貝萊斯芽孢桿菌DPT-03 對花生白絹病菌的防控效果

彭啟超，黃德龍，張志鵬，，魏 浩，吳書鳳，吳 妍，李 俊，鄧祖科，王宗抗

（1. 北京世紀阿姆斯生物工程有限公司，北京 101200；2. 深圳市芭田生態(tài)工程股份有限公司，深圳 518105）

花生是我國主要的油料與經濟作物之一，在農業(yè)生產和社會生產中占據重要地位，但其生長易受到病蟲害的影響，其中白絹病對花生的危害更是呈逐年加重的趨勢[1?3]。在河南、山東、廣東、遼寧和江西等花生種植區(qū)域均因白絹病造成花生大面積不同程度的減產，嚴重阻礙了我國花生產業(yè)的發(fā)展[4]。

花生白絹病菌為半知菌亞門無孢菌目齊整小核菌（Sclerotium rolfsiiSacc），是一種寄主廣泛且危害嚴重的土傳性真菌[5?7]。目前，通過輪作、培育抗性品種以及使用化學藥劑防治和防控花生白絹病的效果并不理想，同時長期大量使用農藥造成土壤受到污染，農產品質量和安全性下降[8]。生物防治是農業(yè)綠色發(fā)展的重要方向，利用生防菌防治花生白絹病對花生生產具有重要意義[9?10]。

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）作為芽孢桿菌屬的一個新種，能夠產生多種抑菌活性物質，在防治黃瓜霜霉病、馬鈴薯瘡痂病和早疫病等方面具有較好的防效[11?13]。在花生病害防治上，臧超群等[14]研究表明，貝萊斯芽孢桿菌BP-1能有效抑制花生網斑病菌的生長，在田間試驗中對花生網斑病也表現(xiàn)出較好的防治效果；潘夢詩等[15]篩選分離的貝萊斯芽孢桿菌BS-01 能顯著抑制花生白絹病菌菌絲生長和菌核生成，在盆栽試驗中能明顯降低花生白絹病的病情指數。目前，關于貝萊斯芽孢桿菌對花生白絹病的防治研究相對較少，且僅局限于平板對峙和盆栽試驗，其對花生白絹病菌的平板抑制、盆栽和大田試驗防效的綜合研究尚未見報道。鑒于此，以北京世紀阿姆斯生物工程有限公司前期篩選分離得到的一株可抑制番茄灰霉病、番茄枯萎病和棉花枯萎病的貝萊斯芽孢桿菌（命名為DPT-03）為生防菌株，研究其對花生白絹病菌菌絲生長和菌核形成的抑制作用，并采用盆栽試驗和田間試驗探究了DPT-03 對花生白絹病的防控效果及對花生產量的影響，為花生白絹病生防制劑的研發(fā)及應用提供理論和實踐依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 花生白絹病菌菌株（Sclerotium rolfsiiSacc）由山東省花生研究所提供。貝萊斯芽孢桿菌DPT-03 菌株由北京世紀阿姆斯生物工程有限公司從土壤中分離并保存。

1.1.2 培養(yǎng)基配制 LB 培養(yǎng)基和PDA 培養(yǎng)基的配制參考方中達[16]的方法。

1.2 方法

1.2.1 DPT-03 菌懸液對花生白絹病菌菌絲生長的影響 將花生白絹病菌接種于PDA 培養(yǎng)基平板中央，28 ℃培養(yǎng)7 d，待病菌長滿平板后放于4 ℃冰箱備用。挑取貝萊斯芽孢桿菌DPT-03 單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，180 r/min、30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)24 h備用。將長滿花生白絹病菌的平板打孔取直徑7.5 mm 菌餅接種到PDA 平板中央，在距離平板中央20 mm處放置已滅菌的直徑為6 mm的濾紙片，加入10 μL 活 化 的DPT-03 菌 液，以 在 濾 紙 片 上 加 入10 μL LB 無菌培養(yǎng)液作為對照（CK），28 ℃恒溫培養(yǎng)，5 d 和20 d 時對抑菌情況進行統(tǒng)計，每個處理重復3 次。用十字交叉法測量菌落直徑，抑菌率＝（CK 菌落增長直徑－處理菌落增長直徑）/CK 菌落增長直徑×100%，菌落增長直徑（mm）=菌落直徑-7.5。

1.2.2 DPT-03 無菌發(fā)酵液對花生白絹病菌菌絲生長的影響 將菌株DPT-03 活化菌液10 000 r/min離心10 min 后收集上清液，用0.22 μm 濾膜過濾得到無菌發(fā)酵液。將無菌發(fā)酵液與加熱冷卻至50～55 ℃的PDA 培養(yǎng)基以1∶10 的比例混合后倒平板，以添加等量PDA 培養(yǎng)基的平板為對照（CK），在平板中央接入直徑為7.5 mm的白絹病菌菌餅，28 ℃恒溫培養(yǎng)，3次重復，5 d和20 d時統(tǒng)計抑菌情況。

1.2.3 DPT-03 揮發(fā)性氣體對花生白絹病菌菌絲生長的影響 參考張霞等[17]方法，在二分格培養(yǎng)皿兩側各倒入等體積的LB培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基一側用DPT-03 菌懸液畫線，PDA 培養(yǎng)基側中間位置接種直徑為7.5 mm 的白絹病菌菌餅，以無菌培養(yǎng)液劃線作為對照（CK），28 ℃恒溫培養(yǎng)，3 次重復，5 d和20 d時統(tǒng)計抑菌情況。

1.2.4 DPT-03 菌懸液、無菌發(fā)酵液、揮發(fā)性氣體對白絹病菌菌核生長的影響 將1.2.1、1.2.2 和1.2.3制備的對峙及CK 平板持續(xù)培養(yǎng)至30 d，統(tǒng)計菌核生長數量，3 次重復。菌核抑制率=（CK 菌核數量－處理菌核數量）/CK菌核數量×100%。

1.2.5 DPT-03 防控花生白絹病的盆栽試驗 菌株DPT-03 對花生白絹病的盆栽防治效果試驗于2020年5—8 月在北京世紀阿姆斯生物工程有限公司作物培養(yǎng)室進行，試驗共設4 個處理，每個處理5 盆花生，每盆1株，3次重復，試驗盆栽隨機擺放，每隔3 d更換擺放位置。處理1：接種白絹病原菌+灌根施用DPT-03 菌懸液（≥1.0×109cfu/mL）20 mL/盆；處理2：接種白絹病原菌+灌根施用DPT-03 無菌發(fā)酵液20 mL/盆；處理3：接種白絹病原菌+灌根施用24%噻呋酰胺（240 g/L 噻呋酰胺懸浮劑稀釋500 倍）20 mL/盆；處理4（CK）：接種白絹病原菌+灌根施用無菌水20 mL/盆。接種白絹病原菌即直接把病原菌菌餅接種到土壤中，2 d后將DPT-03菌懸液、無菌發(fā)酵液、噻呋酰胺和無菌水分別以灌根的方式施用到相應處理的土壤中，接種病原菌后每隔20 d 對花生白絹病發(fā)病情況進行調查。白絹病發(fā)病程度采用0～4級的分級標準：0級，無癥狀；1級，僅莖基部產生病害；2級，染病部位占整株的1/3以下；3級，染病部位占整株的2/3 以下；4 級，植株接近或已經死亡。統(tǒng)計各處理花生的發(fā)病率、病情指數和防治效果。

發(fā)病率=發(fā)病株數/調查總株數×100%，

病情指數=∑（各級發(fā)病株數×病級數）/（調查總株數×最高病級數）×100，

防治效果=（對照病情指數-處理病情指數）/對照病情指數×100%。

1.2.6 DPT-03 防控花生白絹病的田間試驗 田間試驗于2020 年6—10 月在河南省正陽縣袁寨鎮(zhèn)單茨園村進行，試驗田0～20 cm 耕層土壤養(yǎng)分含量為有機質11.78 g/kg、堿解氮61.56 mg/kg、速效磷29.63 mg/kg、速效鉀185.26 mg/kg，pH 值為6.21，供試土壤為砂姜黑土，連續(xù)多年花生重茬，白絹病發(fā)病嚴重。供試花生品種為遠雜9102，225 000穴/hm2，每穴2株。試驗分3 個處理：處理1，DPT-03菌懸液（1×109cfu/mL）150 L/hm2，翻地前用農用噴霧器一次性噴入土壤；處理2，于花生苗期（7 月15 日）采用240 g/L噻呋酰胺懸浮劑噴淋花生根莖部，用藥量為900 mL/hm2，用水量1 500 L/hm2；處理3，空白對照（CK）。試驗采用隨機區(qū)組排列，3 次重復，小區(qū)面積為30 m2（5 m×6 m）。播種后第45 天和第90天調查花生感染白絹病的情況，每處理小區(qū)對角線5 點取樣，每點15 穴（30 株），統(tǒng)計各處理發(fā)病株數，計算防效?；ㄉ斋@時（10 月2 日），各小區(qū)5 點取樣，每點4株，曬干莢果后測定花生產量。

發(fā)病率=發(fā)病株數/調查總株數×100%，

防治效果=（CK 病株率-處理區(qū)病株率）/CK 病株率×100%。

1.3 數據處理

采用Excel 2010 軟件和SPSS 20.0 進行數據的統(tǒng)計和分析。

2 結果與分析

2.1 DPT-03菌懸液對花生白絹病菌菌絲生長的影響

在平板對峙試驗中，貝萊斯芽孢桿菌DPT-03菌懸液對花生白絹病菌菌絲生長具有顯著的抑制效果（圖1）。由圖2 可見，培養(yǎng)5 d 時DPT-03 菌懸液處理的白絹病菌菌落增長直徑為8.49 mm，而CK增長直徑為29.68 mm，DPT-03 菌懸液對白絹病菌菌絲生長的抑制率達到71.39%；持續(xù)培養(yǎng)至20 d時，DPT-03 菌懸液處理白絹病菌菌落增長直徑為10.28 mm，CK 增長直徑為80.43 mm，抑制率高達87.20%，且抑制率表現(xiàn)出一定的上升趨勢?？梢姡惾R斯芽孢桿菌DPT-03 菌懸液可以長效且穩(wěn)定抑制花生白絹病菌菌絲的生長。

圖1 DPT-03菌懸液對花生白絹病菌菌絲生長的抑制效果Fig.1 Inhibitory effect of suspension of strain DPT-03 on hyphae growth of Sclerotium rolfsii

圖2 DPT-03菌懸液對花生白絹病菌菌絲生長的影響Fig.2 Effect of suspension of strain DPT-03 on hyphae growth of Sclerotium rolfsii

2.2 DPT-03無菌發(fā)酵液對花生白絹病菌菌絲生長的影響

貝萊斯芽孢桿菌含有多種抗菌物質合成的關鍵基因，其代謝物中含有豐富的抗菌活性物質[18]。由圖3可以看出，DPT-03無菌發(fā)酵液對花生白絹病菌菌絲生長有一定的抑制效果。由圖4 可見，培養(yǎng)5 d 時DPT-03 無菌發(fā)酵液處理白絹病菌菌落增長直徑為12.77 mm，CK 菌落增長直徑為29.01 mm，DPT-03 無菌發(fā)酵液對花生白絹病菌菌絲生長的抑制率為55.98%；培養(yǎng)20 d 時DPT-03 無菌發(fā)酵液處理的白絹病菌菌落增長直徑為37.62 mm，CK 為80.50 mm，抑制率達到53.27%。

圖3 DPT-03無菌發(fā)酵液對花生白絹病菌菌絲生長的抑制效果Fig.3 Inhibition effect of sterile fermentation broth of strain DPT-03 on hyphae growth of Sclerotium rolfsii

圖4 DPT-03無菌發(fā)酵液對花生白絹病菌菌絲生長的影響Fig.4 Effect of sterile fermentation broth of strain DPT-03 on hyphae growth of Sclerotium rolfsii

2.3 DPT-03揮發(fā)性氣體對花生白絹病菌菌絲生長的影響

貝萊斯芽孢桿菌DPT-03 揮發(fā)性氣體對白絹病菌菌絲生長有一定的抑制作用，但效果不明顯（圖5）。由圖6 可見，培養(yǎng)5 d 時，DPT-03 處理白絹病菌菌落增長直徑為20.01 mm，CK 增長直徑為25.34 mm，DPT-03 揮發(fā)性氣體對白絹病菌菌絲生長抑制率為20.68%；培養(yǎng)20 d 時，菌株DPT-03 處理的白絹病菌菌落增長直徑為50.01 mm，CK 增長直徑為54.95 mm，抑制率僅為8.99%，具有一定的下降趨勢。從整體效果看，DPT-03 揮發(fā)性氣體對白絹病菌菌絲生長的抑制率不如其菌懸液和無菌發(fā)酵液高。

圖5 DPT-03揮發(fā)性氣體對花生白絹病菌菌絲生長的抑制效果Fig 5 Inhibitory effect of volatile gas of strain DPT-03 on hyphae growth of Sclerotium rolfsii

圖6 DPT-03揮發(fā)性氣體對花生白絹病菌菌絲生長的影響Fig.6 Effect of volatile gas of strain DPT-03 on hyphae growth of Sclerotium rolfsii

2.4 DPT-03菌懸液、無菌發(fā)酵液和揮發(fā)性氣體對花生白絹病菌菌核生長的影響

由表1可知，貝萊斯芽孢桿菌DPT-03的菌懸液和無菌發(fā)酵液均能顯著抑制白絹病菌菌核的形成。連續(xù)培養(yǎng)30 d，菌懸液處理的白絹病菌菌核數量平均是4.33 個，無菌發(fā)酵液處理菌核數量為10.33 個，均顯著少于其對照。菌懸液和無菌發(fā)酵液對白絹病菌菌核的抑制率分別高達88.51%和76.34%，而揮發(fā)性氣體對白絹病菌菌核的抑制率僅為10.67%，推測貝萊斯芽孢桿菌DPT-03 主要通過分泌抑菌活性物質減少白絹病菌菌核的形成。

表1 DPT-03菌懸液、無菌發(fā)酵液、揮發(fā)性氣體對花生白絹病菌菌核生長的影響Tab.1 Effect of DPT-03 suspension，sterile fermentation broth and volatile gas on sclerotia growth of Sclerotium rolfsii

2.5 DPT-03防控花生白絹病的盆栽試驗效果

菌株DPT-03 防控花生白絹病的盆栽試驗結果見表2，單獨接種白絹病原菌的花生植株發(fā)病較早，施用貝萊斯芽孢桿菌DPT-03 菌懸液、無菌發(fā)酵液和化學藥劑均可推遲花生白絹病的發(fā)病時間，降低病情指數。在接種白絹病原菌60 d 時，DPT-03 菌懸液處理防效達到62.50%，優(yōu)于噻呋酰胺藥劑處理（57.14%）和無菌發(fā)酵液處理（30.36%）。值得注意的是，無菌發(fā)酵液和化學藥劑處理對花生白絹病的防效隨時間延后均有一定下降趨勢，尤其無菌發(fā)酵液處理更為明顯，而DPT-03 菌懸液對花生白絹病的防效則表現(xiàn)為上升趨勢。

表2 DPT-03防控花生白絹病的盆栽試驗效果Tab.2 Prevention and control effect of strain DPT-03 on Sclerotium rolfsii in pot culture

2.6 DPT-03對花生白絹病的大田防效及對花生產量的影響

貝萊斯芽孢桿菌DPT-03 在田間防控花生白絹病中仍表現(xiàn)出較好的效果，能有效減少花生白絹病的發(fā)病株數。由表3 可見，播種后第45 天，防效為58.77%，略低于噻呋酰胺藥劑處理（59.78%），播種后第90 天防效為61.83%，高于噻呋酰胺藥劑處理（58.03%）。DPT-03 處理花生產量為5 233.67 kg/hm2，高于噻呋酰胺藥劑處理（5 122.22 kg/hm2）和空白對照（4 722.22 kg/hm2），DPT-03 處理花生產量較空白對照增產13.88%，高于噻呋酰胺處理的增產率（8.47%）。

表3 DPT-03對花生白絹病的大田防效及對花生產量的影響Tab.3 The effect of strain DPT-03 on field control of Sclerotium rolfsii and peanut yield

3 結論與討論

近年來，隨著花生種植業(yè)結構調整和耕作制度改變，花生白絹病對花生的危害逐年加重，嚴重影響花生的產量和收益[2]。生物防治具有安全、持效和環(huán)保特性，利用生物防治方法防控花生白絹病是目前的研究熱點之一[11]。貝萊斯芽孢桿菌是一種新型生防細菌，其代謝產物具有廣譜抑菌性，可抑制多種植物病原菌且能促進作物的生長，在生物防治方面具有很大的應用潛力[19?20]。

曹偉平等[21]篩選分離的貝萊斯芽胞桿菌Hsg1949對花生白絹病菌和果腐病致病鐮孢菌具有明顯的拮抗作用，在田間試驗中能顯著降低花生果腐病的發(fā)病率。潘夢詩等[15]篩選分離的貝萊斯芽孢桿菌BS-01 對花生白絹病菌具有很好的防控作用，其菌懸液和無菌發(fā)酵液均可顯著抑制白絹病菌菌絲的生長和菌核的形成。菌絲和菌核是白絹病菌繁衍和侵染花生的重要途徑[22]。本研究中，貝萊斯芽孢桿菌DPT-03 的菌懸液對白絹病菌菌絲生長和菌核形成具有明顯的抑制作用，培養(yǎng)20 d 白絹病菌菌絲生長抑制率達87.20%，高于潘夢詩等[15]的研究結果（81.93%），培養(yǎng)30 d 時菌核抑制率達到88.51%，低于潘夢詩等[15]的研究結果（100.0%），可能是由于試驗環(huán)境不同導致的差異。拮抗菌株在室內試驗中表現(xiàn)出拮抗作用具有一定應用參考，但在田間復雜環(huán)境下依舊能表現(xiàn)出優(yōu)良的抑菌防效才具有較好的生防應用潛力[23]。夏明聰等[24]研究表明，貝萊斯芽孢桿菌YB-145 在田間應用中對小麥紋枯病具有較好的防效，且具有較好的增產作用。貝萊斯芽孢桿菌不僅可以分泌抑菌活性物質抑制病原菌，還可以分泌吲哚乙酸、玉米素和赤霉素等植物激素促進植物生長[13]。本試驗中，將DPT-03菌株應用于田間防治花生白絹病，降低了發(fā)病株數，播種后90 d 防效達到61.83%，同時提高了花生產量，進一步說明DPT-03 菌株能夠在田間復雜條件下定殖且發(fā)揮防病和促生性能。

本試驗研究了生防菌株貝萊斯芽孢桿菌DPT-03 對花生白絹病菌菌絲生長、菌核形成，以及對花生白絹病盆栽防效、田間防效及花生產量等的影響，結果表明，DPT-03 能高效抑制花生白絹病菌菌絲生長和菌核形成，在盆栽試驗中能降低白絹病的發(fā)病率和病情指數，在田間試驗中也表現(xiàn)出較好的防效且具有增加花生產量的優(yōu)勢，具備高效防治花生白絹病微生物制劑的開發(fā)潛力。有研究表明，貝萊斯芽孢桿菌能通過分泌脂肽類抗生素、聚酮類化合物和抗菌蛋白等產生抑菌作用[20]，接下來將進一步研究DPT-03 菌株抑菌活性物質的主要種類、特性及其穩(wěn)定性，為開發(fā)抗性強、專一且穩(wěn)定性高的白絹病生防制劑提供理論和實踐依據。