哈茨木霉BWT1.221的固態(tài)發(fā)酵工藝條件優(yōu)化研究

謝小林，王 勇，陳 猛，周 蓮，李成江，劉玉敏，朱紅惠

（1.廣東省科學(xué)院微生物研究所/華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)微生物組學(xué)與精準應(yīng)用重點實驗室/廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室/廣東省微生物菌種保藏中心，廣州 510070；2.廣東博沃特生物技術(shù)有限公司，韶關(guān) 512026；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣州 510642）

木霉菌是一類廣泛分布于土壤和植物體的真菌，目前已報道的木霉菌超過250 個種[1]，據(jù)報道對18個屬29 種植物病原真菌有拮抗作用[2]，因其具有適應(yīng)性好、定殖能力強和生防效果突出等特點，在植物病害防治上有著巨大的生防應(yīng)用潛力[3-5]。常見生防木霉菌包括哈茨木霉T.harzianum、綠色木霉T.viride、擬康氏木霉T.pseudokoningii、棘孢木霉T.Asperellum和長枝木霉T.longibrachiatum等。

哈茨木霉作為一種目前在生物防治領(lǐng)域應(yīng)用廣泛的農(nóng)用微生物菌種，具有抑制由尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌和炭疽菌等造成枯萎病、腐爛病、炭疽病等常見植物病害的良好效果[6-11]。木霉防治植物病原菌的主要表現(xiàn)為搶占生態(tài)位點，重寄生作用，分泌抑菌次級代謝產(chǎn)物和穿透病原菌并汲取其營養(yǎng)[14-16]。近些年，由于化肥農(nóng)藥的過度使用，已造成水土污染、農(nóng)藥殘留和植物病害頻發(fā)的生態(tài)環(huán)境問題。生防微生物是一種改善土壤生態(tài)環(huán)境和防治植物病害的較好選擇[12,13]。哈茨木霉具有活性高、繁殖力強，價格低廉和生產(chǎn)方便的優(yōu)勢，在工業(yè)化生產(chǎn)上往往采用固態(tài)發(fā)酵方式來生產(chǎn)農(nóng)用微生物菌劑[17,18]。眾多學(xué)者對綠色木霉[19]、擬康氏木霉[20]、棘孢木霉[21,22]和長枝木霉[23,24]等常見木霉菌的固態(tài)發(fā)酵工藝水平研究的報道較多且技術(shù)相對成熟，而關(guān)于哈茨木霉固態(tài)發(fā)酵工藝條件優(yōu)化的研究報道相對較少，且總體發(fā)酵水平偏低，在工業(yè)化生產(chǎn)中往往存在菌種混亂、功能不強、雜菌率高和發(fā)酵水平低等凸出的問題，嚴重阻礙了其工業(yè)化生產(chǎn)。因此，獲得優(yōu)良的哈茨木霉生防菌種、簡易化操作程序和高水平發(fā)酵工藝對我國提高哈茨木霉工業(yè)規(guī)模化生產(chǎn)和促進農(nóng)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展有很大的幫助。

目前，工業(yè)化生產(chǎn)常用農(nóng)業(yè)廢棄物或農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品如麩皮、豆粕、谷殼、玉米粉、秸稈、果蔬殘渣等進行農(nóng)用微生物菌劑的固態(tài)發(fā)酵。王巧河等[25]以廢菌棒為主要基質(zhì)，主要成分為食用菌渣中的木材、麩皮和豆粕，通過固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化，有效提高哈茨木霉菌體數(shù)，優(yōu)化后的產(chǎn)量為5.91×109CFU/g。曾慶才等[26]以養(yǎng)豬墊料為發(fā)酵物，通過固態(tài)發(fā)酵對哈茨木霉進行了發(fā)酵條件優(yōu)化，產(chǎn)量達3.86×109CFU/g。張昊楠等[27]利用制藥污泥發(fā)酵哈茨木霉，優(yōu)化后發(fā)酵菌體數(shù)量為3.27×109CFU/g。上述研究主要集中在固態(tài)發(fā)酵后哈茨木霉的菌體數(shù)量上，發(fā)酵水平均不高（低于百億級），其中發(fā)酵菌物烘干前后菌體數(shù)量變化情況也并未作相關(guān)研究。本研究通過平板對峙實驗從番茄根際土壤分離篩選獲得一株生防哈茨木霉BWT1.221，從不同物料構(gòu)比、發(fā)酵條件方面進行了哈茨木霉的固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化，分析了哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵菌物烘干前后菌體有效活菌數(shù)及菌體數(shù)量占比，目的是提高哈茨木霉的固態(tài)發(fā)酵水平，有效延長哈茨木霉微生物菌劑的保存貨架期，以期為哈茨木霉工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)提供有力的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株：哈茨木霉BWT1.221 分離自番茄根際土壤，已保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，菌株保藏號為GDMCC No: 62833。

試劑：蔗糖、尿素、硫酸銨等試劑均為國產(chǎn)分析純（AR）；葡萄糖、蛋白胨、瓊脂等實驗試劑均為生化試劑（BR），采購于廣東環(huán)凱生物科技有限公司。麩皮、玉米粉、豆粕、黃豆粉和米糠均來自某糧食加工廠。

儀器：恒溫培養(yǎng)箱（SHP-080），廣東環(huán)凱生物科技有限公司；恒溫搖床（HZQ-X300C），上海一恒科學(xué)儀器有限公司；超凈工作臺（BSC-1304ⅡA2），蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；干燥烘箱（LDO-9246A），上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；小型粉碎機（FTT-2500T），東莞市房太電器有限公司；電子游標卡尺（MNT-150T），上海美耐特實業(yè)有限公司；電子天平（JJ200），常熟市雙杰測試儀器廠。

哈茨木霉培養(yǎng)基（PDA 培養(yǎng)基或斜面培養(yǎng)基，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉16～20 g，自然水1 L。

種子液培養(yǎng)基（PDB，馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，自然水1 L。

1.2 哈茨木霉BWT1.221 與植物病原菌的平板對峙試驗及抑制率測定

將哈茨木霉BWT1.221 與植物病原菌分別轉(zhuǎn)接于PDA 固體平板上，于恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃靜置培養(yǎng)5 d后，分別用打孔器（Φ=10 mm）沿菌落邊緣打1 塊菌餅，放入PDA 固體培養(yǎng)基中線對稱兩側(cè)（一個生防菌菌餅對應(yīng)一個病原菌菌餅），菌餅離PDA 培養(yǎng)基中線25 mm，共設(shè)置3 個重復(fù)處理，空白對照一側(cè)不接入哈茨木霉BWT1.221，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，測量對照與處理病原菌菌落直徑并計算哈茨木霉BWT1.221 拮抗植物病原菌的抑制率。

抑制率測定：參照文獻[28]方法測量。使用電子游標卡尺分別測定病原菌空白對照和各處理組病原菌菌落的直徑，每組重復(fù)測量3 次，菌落抑制率（%）＝（SCK-S1）/SCK×100，其中SCK 表示病原菌空白對照的直徑距離（mm），S1 表示PDA 平板接種有哈茨木霉BWT1.221 和病原菌中的病原菌直徑距離（mm）。

1.3 有效活菌數(shù)的計數(shù)方法

參照國家標準《GB 20287-2006 農(nóng)業(yè)微生物菌劑》進行有效活菌體計數(shù)測定。本文中哈茨木霉BWT1.221 的有效活菌數(shù)指的是能夠存活的哈茨木霉BWT1.221 總菌體數(shù)量，發(fā)酵菌物烘干前后菌體自定義為哈茨木霉BWT1.221 經(jīng)過固態(tài)發(fā)酵結(jié)束后在烘干前和烘干后的菌體。烘干前后哈茨木霉BWT1.221 的有效活菌數(shù)的測定方法為：準確稱取10.00 g 發(fā)酵烘干前后哈茨木霉BWT1.221 發(fā)酵物，裝入已經(jīng)高壓滅菌（121 ℃，30 min）載有90 mL 自然水、25 個直徑為0.5 cm 玻璃珠和0.1%吐溫80 的250 mL 三角瓶中，于200 r/min 恒溫搖床自然條件下充分振蕩30 min，獲得哈茨木霉BWT1.221 菌懸液（菌體充分打散），通過平板稀釋涂布方法計數(shù)有效活菌數(shù)，每個處理重復(fù)3 次。

1.4 哈茨木霉BWT1.221 的活化和種子液的制備

首先，將哈茨木霉BWT1.221 凍干管從保藏于4℃低溫冰箱中取出，移液槍吸取100 μL 無菌水于凍干管中溶解后，轉(zhuǎn)移至裝有PDA 培養(yǎng)基的平板中進行涂布，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h，進行菌體活化。待培養(yǎng)好后用打孔器打取菌餅，用接種環(huán)轉(zhuǎn)移至裝有PDA 培養(yǎng)基的平板上進行復(fù)壯（恢復(fù)真菌繁殖性能）培養(yǎng)48 h。然后，將復(fù)壯培養(yǎng)后的哈茨木霉BWT1.221 菌餅用接種環(huán)移至載有300 mL PDB 培養(yǎng)基的1 L 三角瓶中，于28 ℃、200 r/min 恒溫搖床中振蕩培養(yǎng)48 h，制備獲得種子液。

1.5 哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

1.5.1 不同物料成分 物料成分分別設(shè)為全部麩皮、麩皮∶玉米粉=1∶1、麩皮∶豆粕粉=1∶1、麩皮∶黃豆粉=1∶1、麩皮∶米糠=1∶1 和米糠∶玉米粉=1∶1。參照文獻[29]方法，即分別在500 mL 三角瓶中裝入以上不同物料成分，按初始料水比=1∶0.7 加入自然水，均勻混拌、潤料30 min，經(jīng)高壓滅菌冷卻后，添加5%哈茨木霉BWT1.221 種子液，充分搖蕩混合均勻后，靜態(tài)直立放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，待菌絲長滿后充分搖碎物料，繼續(xù)發(fā)酵2 d 后放倒平行培養(yǎng)（直立三角瓶傾斜90°進行培養(yǎng)，增加物料碎屑與哈茨木霉菌體的表面接觸），每個處理重復(fù)3 次，發(fā)酵7 d 后進行哈茨木霉BWT1.221 烘干前后菌體有效活菌數(shù)計數(shù)，菌體計數(shù)方法參照1.3（以下同）。

1.5.2 不同物料比例 以麩皮和玉米粉作為發(fā)酵基質(zhì)，麩皮:玉米粉的物料比例分別設(shè)為0.25∶1、0.5∶1、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1。按以上物料比例進行哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵，其中初始料水比為1∶0.7，然后參照1.5.1 所述方法（以下同），進行潤料、滅菌、搖碎、接菌、發(fā)酵和烘干粉碎，發(fā)酵7 d 后，測定烘干前后菌體有效活菌數(shù)，每個處理重復(fù)3 次。

1.5.3 不同料水比 料水比分別設(shè)為1∶0.4、1∶0.5、1∶0.6、1∶0.7、1∶0.8、1∶0.9、1∶1。按以上料水比進行哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵，其中麩皮∶玉米粉=0.25∶1，進行潤料、滅菌、搖碎、接菌、發(fā)酵和烘干粉碎，發(fā)酵7 d 后，測定烘干前后菌體有效活菌數(shù)，每個處理重復(fù)3 次。

1.5.4 速效碳源 速效碳源（蔗糖）比例分別設(shè)為0、1%、2%、3%、4%、5%、6%（占干物料比重）。按以上速效碳源（蔗糖）比例添加進行哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵，其中麩皮∶玉米粉=0.25∶1，料水比為1∶0.7，進行潤料、滅菌、搖碎、接菌、發(fā)酵和烘干粉碎，發(fā)酵7 d 后，測定烘干前后菌體有效活菌數(shù)，每個處理重復(fù)3 次。

1.5.5 速效氮源 速效氮源（尿素）比例分別設(shè)為0、0.1%、0.2%、0.5%，速效氮源（硫酸銨）比例分別設(shè)為0.1%、0.5%、1%、2%。上述速效氮源比例均為占干物料比重。按以上速效氮源（尿素）比例和速效氮源（硫酸銨）比例添加進行哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵，其中麩皮∶玉米粉=0.25∶1，料水比為1∶0.7，進行潤料、滅菌、搖碎、接菌、發(fā)酵和烘干粉碎，發(fā)酵7 d 后，測定烘干前后菌體有效活菌數(shù)，每個處理重復(fù)3 次。

1.5.6 發(fā)酵物料組成正交實驗 根據(jù)1.5.4 和1.5.5 單因素試驗結(jié)果，以哈茨木霉BWT1.221 烘干前后菌體有效活菌數(shù)作為考察指標，設(shè)計3 因素3 水平的正交實驗，共進行13 組（分組無重復(fù)），每組進行3 次重復(fù)實驗。正交實驗設(shè)計方案如表1 所示。

表1 發(fā)酵物料組成正交因子水平表Table 1 The composition factors of fermentation material

1.5.7 不同發(fā)酵溫度 發(fā)酵溫度分別設(shè)為22 ℃、25 ℃、28 ℃、31 ℃、34 ℃、37 ℃。按以上不同發(fā)酵溫度進行哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵，其中麩皮∶玉米粉=0.25∶1，料水比為1∶0.7，蔗糖為5%，尿素和硫酸銨分別為0.15%和0.8%，進行潤料、滅菌、搖碎、接菌、發(fā)酵和烘干粉碎，發(fā)酵7 d 后，測定烘干前后菌體有效活菌數(shù)，每個處理重復(fù)3 次。

1.5.8 不同發(fā)酵時間 發(fā)酵時間分別設(shè)為4、5、6、7、8、9 和10 d。按以上不同發(fā)酵時間進行哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵，其中麩皮∶玉米粉=0.25∶1，料水比為1∶0.7，蔗糖為5%，尿素和硫酸銨分別為0.15%和0.8%，發(fā)酵溫度為28 ℃，進行潤料、滅菌、搖碎、接菌、發(fā)酵和烘干粉碎，發(fā)酵7 d 后，測定烘干前后菌體有效活菌數(shù)，每個處理重復(fù)3 次。

1.6 發(fā)酵物烘干和粉碎參數(shù)

將充分發(fā)酵完畢后的哈茨木霉BWT1.221 潮濕發(fā)酵物經(jīng)恒溫烘箱烘干，烘干參數(shù)為：在28 ℃恒溫烘箱中烘干24 h；其后使用小型粉碎機將烘干后的發(fā)酵物進行粉碎，粉碎參數(shù)為：粉碎機轉(zhuǎn)數(shù)2000 r/min，每隔10 s 粉碎1 次，其間冷卻后繼續(xù)粉碎，共粉碎3 次。

1.7 發(fā)酵菌物烘干前后菌體數(shù)量占比

試驗中發(fā)酵菌物烘干前后菌體數(shù)量占比的定義為哈茨木霉BWT1.221 經(jīng)固態(tài)發(fā)酵結(jié)束后烘干粉碎的發(fā)酵菌體有效活菌數(shù)占烘干前發(fā)酵菌體（除去水分因素）有效活菌數(shù)的百分比。

發(fā)酵菌物烘干前后菌體數(shù)量占比（%）=[烘干后菌體有效活菌數(shù)（×109CFU/g）/烘干前菌體有效活菌數(shù)（×109CFU/g）]×[（1-烘干菌體含水比例（%））/（1-發(fā)酵物料含水比例）（%））]×（1-添加含水率）×100。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS v.19.0.1 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用One-way ANOVA 中Duncan 進行多種比較分析。采用SPSS v.19.0.1 進行正交設(shè)計和方差分析。采用OriginPro 2021 進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 哈茨木霉BWT1.221 對不同植物病原菌的抑制效果

通過平板對峙試驗，對病原菌直徑測量和抑制率計算（表2）結(jié)果表明，哈茨木霉BWT1.221 對常見的植物病原菌腐皮鐮刀菌、香蕉炭疽菌、立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌、禾谷鐮孢菌均具有抑制效果，其中哈茨木霉BWT1.221 對尖孢鐮刀菌和立枯絲核菌的抑制效果最好，分別為61.06%和60.87%，與其他病原菌均達差異性顯著（P＜0.05），對禾谷鐮孢菌的抑制效果相對較低。

表2 哈茨木霉BWT1.221 對不同植物病原菌的生長影響及抑制作用Table 2 Effect of T.harzianum BWT1.221 on growth and inhibition of plant pathogen

2.2 不同物料成分對哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵有效活菌數(shù)的影響

選取不同物料成分，比例均按1:1 混合進行固態(tài)發(fā)酵，結(jié)果表明麩皮和玉米粉混合物發(fā)酵效果最佳（如圖1），烘干前和烘干后有效活菌數(shù)分別為3.19×109和3.34×109CFU/g，與其他物料成分均達差異性顯著（P＜0.05），發(fā)酵菌物烘干前后菌體數(shù)量占比為61.59%；發(fā)酵效果最差的為單種物料麩皮，烘干前和烘干后有效活菌數(shù)分別為0.87×109和1.05×109CFU/g，但發(fā)酵菌物烘干前后菌體數(shù)量占比最高，為71.27%。

2.3 不同物料比例對哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵有效活菌數(shù)的影響

以麩皮和玉米粉作為基礎(chǔ)發(fā)酵物料，通過不同物料比例進行哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵結(jié)果如圖2，在麩皮:玉米粉=0.25:1 的比例下發(fā)酵效果最佳，烘干前和烘干后有效活菌數(shù)分別為4.00×109和4.28×109CFU/g，顯著高于其他物料比例處理（P＜0.05），發(fā)酵菌物烘干前后菌體數(shù)量占比為62.94%。

圖2 不同物料比例對哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵的影響Fig.2 Effects of different material proportions on solid fermentation of T.harzianum BWT1.221

2.4 不同料水比對哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵有效活菌數(shù)的影響

在一定的料水比例范圍內(nèi)，隨著料水比例的增加哈茨木霉BWT1.221 有效活菌數(shù)呈現(xiàn)先上升后降低的現(xiàn)象（圖3）。當料水比為1∶0.7 時發(fā)酵菌數(shù)最高，烘干前和烘干后有效活菌數(shù)分別為4.23×109和4.51×109CFU/g，與料水比為1∶0.8 時差異不顯著（P＞0.05），但與其他料水比均差異顯著（P＜0.05），發(fā)酵菌物烘干前后菌體數(shù)量占比為62.67%。

2.5 不同速效碳源（蔗糖）添加量對哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵有效活菌數(shù)的影響

速效碳源對哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵的影響結(jié)果如圖4 所示，在一定蔗糖添加量范圍內(nèi)隨著添加量的增加菌體數(shù)量不斷提高，當蔗糖添加量達到5%時開始緩慢提高，蔗糖添加量5%與6%之間菌體數(shù)量變化差異不顯著（P＞0.05），但與其他蔗糖添加量均呈差異性顯著（P＜0.05），烘干前有效活菌數(shù)分別為7.97×109和8.06×109CFU/g，烘干后分別為8.15×109和8.27×109CFU/g，發(fā)酵菌物烘干前后菌體數(shù)量占比分別為60.18%和60.33%。

圖4 速效碳源蔗糖對哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵的影響Fig.4 Effects of available carbon source on solid fermentation of T.harzianum BWT1.221

2.6 不同速效氮源（尿素和硫酸銨）添加量對哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵有效活菌數(shù)的影響

本試驗研究了速效氮源尿素和硫酸銨添加量對哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵的影響，結(jié)果表明（如圖5），菌體數(shù)量變化均隨尿素和硫酸銨添加量增加而呈先升高后下降趨勢。尿素添加量0.1%時烘干前和烘干后有效活菌數(shù)分別為4.50×109和4.85×109CFU/g，硫酸銨添加量1%時，烘干前和烘干后有效活菌數(shù)分別為5.87×109和6.18×109CFU/g，與其他尿素或硫酸銨添加量均呈差異性顯著（P＜0.05），發(fā)酵菌物烘干前后菌體數(shù)量占比分別為63.40%和61.93%；當尿素和硫酸銨添加量分別達0.2%、1%后烘干前后菌體有效活菌數(shù)和菌體數(shù)量占比均驟降，這說明在一定程度上高濃度速效氮源添加量會抑制哈茨木霉的生長。綜上，速效氮源尿素和硫酸銨的添加量分別為0.1%和1%。

圖5 速效氮源對哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵的影響Fig.5 Effects of available nitrogen source on solid fermentation of T.harzianum BWT1.221

2.7 發(fā)酵培養(yǎng)基組分正交實驗

通過對哈茨木霉BWT1.221 發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳氮源成分進行正交實驗結(jié)果表明（表3），最佳發(fā)酵組合為A2B3C1，即蔗糖添加量為5%，尿素添加量為0.15%，硫酸銨添加量為0.8%，菌體數(shù)量最高，烘干前和烘干后有效活菌數(shù)分別為10.20×109和10.78×109CFU/g，經(jīng)發(fā)酵菌體進行平板稀釋涂布后觀察不存在雜菌污染（雜菌率≤0.01%）。因此，添加適量碳氮源，有利于獲得最佳菌體有效活菌數(shù)量。

表3 發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗結(jié)果Table 3 Orthogonal test results of fermentation medium

2.8 不同發(fā)酵溫度對哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵有效活菌數(shù)的影響

發(fā)酵溫度是影響哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵的最關(guān)鍵因素之一。試驗結(jié)果表明（圖6），隨著發(fā)酵溫度的升高，烘干前后菌體有效活菌數(shù)和菌體數(shù)量占比均呈先上升后降低的趨勢，28 ℃時達到最高，與其他溫度變化均呈差異性顯著（P＜0.05），烘干前和烘干后菌體有效活菌數(shù)分別為9.74×109和10.17×109CFU/g，發(fā)酵菌物烘干前后菌體數(shù)量占比為61.42%。

圖6 不同發(fā)酵溫度對哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵的影響Fig.6 Effects of different fermentation temperatures on solid fermentation of T.harzianum BWT1.221

2.9 不同發(fā)酵時間對哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵有效活菌數(shù)的影響

發(fā)酵時間長短也會影響哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵水平。在一定時間范圍內(nèi)，哈茨木霉BWT1.221固態(tài)發(fā)酵烘干前后菌體有效活菌數(shù)和菌體數(shù)量占比均呈先升高后下降的趨勢（圖7），發(fā)酵第7 d 時，菌體生長狀態(tài)呈平穩(wěn)水平，而9 d 后其烘干前后菌體有效活菌數(shù)和菌體數(shù)量占比均呈下降趨勢。發(fā)酵7 d 的哈茨木霉BWT1.221 烘干前和烘干后有效活菌數(shù)分別為9.83×109和10.36×109CFU/g，發(fā)酵菌物烘干前后菌體數(shù)量占比為62.00%。在哈茨木霉固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)應(yīng)用中，綜合考慮木霉產(chǎn)量和發(fā)酵成本，選擇7 d 作為一個發(fā)酵周期。

圖7 不同發(fā)酵時間對哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵的影響Fig.7 Effects of different fermentation time on solid fermentation of T.harzianum BWT1.221

3 討論

哈茨木霉作為具有拮抗尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌和炭疽菌等常見植物病原菌優(yōu)越性能的生防菌種，廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物的病害防治。目前，由于市場上生防功能較強的哈茨木霉資源匱乏，所制備獲得的微生物菌劑中生防菌種存在功能弱、污染嚴重以及發(fā)酵水平低下等凸出問題，本研究通過平板對峙法篩選獲得一株生防菌株哈茨木霉BWT1.221，結(jié)合不同發(fā)酵物料和發(fā)酵條件進行單因素和正交實驗，研究了該菌株發(fā)酵條件優(yōu)化中烘干前后菌體有效活菌數(shù)及菌體數(shù)量占比的變化情況，旨在提高哈茨木霉的固態(tài)發(fā)酵水平和為工業(yè)規(guī)模化生產(chǎn)提供有力的科學(xué)數(shù)據(jù)參考。

功能微生物的固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化對于生防菌株在工業(yè)化生產(chǎn)的高量擴繁和節(jié)本增效方面具有重要意義。發(fā)酵物料及培養(yǎng)條件的優(yōu)化是生防菌株固態(tài)發(fā)酵的關(guān)鍵步驟。在哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵過程中，發(fā)酵物料的選擇對發(fā)酵水平有較大的影響，本研究采用來源廣泛、價格低廉和營養(yǎng)豐富[30]的麩皮、玉米粉等可利用農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品作為發(fā)酵基質(zhì)，經(jīng)過固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化后菌體數(shù)量提高3.23 倍，達到10.78×109CFU/g。與肖榮鳳等[31]利用養(yǎng)豬墊料及張昊楠等[27]利用制藥污泥進行哈茨木霉固態(tài)發(fā)酵的來源完全不同，其最終發(fā)酵的菌體數(shù)量分別為（4.33～4.46）×108和3.27×109CFU/g，明顯低于本研究發(fā)酵水平。王永東等[30]研究結(jié)果表明利用麩皮和玉米粉發(fā)酵哈茨木霉的最佳比例為3:1，與本研究最佳發(fā)酵比例不同，這可能是物料屬性（粗細、含水量等）、菌株特性和原料搭配等原因?qū)е隆?/p>

從本研究中可以看出，不同發(fā)酵條件對哈茨木霉BWT1.221 發(fā)酵水平有很大的影響。料水比是固態(tài)發(fā)酵的關(guān)鍵因子，低水分和高水分均會影響哈茨木霉固態(tài)發(fā)酵烘干前后菌體有效活菌數(shù)和菌體數(shù)量占比。有研究表明，水分低時使得物料干燥無法滿足菌體萌發(fā)和菌絲的生長，高水分容易造成物料成團無法長透整體，不容易產(chǎn)孢[26]。碳氮源的添加對哈茨木霉固態(tài)發(fā)酵實現(xiàn)量產(chǎn)必不可少，碳源蔗糖和氮源尿素、硫酸銨均是市場上容易獲得的原料，王永東等[30]和茹水江[32]都認為蔗糖是哈茨木霉固態(tài)發(fā)酵最佳碳源，而且適當?shù)奶荚幢壤軌虼龠M菌體高產(chǎn)。氮源尿素和硫酸銨的添加量對哈茨木霉固態(tài)發(fā)酵的影響較大，適當?shù)奶砑幽軌虼龠M菌體生長，而過高的添加量則嚴重使得固態(tài)發(fā)酵烘干前后菌體有效活菌數(shù)和菌體數(shù)量占比驟降，這與周蓮等[29]對真菌固態(tài)發(fā)酵研究結(jié)果一致。低溫和高溫對哈茨木霉BWT1.221 固態(tài)發(fā)酵程度的影響巨大，低溫菌體生長較慢，分生孢子產(chǎn)生量低，造成整體發(fā)酵菌體數(shù)量偏低；高溫對菌體生長有抑制，由于生存環(huán)境產(chǎn)生逆境脅迫，大量菌體死亡，從而導(dǎo)致固態(tài)發(fā)酵烘干前后菌體有效活菌數(shù)和菌體數(shù)量占比也均呈現(xiàn)出較低的結(jié)果。隨著哈茨木霉固態(tài)發(fā)酵中生存空間，營養(yǎng)、水分及氧氣等生存物質(zhì)的不斷消耗，發(fā)酵到一定時間將不再繼續(xù)生長。在固態(tài)發(fā)酵過程中，由于純菌種單獨發(fā)酵，嚴格控制發(fā)酵技術(shù)參數(shù)，基本無雜菌污染（雜菌率低于0.01%）。

本研究前期工作僅進行了實驗室初期的哈茨木霉固態(tài)發(fā)酵工藝條件優(yōu)化，生長環(huán)境和營養(yǎng)條件均會產(chǎn)生影響。后期將集中對哈茨木霉高產(chǎn)分生孢子及抑菌物質(zhì)（次級代謝產(chǎn)物）的提取與分析進行相關(guān)研究，將在工廠發(fā)酵車間進行哈茨木霉固態(tài)發(fā)酵小、中試試驗以及在菌劑高塔噴霧和低溫超微粉碎技術(shù)實現(xiàn)突破，以期獲得產(chǎn)量大、貨架期長的生防微生物菌劑產(chǎn)品，為農(nóng)作物的生物防治提供技術(shù)支撐。