酵液對庫爾勒香梨采后黑斑病菌抑制效果及貯藏品質(zhì)的影響，以期為香梨采后黑斑病的生物防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試庫爾勒香梨，選擇無病害、無傷口、成熟度和大小、色澤一致的市售果實作為實驗材料。

香梨黑斑病菌互隔交鏈孢、多粘類芽胞桿菌P.polymyxa（JE53）由本實驗室前期分離鑒定和保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 拮抗菌JE53 對鏈格孢抑制效果測定 將香梨果實用0.2% NaClO 浸泡2 min 進(jìn)行表面消毒后，再用無菌水沖洗，自然晾干。果實分為3 組進(jìn)行以下處理，每處理9 個梨：（1）無菌水浸泡3 min 作為對照1；（2）1-MCP 處理24 h 作為對照2：參考李學(xué)文等的方法[14]，室溫下，將香梨果實放置在由PE 膜（0.1 mm 厚）制成的密封的1 m3帳中，精確稱取1.6 g 1-MCP 藥劑（0.014%，SmartFresh 粉劑）放入50 mL 燒杯中，放置于塑料帳中, 加入10 mL 蒸餾水，輕搖，迅速密封PE 帳，使其中1-MCP 濃度為1.0 μL/L，熏蒸24 h 后，揭開PE 帳，通風(fēng)30 min；（3）拮抗菌JE53 發(fā)酵稀釋液（約2×108cfu/mL）浸泡3 min作為處理組。

在上述處理后的香梨果實上打3 個孔（直徑7 mm，深5 mm），分別添加10 μL 病原菌孢子懸浮液（約2×105孢子/mL）。置于人工氣侯箱（溫度25 ℃、RH 95%）貯藏，觀察果實發(fā)病狀況，144 h 統(tǒng)計果實發(fā)病后病斑直徑并根據(jù)如下公式計算抑菌率。抑制率（%）＝（對照菌落直徑－處理菌落直徑）/（對照菌落直徑－菌餅直徑）×100。

1.2.2 拮抗菌JE53 對果實貯藏品質(zhì)及生理特性指標(biāo)測定 果實分為3 組進(jìn)行以下處理，每處理9 個梨：（1）無菌水處理，即將香梨用無菌水浸泡3 min；（2）1-MCP 處理，即參照李學(xué)文等的方法[14]，室溫下，將香梨果實放入塑料周轉(zhuǎn)箱中，放置在由PE 膜（0.1 mm 厚）制成的密封的1 m3帳中，精確稱取1.6 g 1-MCP藥劑（0.014%，SmartFresh 粉劑）放入50 mL 燒杯中, 放置于塑料帳中，加入10 mL 蒸餾水，輕搖，迅速密封PE 帳，使其中1-MCP 濃度為1.0 μL/L，熏蒸24 h 后，揭開PE 帳，通風(fēng)30 min；（3）拮抗菌JE53處理，即將香梨用拮抗菌JE53 稀釋液（約2×108cfu/mL）浸泡3 min。處理完畢將果實置于人工氣侯箱（溫度 25 ℃、RH 95%）貯藏15 d，每3 d 進(jìn)行取樣，每個處理隨機(jī)取3 個香梨，測定以下品質(zhì)及生理特性指標(biāo)，重復(fù)3 次。

a）色度角（H°）測定 采用高品質(zhì)電腦色差儀（NR10QC）沿果實赤道取3 點(diǎn)測定[15]，取平均值。記錄L*值、a*值和b*值，L*表示亮度；a*值代表紅綠色調(diào)，正值為紅色；b*代表黃藍(lán)色調(diào)，正值為黃色。按以下公式計算色度角H°來表示色澤的變化[16]：H°=180°+arctan（b* /a*）。

b）失重率測定 記錄梨果在貯藏前和貯藏期間的重量，計算失重率（%）。計算公式如下：

c）果實內(nèi)在品質(zhì)指標(biāo)測定 每個處理隨機(jī)選取3 個樣本，用水果硬度計（浙江托普云農(nóng)科技股份有限公司，GY-4）在果實赤道區(qū)域等距離3 點(diǎn)進(jìn)行測定硬度值，結(jié)果取平均值，單位Kg[17]?？扇苄怨绦挝铮═SS）含量采用TD-45 數(shù)顯糖度計測定[18]，單位%；可滴定酸（TA）含量采用酸堿中和滴定法[19]，結(jié)果以蘋果酸折算系數(shù)0.067 計算，單位%；抗壞血酸（AsA）含量采用抗壞血酸（AsA）含量測試盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）測定，單位μg/g。

d）丙二醛（MDA）含量測定 采用丙二醛（MDA）含量測試盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）測定，單位nmol/g。

e）防御酶活性測定（PPO、POD、PAL、CAT）采用試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）測定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有結(jié)果均運(yùn)用SPSS 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，經(jīng)Duncan’s 新復(fù)極差法檢驗組間差異，P＜0.05 表示差異顯著；所有數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。使用Origin 2021 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌對梨黑斑病菌體內(nèi)抑制效果

在觀察記錄過程中發(fā)現(xiàn)，1-MCP 處理不能有效抑制病原菌的生長，96 h 前病斑直徑顯著大于對照CK組病斑直徑，120 h 后病斑直徑與對照CK 組病斑直徑差異不顯著。貯藏至144 h，如圖1 所示，對照組（CK組和1-MCP 組）梨果實病原菌菌絲生長旺盛，而經(jīng)JE53 處理后病原菌生長受到明顯抑制，且病斑直徑顯著小于對照組病斑直徑。由圖2B 可知，拮抗菌JE53 對梨黑斑病抑制效果優(yōu)于1-MCP，貯藏144 h 時抑菌率為30.73%。

圖1 144 h 時各處理對梨黑斑病菌的防治效果Fig.1 The inhibition effect of each treatment on pear black spot pathogen in 144 h

圖2 96-168 h 內(nèi)各處理菌絲生長情況Fig.2 The growth of hyphae within 96-168 h

2.2 拮抗菌對梨果實采后貯藏品質(zhì)的影響

2.2.1 菌株JE53 對梨果實色度角的影響 由圖3A 和圖3B 可知，在貯藏過程中，三組梨果實的亮度L*值和色度角H°均呈現(xiàn)下降趨勢，總體來說，CK 組下降速率最快、JE53 次之，1-MCP 下降速率最慢。圖3A 表明，在第15 d 時，CK 組L*值（56.34）顯著低于JE53 處理組 （61.60，P＜0.05）。圖3B 表明，JE53處理組H°低于1-MCP 組，但顯著高于CK 組（P＜0.05）。由上可知，JE53 處理能延緩貯期梨果實亮度及色度角的下降，延緩果皮由綠轉(zhuǎn)黃，其保綠性能不及1-MCP，但顯著優(yōu)于自然貯藏效果。

圖3 JE53 處理對香梨貯藏期間色度的影響Fig.3 Effect of strain JE53 on chromaticity of pear fruit during storage

2.2.2 菌株JE53 對梨果實失重率的影響 由圖4 可知，在貯藏過程中各處理果實的失重率均呈現(xiàn)上升趨勢；但JE53 處理組與1-MCP 組失重率上升速率均低于CK 組，JE53 處理組與1-MCP 組間差異不顯著（P＞0.05）。第15 d，JE53 處理組失重率（1.47%）低于對照組失重率（1.82%），且差異顯著（P＜0.05）。結(jié)果表明，拮抗菌JE53 能有效維持果實水分，減少貯藏期間質(zhì)量損失，從而延長貯藏期。

圖4 JE53 對香梨貯藏期間失重率的影響Fig.4 Effects of strain JE53 on weight loss rate of pear fruit during storage

2.2.3 菌株JE53 對梨果實硬度的影響 由圖5 可知，各處理梨果實硬度均隨著貯藏期的延長逐漸下降，但JE53 處理組下降速率顯著低于CK 組。第15 d 時，JE53 處理組梨果實硬度為3.78 Kg，分別為CK 組（2.51 Kg）和1-MCP 組（3.09 Kg）的1.51 倍和1.22 倍，且差異顯著（P＜0.05）。結(jié)果表明，拮抗菌JE53 處理能更好維持果實較高的硬度。

圖5 JE53 對香梨貯藏期間果實硬度的影響Fig.5 Effect of strain JE53 on the firmness of pear fruit during storage

2.2.4 菌株JE53 對梨果實TSS 含量的影響 如圖6 所示，隨著貯藏期延長，梨果實TSS 含量整體呈先上升后下降趨勢。在貯藏初期各處理TSS 含量有所上升，這可能與果實中含有淀粉等大分子物質(zhì)，并在成熟過程中不斷向糖的轉(zhuǎn)化有關(guān)[26]。隨著貯藏期延長，各處理TSS 含量均呈下降趨勢，這可能與TSS 作為呼吸底物被代謝降解有關(guān)[27]。CK 組TSS 含量于第6 d 時上升至最大值，隨后迅速下降；1-MCP 組TSS 含量于9 d 時上升至最大值，隨后逐漸下降；而JE53 處理組TSS 含量緩慢上升，第12 d 時達(dá)到最大值（11.5%），隨后平緩下降。第15 d 時，JE53 處理組TSS 含量（11.43%）為CK 組（10.1%）1.13 倍，差異顯著（P＜0.05）。結(jié)果表明，拮抗菌JE53 處理能有效減緩梨果實TSS 含量的下降。

圖6 JE53 處理對香梨貯藏期間TSS 含量的影響Fig.6 Effect of strain JE53 on TSS content of pear fruit during storage

2.2.5 菌株JE53 對梨果實TA 含量的影響 由圖7 所示，隨著貯藏期延長，梨果實TA 含量整體呈下降趨勢。與CK 組相比，JE53 處理組TA 含量下降速率平緩，1-MCP 組次之。第15 d 時，JE53 處理組的TA含量為0.067%，顯著高于CK 組的0.053%（P＜0.05）。結(jié)果表明，JE53 處理能有效減緩貯期梨果實TA含量的下降。

圖7 JE53 處理對香梨貯藏期間可滴定酸的影響Fig.7 Effect of strain JE53 on TA of pear fruit during storage

2.2.6 菌株JE53 對梨果實MDA 含量的影響 如圖8 所示，隨著貯藏時間的延長，香梨果實MDA 含量逐漸上升。CK 組上升速率最快，JE53 處理組上升速度最為平緩，1-MCP 組次之。貯藏末期，JE53 處理組MDA 含量（11.53 nmol/g）低于CK 組（14.68 nmol/g），且差異顯著（P＜0.05）。結(jié)果表明，JE53 處理可顯著降低梨果實MDA 含量的積累，抑制膜脂過氧化，提高梨果實的貯藏保鮮期。

圖8 JE53 處理對香梨貯藏期間丙二醛的影響Fig.8 Effect of strain JE53 on MDA of pear fruit during storage

2.2.7 菌株JE53 對梨果實AsA 含量的影響 由圖9 可知，在貯藏期間各處理組梨果實AsA 含量呈下降趨勢，但JE53 處理組梨果實AsA 含量始終高于CK 組。第15 d 時，JE53 處理組梨果AsA 含量（209.23 μg/g）為CK 組含量（164.86 μg/g）的1.27 倍，且差異顯著（P＜0.05）。這與MDA 測定結(jié)果相對應(yīng)，JE53 處理降低果實中MDA 的積累，因此消耗了更少的AsA，而CK 組果實脂質(zhì)過氧化較為嚴(yán)重，導(dǎo)致?lián)p耗更多的AsA。結(jié)果表明，JE53 處理可顯著降低梨果AsA 含量的下降。

圖9 JE53 處理對香梨貯藏期間抗壞血酸的影響Fig.9 Effect of strain JE53 on AsA of pear fruit during storage

2.3 拮抗菌對香梨果實生理特性的影響

2.3.1 菌株JE53 對梨果實PPO 活性的影響 由圖10 可知，在貯藏過程中，處理組與對照組PPO 活性的變化趨勢基本一致，總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。第0～6 d，各處理梨果實PPO 活性均緩慢升高，1-MCP組PPO 活性高于JE53 處理組和CK 組，但差異不顯著（P＞0.05）。第6～15 d，各處理梨果實 PPO 活性均呈下降趨勢，JE53 處理組與對照組組間差異不顯著（P＞0.05）。結(jié)果表明，JE53 處理對梨果實貯期PPO活性無顯著影響。

圖10 JE53 處理對香梨PPO 活性的影響Fig.10 Effect of strain JE53 on PPO of pear fruit during storage

2.3.2 菌株JE53 對梨果實POD 活性的影響 由圖11 可知，在貯藏期間，JE53 處理組梨果實POD 活性始終顯著高于對照組（CK 組和1-MCP 組）；第0～6 d，JE53 處理組POD 活性逐漸上升，第6 d 時POD 活性達(dá)375.87 U/g，隨后逐漸下降。貯藏末期，JE53 處理組梨果實POD 活性為273.87 U/g，為1-MCP 組（190.57 U/g）的1.44 倍，為CK 組（98.37 U/g）的2.78 倍。由此可見，JE53 處理能夠誘導(dǎo)果實更高的POD 活性，并減緩其下降速度，從而提高果實抗氧化能力。

圖11 JE53 處理對香梨POD 活性的影響Fig.11 Effect of strain JE53 on POD of pear fruit during storage

2.3.3 拮抗菌對香梨CAT 活性的影響 如圖12 所示，在貯藏過程中，各處理梨果實CAT 活性隨貯藏時間呈先升高后下降的趨勢，但JE53 處理組CAT 活性始終高于對照組（CK 組和1-MCP 組）。第15 d 時，JE53 處理組CAT 活性（62.87 nmol/min/g）較CK 組（43.08 nmol/min/g）高31.48%，且差異顯著（P＜0.05）。由此可見，JE53 處理能夠誘導(dǎo)果實產(chǎn)生更高的CAT 活性，以減緩果實發(fā)生氧化損傷。

圖12 JE53 處理對香梨CAT 活性的影響Fig.12 Effect of strain JE53 on CAT of pear fruit during storage

2.3.4 拮抗菌對香梨PAL 活性的影響 由圖13 可知，CK 組梨果實PAL 活性在0～3 d 逐漸上升，第3 d達(dá)到峰值（10.68 U/g）后開始下降；1-MCP 組PAL 活性在第6 d 達(dá)到最大值（12.26 U/g）后逐漸下降；而JE53 處理組梨果實PAL 活性在0～9 d 均呈現(xiàn)上升趨勢，第9 d 達(dá)到峰值（18.06 U/g）。第15 d 時，JE53處理組梨果實PAL 活性為11.87 U/g，為CK 組（6.55 U/g）的1.81 倍，為1-MCP 組（8.85 U/g）的1.34倍，且差異顯著（P＜0.05）。結(jié)果表明，JE53 處理有利于提高貯期梨果實PAL 活性。

圖13 JE53 處理對香梨PAL 活性的影響Fig.13 Effect of strain JE53 on PAL of pear fruit during storage

3 討論

香梨在采后貯藏期間易受病原菌侵染，導(dǎo)致果實腐敗變質(zhì)，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失；其中由互隔交鏈孢引起的黑斑病是其采后貯期的主要病害之一。目前香梨的采后防腐以化學(xué)手段為主，但其具有高殘留、污染環(huán)境等缺點(diǎn)；因此，微生物防腐正以其安全、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)逐漸成為果蔬采后防腐的研究熱點(diǎn)。本研究前期對庫爾勒香梨采后黑斑病進(jìn)行了拮抗菌篩選，通過平板對峙法獲得了一株對梨黑斑病菌具有顯著拮抗效果的菌株JE53，該菌可分泌纖維素酶、蛋白酶、葡聚糖酶，抑制梨黑斑病菌孢子萌發(fā)，還可造成菌絲畸形、表面粗糙、扭曲凹陷。本研究采用1-MCP 熏蒸處理作為試驗陽性對照，采用損傷接種病原菌方法評估拮抗菌JE53 對貯期梨果實的防腐效果。結(jié)果表明，拮抗菌JE53 可明顯抑制梨果實上病原菌菌絲生長。處理144 小時后，抑菌率只有30.73%，推測其可能是因為采取了損傷接種，破壞程度較高，同時人為接種病原菌濃度較高。在自然貯藏條件下，病原菌濃度相對較低，其抑菌效率應(yīng)可提升。

果實采后開始進(jìn)入成熟和衰老階段，這一過程涉及一系列復(fù)雜的生理生化反應(yīng)。拮抗菌處理后果實的品質(zhì)也是評價拮抗菌應(yīng)用前景的指標(biāo)之一[20,21]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)JE53 發(fā)酵液浸泡處理后，梨果實貯藏期間主要品質(zhì)指標(biāo)（色度、失重率、硬度、TSS、TA、AsA、MDA）均優(yōu)于CK 組，說明拮抗菌JE53 能夠較好保持果實采后貯藏品質(zhì)，這一結(jié)果與季小詩等[22]研究結(jié)果一致，他們報告了膜醭畢赤酵母GS-316 發(fā)酵液處理能夠降低冬棗失重率升高速率、抑制可滴定酸含量和VC 含量的下降。推測拮抗菌可能在梨果實表面形成一層保護(hù)膜，以減少果實水分及營養(yǎng)的損耗，從而延長貯藏期。

另外，大量研究表明，抗氧化防御系統(tǒng)對果實采后貯藏過程中的軟化、變質(zhì)、衰老、腐敗等起到至關(guān)重要的作用[23]。其中，抗氧化能力不足是導(dǎo)致果實品質(zhì)劣變的關(guān)鍵因素。果蔬中的抗氧化酶主要包括POD、CAT 等，它們參與清除果實中過量的過氧化氫、ROS 和自由基，減輕果實的氧化損傷和衰老[24]。PAL 是與抗病相關(guān)的酶，在植物的正常生長發(fā)育和抵御病原體入侵方面發(fā)揮著重要作用[25]。越來越多的研究表明，貯藏期間果肉實品質(zhì)與果實后熟過程中酶活力的變化密切相關(guān)，抗氧化能力能力的提高有助于維持香梨、棗果[8]、杏子等果實品質(zhì)、延緩衰老并延長保質(zhì)期[26]。Cheng 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，棗果的可溶性固形物、硬度的保持可能與1-MCP 和殼聚糖的聯(lián)合處理對POD、SOD、CAT、APX 等抗氧化防御酶活性的提高及PPO 和LOX 的活性的抑制有關(guān)。如研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯萬芽孢桿菌B.velezensisBG-2 處理可以延緩甜瓜失重率上升，抑制果實硬度和果皮色度的下降，減少TSS、TA 和AsA 的損耗，這可能與甜瓜果實內(nèi)POD、PAL 等防御相關(guān)酶活性的提高相關(guān)[27]。本研究中，拮抗菌發(fā)酵液處理對PPO 活性無顯著影響，但可顯著提高梨果實中POD、CAT 和PAL 活性。由此推論，拮抗菌JE53 對梨果實的防腐作用可能與此類抗氧化防御酶活性的提高有關(guān)。

本研究表明，拮抗菌JE53 發(fā)酵液能有效控制梨黑斑病菌在梨果實上的生長，能夠降低果實失重率，延緩果皮色度及硬度的下降，減緩TSS 和TA 含量的下降，減少M(fèi)DA 含量的積累及AsA 的損耗，維持香梨果實貯藏品質(zhì)；此外，JE53 能夠提高梨果實抗氧化酶POD、CAT、PAL 活性，更有利于果實的貯藏保鮮。綜上所述，菌株JE53 對香梨具有良好的保鮮效果，可以作為香梨采后防腐保鮮的菌種資源。