西瓜枯萎病生防菌的分離鑒定及其生防潛力研究

許配玲，韓文心，王 剛，陳 雯，高鴻姍，呂明慧，楊項(xiàng)明，朱彥澤，蔣春號

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，南京 210095）

隨著西瓜種植面積的增加和連茬耕作，西瓜上的病害也在逐漸加重，其中西瓜枯萎病是最為嚴(yán)重的西瓜病害之一，在西瓜的整個(gè)生育期都可發(fā)病[1]?？菸⊥ǔＪ怯杉怄哏牭毒鶩usariumoxysporum引起的一種土傳性病害，也可稱死秧病，或萎蔫病[2]，可造成西瓜產(chǎn)量下降，嚴(yán)重時(shí)甚至絕產(chǎn)，給西瓜生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失和資源浪費(fèi)[3]。目前，使用有益微生物和拮抗菌對西瓜枯萎病進(jìn)行防治是一種高效兼環(huán)境友好型的生物防治方法，具有較大的應(yīng)用潛力。

幾丁質(zhì)，俗稱甲殼素，廣泛存在于微生物、植物及動物個(gè)體中，是真菌、藻類的細(xì)胞壁及蝦、蟹、昆蟲等動物外殼的主要組成成分[4]。幾丁質(zhì)酶是一種能夠?qū)锥≠|(zhì)徹底降解為N-乙酰氨基葡萄糖單體或寡聚體的糖苷水解酶[5]，能夠直接降解真菌細(xì)胞壁的主要組分之一—幾丁質(zhì)，使菌絲生長受阻。植物真菌病害一直是影響我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和食品安全的重要問題。化學(xué)殺菌劑的使用帶來了嚴(yán)重的環(huán)境問題。因此，越來越多的人將目光投向了生物防治。大多數(shù)植物病原真菌的細(xì)胞壁中主要成分為幾丁質(zhì)，這就使幾丁質(zhì)酶活性菌成為了潛在的抗真菌生防菌株。

細(xì)菌是幾丁質(zhì)酶的重要來源，已被鑒別的幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌主要包括氣單胞菌屬Aeromonas[6]、沙雷氏菌屬Serratia[7]、腸桿菌屬Enterobacter[8]、鏈霉菌屬Streptomyces[9]、芽胞桿菌屬Bacillus[10]和弧菌屬Vibrio[11]等。已有研究表明幾丁質(zhì)酶活性菌對多種病原真菌都具有一定的抑制活性，能作為較好的生物防治劑，王巧貞等從茅尾海紅樹林桐花樹根際土壤中篩選幾丁質(zhì)酶活性菌，獲得3 株芽胞桿菌、1 株胞囊桿菌和1 株鏈霉菌，對芬芳鐮刀菌Fusariumredolens、藤黑鐮孢菌Fusariumfujikuroi、腐皮鐮刀菌Fusariumsolani三種病原菌都具有一定的抑制活性[12]，其他細(xì)菌如沙雷氏菌屬Serratia[13]和假單胞菌屬Pseudomonas[14]等微生物產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶也被報(bào)道具有拮抗致病性真菌的作用。

紅樹林是指分布在沿海潮間帶和入海河口以紅樹科植物為主體的常綠灌木或者喬木組成的潮灘濕地木本植物群落[15]。紅樹林地理位置和生態(tài)環(huán)境的特殊性造就微生物的復(fù)雜多樣性，這些微生物可以產(chǎn)生新穎性的活性成分[16,17]，包括來源于幾丁質(zhì)降解菌的幾丁質(zhì)酶。

本研究從廣東珠海紅樹林根際土中分離篩選到 1 株對西瓜枯萎病菌拮抗作用顯著的放線菌PL-29 菌株，通過形態(tài)特征、生理生化測定和分子生物學(xué)鑒定，明確了菌株P(guān)L-29 的分類地位，并對該菌株的防治效果及其作用機(jī)制進(jìn)行了初步研究，探究其作為生防菌的潛在價(jià)值，以期為其生防菌劑的開發(fā)及其對西瓜枯萎病菌的防治提供了理論依據(jù)，也為豐富紅樹林土壤來源的農(nóng)業(yè)生防菌株資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試土壤樣品采集自廣東省珠海市淇澳島紅樹林木欖根際土、桐花樹根際土、銀葉樹根際土、楊葉肖槿根際土、鹵蕨根際土、海漆根際土，廣東省珠海市橫琴濱海土樣，廣東省珠海市三灶海濱土，廣東省珠海市三灶紅樹林海麻根際土。

供試菌株：尖孢鐮刀菌西瓜?；虵usariumoxysporumf.sp.niveum、禾谷鐮刀菌F.graminearum、辣椒疫霉Phytophthoracapsici、灰葡萄孢Botrytiscinerea、立枯絲核菌Rhizoctoniasolani和瓜類蔓枯病菌Didymellabryoniae，均由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生物農(nóng)藥及綠色植物保護(hù)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 幾丁質(zhì)酶活性生防菌的分離純化

對每份樣品稱取碎土3 g，裝入50 mL無菌離心管中，加入27 mL無菌水，手動混勻后置于搖床以200 r/min的轉(zhuǎn)速震蕩0.5 h，取出后靜置5 min，用無菌水稀釋濃度梯度分別為 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。將10-3～10-6三個(gè)濃度梯度的溶液取100 μL 均勻涂布在膠體幾丁質(zhì)為唯一碳源的培養(yǎng)基上，每個(gè)濃度梯度平板3 個(gè)重復(fù)，28 ℃下培養(yǎng)48 h 后，挑取不同形態(tài)特征的單菌落進(jìn)行多次純化，純化后的單菌落細(xì)菌懸浮于80%的甘油中，置-80 ℃超低溫冰箱中保存、備用。

1.3 幾丁質(zhì)酶活性測定

膠體狀幾丁質(zhì)的制備：20 g 甲殼素溶于350 mL 濃鹽酸，4 ℃放置24 h，玻璃棉過濾，濾液加入2 L冰無水乙醇（-20 ℃過夜），10000 r/min 離心20 min，沉淀用自來水沖洗，直至pH 值為中性，冷凍干燥，-20 ℃密封保存。使用時(shí)，膠體狀幾丁質(zhì)必須用手動勻漿器至少研磨5 次。

膠體狀幾丁質(zhì)為唯一碳源的培養(yǎng)基（Chi-Ayers）：（NH4H2PO41.0 g，KCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，膠體狀幾丁質(zhì)1%（w/v），定容至1000 mL，pH 值=7.0，瓊脂20 g），在培養(yǎng)基平板上放入滅過菌的濾紙片，兩側(cè)濾紙片點(diǎn)懸浮好的菌液，另外兩側(cè)點(diǎn)無菌水作為對照，重復(fù)3 次，28 ℃培養(yǎng)5 d 后觀察有無透明圈，測量透明圈的內(nèi)徑和外徑[18]。

1.4 幾丁質(zhì)酶活性生防菌的篩選

采用平板對峙培養(yǎng)法，以西瓜枯萎病菌尖孢鐮刀菌西瓜?；蜑榘袠?biāo)菌，對上述篩選得到的具有幾丁質(zhì)酶活性的菌株進(jìn)行復(fù)篩。用5 mm 打孔器取靶標(biāo)菌菌餅接種到WA 培養(yǎng)基中央，用槍頭挑取細(xì)菌單菌落在距病原菌菌餅約2 cm 處劃兩條平行線，以無菌水為對照，重復(fù)3 次，于25 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，觀察并記錄試驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)利用實(shí)驗(yàn)室保存的禾谷鐮刀菌、辣椒疫霉、灰葡萄孢、立枯絲核菌、瓜類蔓枯病菌5 種病原菌對菌株進(jìn)行廣譜抑菌能力的測定。

1.5 幾丁質(zhì)酶活性菌株的鑒定

生理生化鑒定：根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》對菌株進(jìn)行生理生化測定。測定的生理生化特性包括：碳源利用試驗(yàn)、M.R.試驗(yàn)、V.P.試驗(yàn)、硫化氫生成、硝酸鹽還原、明膠液化、過氧化氫酶、淀粉酶試驗(yàn)[19]，每組試驗(yàn)3 個(gè)重復(fù)。

分子鑒定：利用16S rDNA 通用擴(kuò)增引物（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn)行菌落PCR。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，35 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。將獲得的PCR 產(chǎn)物送至南京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序，將測得序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST 比對分析，并從GenBank數(shù)據(jù)庫獲得同源性高的相關(guān)菌株的基因序列，利用MEGA 11 軟件進(jìn)行序列多重比對，采用鄰接法（Neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，最終確定菌株的分類地位。

1.6 10 株菌株對西瓜枯萎病的室內(nèi)盆栽防效測定

選擇健康飽滿的西瓜種子催芽，將出芽一致的西瓜種子播種于裝有無菌土壤盆砵中，待西瓜長出兩片真葉時(shí)進(jìn)行處理，采用灌根法，將懸浮好的1×108CFU/mL 的菌液緩慢灌入西瓜根莖周圍，每盆接種20 mL，其中以清水作為對照，接種菌液后1～2 d 盡量不澆水,5 d 后澆灌1×107CFU/mL 的尖孢鐮刀菌孢子懸浮液，每株20 mL。試驗(yàn)重復(fù)3 次，30 d 后調(diào)查統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況，并計(jì)算枯萎病病情指數(shù)和防治效果。參照徐敬華等[20]方法對病情分級，0 級：無病狀；1 級：葉片或莖部萎蔫面積占全株的1/4 或不到1/4；2 級：葉片或莖部萎蔫面積占全株的1/2；3 級：葉片或莖部萎蔫面積占全株的3/4；4 級：整株萎蔫死亡。病情指數(shù)＝Σ（病級數(shù)×該病級植株數(shù)）/（最大病級數(shù)×植株總株數(shù)）×100，防治效果（%）＝（對照組病情指數(shù)－處理組病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100。

1.7 10 株菌株對西瓜的促生作用測定

等到西瓜長出兩片真葉時(shí)進(jìn)行澆灌處理，將懸浮好的1×108CFU/mL 菌液緩慢灌入西瓜根莖周圍，每株20 mL，其中以清水作為對照。接種菌液后1～2 d 盡量不澆水，此后常規(guī)澆水15 d 后重復(fù)澆灌處理一次。試驗(yàn)重復(fù)3 次，生防菌處理30 d 后，統(tǒng)計(jì)各處理植株的株高、莖粗、葉片數(shù)和葉綠素含量，小心剔除根部土壤，清洗干凈后，自然風(fēng)干，測定植株鮮重，60 ℃烘干48 h 后測植株干重。

1.8 菌株P(guān)L-29 對病原菌菌絲形態(tài)的影響

采用平板對峙法，將菌株P(guān)L-29 發(fā)酵液與尖孢鐮刀菌共培養(yǎng)于PDA 培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)基距中央二分之一處插入滅菌的載玻片，待菌絲長至載玻片上時(shí)，顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)[21]，重復(fù)3 次。

1.9 菌株P(guān)L-29 對病原菌孢子萌發(fā)的影響

取40 μL 過夜培養(yǎng)的菌株P(guān)L-29 發(fā)酵液10 倍稀釋液于滅菌凹玻片中，以加入清水作為對照，隨后加入40 μL 尖孢鐮刀菌孢子懸浮液，混勻。25 ℃恒溫培養(yǎng)，當(dāng)對照處理的孢子萌發(fā)率達(dá)到90%左右時(shí)，調(diào)查孢子萌發(fā)情況，計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率，抑制率（%）＝（對照組孢子萌發(fā)數(shù)－發(fā)酵液處理組孢子萌發(fā)數(shù)）/對照組孢子萌發(fā)數(shù)×100，調(diào)查孢子總數(shù)為200 個(gè)，重復(fù)3 次[22]。

1.10 菌株P(guān)L-29 對病原菌細(xì)胞膜完整性的影響

綠豆培養(yǎng)基中按1∶100 比例加入菌株P(guān)L-29 發(fā)酵液和菌絲懸液，在25 ℃下孵育12 h。收集菌絲于2 mL離心管內(nèi)，棄上清，沉淀用1 mL PBS 重懸，加入5 μL PI 染色液。冰浴或4 ℃孵育20～30 min。檢測前離心沉淀，用PBS 洗滌一次，重懸，制成玻片于熒光顯微鏡下觀察熒光情況[23]，重復(fù)3 次。

1.11 菌株P(guān)L-29 對病原菌菌絲內(nèi)ROS 積累的影響

綠豆培養(yǎng)基中按1∶100 比例加入菌株P(guān)L-29 發(fā)酵液和菌絲懸液，在25 ℃下孵育12 h。收集菌絲于2 mL離心管內(nèi)，棄上清，沉淀用1 mL PBS 重懸，加入1 μL DCFH-DA，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育30 min。每隔3～5 min 顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸，檢測前離心沉淀，用PBS 洗滌兩次，重懸，制成玻片于熒光顯微鏡下觀察熒光情況[24]，重復(fù)3 次。

1.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2016 對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)算病情指數(shù)和相對防效，利用DPS 對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素分析，采用Duncan 新復(fù)極差檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較（P＜0.05）檢驗(yàn)差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 幾丁質(zhì)酶活性生防菌的分離純化

從廣東省珠海市淇澳島紅樹林根際土土壤中共分離得到1000 余株菌株，通過測定幾丁質(zhì)酶活后篩選得到32 株菌株（圖1），其中菌株P(guān)L-29 透明圈半徑為2.30 mm，菌株P(guān)L-70 幾丁質(zhì)酶活性最高，透明圈半徑達(dá)8.10 mm（表1）。

表1 幾丁質(zhì)酶活性測定結(jié)果Table 1 The Determination of chitinase activity

圖1 幾丁質(zhì)酶活性測定Fig.1 Determination of chitinase activity

2.2 幾丁質(zhì)酶活性生防菌的篩選

平板拮抗試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株P(guān)L-25、PL-28、PL-29、PL-53、PL-80 和PL-86 都對西瓜枯萎病菌有較好的拮抗作用，其中菌株P(guān)L-29 對西瓜枯萎病菌的拮抗能力最強(qiáng)，抑菌帶寬度為11.3 mm，除了對西瓜枯萎病菌具有良好的拮抗活性外，對供試的5 種其他植物病原真菌也有不同程度的拮抗活性。與菌株P(guān)L-25、PL-28、PL-29、PL-53、PL-80 和PL-86 相比，幾丁質(zhì)酶活效果較好的菌株P(guān)L-34、PL-65、PL-66 和PL-70拮抗效果不明顯（圖2）。

圖2 幾丁質(zhì)酶活性菌株對病原真菌平板拮抗Fig.2 Plate antagonism of chitinase active strains against pathogenic fungi

2.3 幾丁質(zhì)酶活性菌株的鑒定

生理生化特性：菌株P(guān)L-29 能利用葡萄糖、乳糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、阿拉伯糖、L-酪氨酸，不能利用D-核糖、甘氨酸、蔗糖（表2）；能使硝酸鹽還原，明膠液化，生成H2S，不能使淀粉水解，VP 試驗(yàn)和接觸酶試驗(yàn)陽性，MR 試驗(yàn)陰性（表3）。

表2 幾丁質(zhì)酶活性菌株碳氮源利用特征Table 2 Carbon and nitrogen source utilization characteristics of chitinase active strains

表3 幾丁質(zhì)酶活性菌株生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of chitinase active strains

分子鑒定：菌株P(guān)L-29 的16S rDNA 基因片段測序后得到全長為1356 bp 的序列（GenBank 登錄號：OR574255），將測得序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行BLAST 比對分析，發(fā)現(xiàn)與PL-29 同源性較高的菌株均屬于鏈霉菌屬，選取并下載同源性高的模式菌株或代表菌株的16S rDNA 序列作為參比對象，利用MEGA11 軟件的鄰接法（Neighbor Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。結(jié)果表明，菌株P(guān)L-29 的16S rDNA 序列與黃三素鏈霉菌Streptomycesflavotricini聚在同一個(gè)分支，由此，將菌株P(guān)L-29鑒定為黃三素鏈霉菌。

圖3 基于 16S rDNA 基因序列構(gòu)建的菌株P(guān)L-29 的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The phylogenetic tree of strain PL-29 based on the sequence of 16S rDNA

結(jié)合生理生化特性和16S rDNA 基因序列分析，最終將菌株P(guān)L-28、PL-53、PL-80、PL-86 鑒定為S.flavotricini，菌株P(guān)L-25 鑒定為S.andamanensis，菌株P(guān)L-34 鑒定為Stenotrophomonasmaltophilia，菌株P(guān)L-65鑒定為S.tanashiensis，菌株P(guān)L-66 鑒定為Microbacteriumradiodurans，菌株P(guān)L-70 鑒定為Isoptericola jiangsuensis。

2.4 10 株菌株對西瓜枯萎病的室內(nèi)盆栽防效測定

盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，相對于對照組，這10 株菌株都有不同程度的防病效果（圖4）。由表4 可知，對照組病情指數(shù)高達(dá)84.03，菌株P(guān)L-25、PL-28、PL-29、PL-53、PL-80、PL-86 處理的西瓜病情指數(shù)分別為38.19%、40.28%、30.91%、42.36%、37.85%、39.24%，均顯著低于對照組，且對西瓜枯萎病的防治效果分別為54.49%、51.99%、63.11%、49.49%、54.88%、53.23%，其中菌株P(guān)L-29 處理組的病情指數(shù)最低，防治效果最好（表4）。

表4 10 株菌株對西瓜枯萎病的盆栽防治效果Table 4 The Effect of 10 strains on F.oxysporum f.sp.niveum in greenhouses

圖4 10 株菌株對西瓜枯萎病的盆栽防治效果Fig.4 The Effect of 10 strains on F.oxysporum f.sp.niveum in greenhouses

2.5 10 株菌株對西瓜的促生作用測定

盆栽促生試驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組相比，菌株P(guān)L-25、PL-28、PL-29、PL-53、PL-80、PL-86 對西瓜植株都有一定的促生作用，株高、莖粗、葉片數(shù)、鮮重、干重和葉綠素含量較常規(guī)對照組均有不同程度的提高（圖5）。由表5 可知，與對照相比，菌株P(guān)L-25、PL-28、PL-29、PL-53、PL-80、PL-86 處理的西瓜株高分別增長16.74%、19.23%、25.79%、14.03%、23.76%、26.92%，莖粗分別增長4.88%、2.44%、9.76%、4.88%、9.76%、12.20%，鮮重分別增長26.67%、37.98%、58.79%、52.53%、52.32%、62.02%，干重分別增長33.80%、38.03%、45.07%、32.39%、35.21%、52.11%。上述結(jié)果表明，菌株P(guān)L-29 對西瓜植株具有較好的促生效果（表5）。

表5 10 株菌株對西瓜的促生作用效果Table 5 The Growth promotion effect of 10 strains on watermelon

圖5 10 株菌株對西瓜的促生作用效果Fig.5 The Growth promotion effect of 10 strains on watermelon

2.6 菌株P(guān)L-29 對病原菌菌絲形態(tài)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明菌株P(guān)L-29 和尖孢鐮刀菌共培養(yǎng)5 d 后，與對照組相比，處理組菌絲在形態(tài)上沒有明顯變化，但是分生孢子的數(shù)量明顯減少（圖6）。菌株P(guān)L-29 與尖孢鐮刀菌共培養(yǎng)時(shí)，雖能明顯抑制菌絲的伸長，但對菌絲形態(tài)沒有明顯影響。

2.7 菌株P(guān)L-29 對病原菌孢子萌發(fā)的影響

結(jié)果顯示對照處理8 h 后，幾乎所有的尖孢鐮刀菌孢子均正常萌發(fā)，形成細(xì)長芽管，萌發(fā)率為90.33%。菌株P(guān)L-29 處理組的孢子萌發(fā)率為45.17%，抑制率為49.98%（表6），表明菌株P(guān)L-29 能夠抑制尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)，從而抑制病原菌的生長。

表6 菌株P(guān)L-29 對尖孢鐮刀菌孢子萌發(fā)的抑制作用Table 6 The Inhibition efficacy of strain PL-29 on spore germination of F.oxysporum f.sp.niveum

2.8 菌株P(guān)L-29 對病原菌細(xì)胞膜完整性的影響

用碘化丙啶（PI）進(jìn)行熒光染色，以檢查尖孢鐮刀菌膜完整性。碘化丙啶（PI）是一種不滲透膜的紅色熒光染料，對于具有完整細(xì)胞膜的正常細(xì)胞不能染色，而膜受損的細(xì)胞可以通過碘化丙啶（PI）進(jìn)行熒光染色，顯示紅色熒光。結(jié)果顯示對照組未檢測到明顯的熒光（圖7A），菌株P(guān)L-29 發(fā)酵液處理12 h 的尖孢鐮刀菌菌絲能發(fā)出明顯的紅色熒光（圖7B）。表明菌株P(guān)L-29 能破壞尖孢鐮刀菌細(xì)胞膜的完整性，引起菌絲細(xì)胞的凋亡。

圖7 菌株P(guān)L-29 對尖孢鐮刀菌菌絲細(xì)胞膜完整性的影響Fig.7 The Effect of Strain PL-29 on membrane integrity of mycelia of F.oxysporum f.sp.niveum

2.9 菌株P(guān)L-29 對病原菌菌絲內(nèi)ROS 積累的影響

利用DCFH-DA 檢測菌絲中ROS 的產(chǎn)生，DCFH-DA 本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜。進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH，而DCFH 不會通透細(xì)胞膜，細(xì)胞內(nèi)的活性氧能夠氧化無熒光的DCFH 生成有綠色熒光的DCF。結(jié)果顯示對照組只能發(fā)出微弱的綠色熒光(圖8A)，菌株P(guān)L-29 發(fā)酵液處理12 h 的尖孢鐮刀菌菌絲能發(fā)出明顯的綠色熒光(圖8B)，表明菌株P(guān)L-29 的處理可直接或間接導(dǎo)致尖孢鐮刀菌菌絲中ROS 的積累。

圖8 菌株P(guān)L-29 對尖孢鐮刀菌菌絲內(nèi)ROS 積累的影響Fig.8 The Effect of strain PL-29 on ROS accumulation in mycelium of F.oxysporum f.sp.niveum

3 討論

幾丁質(zhì)是真菌細(xì)胞壁的主要成分之一，很容易受到各種幾丁質(zhì)水解酶的影響。因此，幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)生在農(nóng)業(yè)中可作為一種有效的生物防治劑用于對抗許多植物病原真菌。產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶的微生物能夠通過分解幾丁質(zhì)抑制真菌病原體菌絲的生長，進(jìn)而降解細(xì)胞壁，破壞原生質(zhì)膜[24]，幾丁質(zhì)酶活性菌由于其功能多樣性，在生物防治中也發(fā)揮著越來越重要的作用，也具有重要的研究價(jià)值。

西瓜枯萎病是一種由半知菌亞門鐮孢屬尖孢鐮刀菌西瓜?；虵.oxysporumf.sp.niveum寄生引起的真菌性土傳病害[26]。目前針對西瓜枯萎病的防治方法主要有農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和生物防治等。生物防治因其使用有益微生物和拮抗菌對西瓜枯萎病進(jìn)行防治是一種高效兼環(huán)境友好型的防治方法，目前已成為新的研究熱點(diǎn)，本研究從廣東省紅樹林土壤中分離得到6 株拮抗效果好的鏈霉菌菌株，對禾谷鐮刀菌菌F.graminearum、辣椒疫霉P.capsici、灰葡萄孢B.cinerea等多種病原菌都具有一定的拮抗能力，其中菌株P(guān)L-29 能顯著促進(jìn)西瓜的生長提高對西瓜枯萎病的抗性，結(jié)合生理生化特性和16S rDNA 基因序列分析，最終將拮抗菌PL-29 鑒定為黃三素鏈霉菌S.flavotricini。對鏈霉菌的相關(guān)研究也表明鏈霉菌具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，孫于淼等[27]研究發(fā)現(xiàn)鏈霉菌5406 不僅對西瓜幼苗有明顯的促生作用，同時(shí)對西瓜枯萎病也有較好的抑制效果。張雨陽等[28]研究表明黃三素鏈霉菌發(fā)酵液具有廣譜抑菌活性，對芒果炭疽病病原菌等12種植物病原菌均有抑制效果。

在過去的幾十年里，放線菌一直是在醫(yī)療和農(nóng)業(yè)應(yīng)用中次生代謝產(chǎn)物和酶的生產(chǎn)中最廣泛利用的微生物群。放線菌特別是鏈霉菌是新型抗生素、酶、酶抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑和維生素的良好來源。紅樹林作為特殊的生態(tài)系統(tǒng)，具有鹽漬化、有機(jī)質(zhì)含量高、氧氣缺乏等特征，導(dǎo)致紅樹林生境中的放線菌形成了豐富的微生物類群和獨(dú)特的代謝途徑，代謝產(chǎn)物豐富[29]。研究發(fā)現(xiàn)紅樹林放線菌所產(chǎn)生的抗菌活性代謝產(chǎn)物包括大環(huán)內(nèi)脂類[30]、生物堿[31,32]、萜類[33]、酚類[34]、肽類[35]等。鏈霉菌產(chǎn)生的活性抑菌物質(zhì)在抵御病原菌方面也發(fā)揮著獨(dú)特的作用，研究表明鏈霉菌能通過分泌活性物質(zhì)雷帕霉素來抑制赤霉病菌菌絲生長，降低病菌致病力和真菌毒素的合成，干擾病菌的自噬平衡來控制病害[36]。本研究從紅樹林土壤中篩選得到的鏈霉菌PL-29 其發(fā)酵上清液對病原菌也具有較好的抑制效果，具有較大生防潛力，其抗菌活性代謝產(chǎn)物及其防病機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

對菌株P(guān)L-29 的作用機(jī)制進(jìn)一步研究表明，菌株P(guān)L-29 能抑制尖孢鐮刀菌孢子的產(chǎn)生及萌發(fā)，從而抑制病原菌的生長。此外，它還可以破壞質(zhì)膜完整性，誘導(dǎo)ROS 積累。Lin 等[37]的研究也表明鏈霉菌能導(dǎo)致病原菌膜完整性的喪失和活性氧（ROS）的積累。過量的ROS 積累會導(dǎo)致脂質(zhì)氧化損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞衰老死亡[23]，質(zhì)膜對于維持細(xì)胞形態(tài)和功能至關(guān)重要，鏈霉菌產(chǎn)生的納他霉素能破壞灰霉和擴(kuò)張青霉的質(zhì)膜，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)內(nèi)容物釋放，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[39,40]，鏈霉菌產(chǎn)生的雷帕霉素能通過調(diào)節(jié)灰霉菌的自噬活性和膜通透性來控制灰霉菌[23]。

綜上所述，菌株P(guān)L-29 可作為防治植物真菌病害的生防菌株且具有潛在的重要價(jià)值，對該菌株的分離鑒定和作用機(jī)制初步研究也為鏈霉菌后續(xù)的深入研究及其生防菌劑的開發(fā)及其對西瓜枯萎病菌的防治提供了理論依據(jù)，也為豐富紅樹林土壤來源的農(nóng)業(yè)生防菌資源提供參考。另外對于菌株P(guān)L-29 中次生代謝產(chǎn)物分離與活性測定、作用機(jī)制以及菌劑的開發(fā)等還有待進(jìn)一步研究。