腐植酸對不同連作年限溫室黃瓜土壤養(yǎng)分和微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

孫世君，劉 琦，葉英杰，魏 娜，郝水源

（1. 河套學(xué)院 農(nóng)學(xué)系，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾015000；2. 通遼市農(nóng)牧科學(xué)研究所，內(nèi)蒙古 通遼 028000；3. 巴彥淖爾市農(nóng)牧業(yè)技術(shù)推廣中心，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000）

黃瓜是我國設(shè)施栽培的主要瓜類蔬菜之一，栽培面積大、經(jīng)濟(jì)效益高[1]。然而，由于茬口安排單一，施肥量多和復(fù)種指數(shù)高，土壤連作障礙問題日益突出，嚴(yán)重影響了黃瓜產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展[2?4]。因此，如何克服設(shè)施內(nèi)土壤連作障礙成了設(shè)施黃瓜生產(chǎn)面臨的重要問題。前人研究發(fā)現(xiàn)，增施有機(jī)肥可以在一定程度上緩解土壤連作障礙[5?7]。王雪玉等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，添加生物炭能顯著提高黃瓜連作10 a 土壤中的真菌豐度，促進(jìn)植株生長；胡云等[9]的研究表明，高粱綠肥對改良設(shè)施內(nèi)連作土壤條件和優(yōu)化設(shè)施土壤微生物群落結(jié)構(gòu)同樣具有積極作用。

腐植酸是生態(tài)農(nóng)業(yè)和無公害農(nóng)業(yè)中常用的有機(jī)肥料之一，具有改善土壤理化性質(zhì)、提高肥料利用率和調(diào)節(jié)植物體內(nèi)酶活性等特點(diǎn)。關(guān)于腐植酸的功能研究多集中在對作物生長及產(chǎn)量的影響上。楊蘇等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，適量施用腐植酸會使玉米產(chǎn)量增加27.2%～50.6%；沈建生等[11]的研究表明，腐植酸處理能夠顯著提高草莓硬度、可溶性固形物含量；孫利萍等[12]的研究表明，番茄果實(shí)的維生素C、番茄紅素、可溶性糖和有機(jī)酸含量也與增施腐植酸有關(guān)。腐植酸主要通過提升土壤速效鉀、有機(jī)質(zhì)含量，進(jìn)而增強(qiáng)植物光合作用，從而提高植物產(chǎn)量和品質(zhì)[13]。然而，關(guān)于施用腐植酸緩解設(shè)施內(nèi)土壤連作障礙方面的報(bào)道較少。因此，以溫室黃瓜連作4 a和11 a 的土壤為研究對象，探究增施腐植酸后對不同連作年限溫室黃瓜土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，揭示腐植酸修復(fù)根區(qū)土壤的微生態(tài)機(jī)制，以期為推廣腐植酸、防治設(shè)施蔬菜土壤連作障礙提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試黃瓜品種為津優(yōu)35 號。供試土壤為日光溫室內(nèi)連續(xù)栽培4 a 和11 a 黃瓜的0～30 cm 耕層土壤（以下分別簡稱連作4 a 土壤、連作11 a 土壤），以未栽培過蔬菜的溫室外土壤作為對照（以下簡稱溫室外對照土壤）其基本理化性質(zhì)見表1。供試腐植酸水溶肥料由內(nèi)蒙古際美生物科技有限公司提供，腐植酸含量為252 g/L、全氮含量為94.3 g/L、速效磷含量為117.2 g/L、速效鉀含量為93.1 g/L、pH 值為7.12。

表1 供試土壤基本理化性質(zhì)Tab.1 Basic physical and chemical properties of test soil

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2020 年9—10 月在內(nèi)蒙古鮮農(nóng)農(nóng)牧業(yè)有限公司博士科研工作站現(xiàn)代化溫室內(nèi)進(jìn)行。采用花盆（上口直徑20 cm、下口直徑15 cm，高16 cm）栽培黃瓜，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，共設(shè)7 個(gè)處理，CK：溫室外對照土壤；T4：連作4 a 土壤；300T4：連作4 a 土壤+腐植酸300 倍液；600T4：連作4 a 土壤+腐植酸600 倍液；T11：連作11 a 土壤；300T11：連作11 a 土壤+腐植酸300倍液；600T11：連作11 a土壤+腐植酸600 倍液。每個(gè)處理重復(fù)3 次，每個(gè)重復(fù)10 盆。2020 年9 月5 日于黃瓜幼苗兩葉一心時(shí)定植，每盆定植1 株。2020 年9 月12 日緩苗后開始進(jìn)行腐植酸處理，腐植酸一次性施入。增施腐植酸時(shí)既要確保腐植酸能夠浸透80%的土壤，又不從花盆底部溢出。未增施腐植酸的處理，用等體積的水代替。日常管理中，除每次澆等體積的水（每次澆水均未從花盆底部溢出）外，其他管理措施均相同。

1.3 土壤樣品采集及制備

在增施腐植酸20 d后，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取5盆，用抖根法收集黃瓜根際土壤。過2 mm 篩，將土壤分成2 份。一份立即置于-80 ℃超低溫冰箱保存，用于測定微生物多樣性；一份在室內(nèi)自然風(fēng)干過篩后保存，用于測定土壤理化性質(zhì)。

1.4 測定指標(biāo)與方法

1.4.1 土壤理化性質(zhì)測定 采用鉬銻抗比色法測定土壤速效磷含量；采用火焰光度計(jì)法測定速效鉀含量；采用濃硫酸消煮-流動分析儀法測定全氮含量；采用重鉻酸鉀外加熱法測定有機(jī)質(zhì)含量；采用pH計(jì)測定土壤pH值。

1.4.2 DNA 提取和高通量測序 每個(gè)土樣分別稱取0.500 g，3 次重復(fù)，按照E.Z.N.A.?Soil DNA Kit 試劑盒的使用說明，提取土壤微生物基因組總DNA。用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）引物對各樣品內(nèi)細(xì)菌的16S rDNA 基因（V3—V4）進(jìn)行PCR擴(kuò)增；用ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTA?A-3′）和ITS1R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）引物對各樣品內(nèi)真菌的ITS1可變區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用Illumina MiSeq PE250 測序平臺進(jìn)行高通量測序，建庫和測序委托聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司完成。

1.5 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行土壤理化性質(zhì)指標(biāo)單因素方差分析；測序獲得原始數(shù)據(jù)后，利用QIIMEV1.8.0 軟件對序列進(jìn)行操作分類單元（Operational taxonomic unit，OTU）聚類，以獲得各樣品在門、屬水平上的細(xì)菌和真菌群落組成；使用Origin 8.5 軟件繪圖及進(jìn)行α 多樣性分析；利用Canoco 4.5 軟件進(jìn)行冗余分析（Redundancy analysis，RDA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐植酸對不同連作年限溫室黃瓜土壤理化性質(zhì)的影響

從表2可以看出，T4和T11處理速效磷含量、速效鉀含量、全氮含量和有機(jī)質(zhì)含量均顯著高于CK，T11 處理速效鉀含量、全氮含量又顯著高于T4，T11處理pH 值與CK 差異不顯著，而T4 處理pH 值顯著低于CK?？梢?，隨連作年限增加，土壤養(yǎng)分含量呈增加趨勢。連作4 a土壤增施腐植酸后，300T4 處理速效磷含量、速效鉀含量、全氮含量和有機(jī)質(zhì)含量均高于T4 和600T4 處理，且300T4 處理速效鉀含量和全氮含量均顯著高于T4和600T4處理，pH值則顯著低于T4處理。連作11 a土壤增施腐植酸后，除全氮含量外，300T11 處理速效磷含量、速效鉀含量和有機(jī)質(zhì)含量均顯著高于T11 和600T11 處理，pH 值則顯著低于T11。

表2 不同處理對溫室黃瓜土壤理化性質(zhì)的影響Tab.2 Effect of different treatments on physical and chemical properties of cucumber soil in greenhouse

2.2 腐植酸對不同連作年限溫室黃瓜土壤細(xì)菌和真菌群落α多樣性的影響

由表3 可知，隨著土壤連作年限增加，T4 和T11處理細(xì)菌和真菌的OTU數(shù)量、Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)均低于CK，而T11 處理細(xì)菌的Shannon 指數(shù)和真菌的OTU 數(shù)量、Shannon 指數(shù)和Chao1 指數(shù)均顯著高于T4處理，說明連作導(dǎo)致土壤微生物群落多樣性降低，但連作11 a 土壤細(xì)菌和真菌的多樣性高于連作4 a 的土壤。連作4 a 土壤增施腐植酸后，除600T4 處理細(xì)菌的Shannon 指數(shù)顯著低于T4 處理（降低了8.38%）和300T4 處理、Chao1 指數(shù)顯著高于300T4 處理外，其余各指標(biāo)均無顯著差異。連作11 a 土壤增施腐植酸后，各處理間細(xì)菌和真菌的OTU 數(shù)量、Shannon 指數(shù)和Chao1 指數(shù)均無顯著差異。綜上，腐植酸對不同連作年限土壤細(xì)菌和真菌多樣性的影響不一致。

表3 不同處理對溫室黃瓜土壤細(xì)菌和真菌群落α多樣性的影響Tab.3 Effect of different treatments on α diversity of bacterial and fungal communities in greenhouse cucumber soil

2.3 腐植酸對不同連作年限溫室黃瓜土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成的影響

2.3.1 不同處理溫室黃瓜土壤細(xì)菌在門水平上的豐度變化 由圖1 可知，在門分類水平上構(gòu)成溫室黃瓜根際土壤優(yōu)勢細(xì)菌群落的依次為變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、擬 桿 菌 門（Bacteroidetes） 、放 線 菌 門（Actinobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）和疣微菌門（Verrucomicrobia）。與CK 相比，連作土壤中變形菌門、疣微菌門和酸桿菌門的相對豐度降低，其他菌門的相對豐度升高。連作4 a 的土壤增施腐植酸后，600T4 處理優(yōu)勢菌種占細(xì)菌總數(shù)的比值高于T4 和300T4 處理，且分別高2.00%和1.96%，主要表現(xiàn)在變形菌門、綠彎菌門和放線菌門上，而酸桿菌門和浮霉菌門的相對豐度則低于T4 和300T4。連作11 a 的土壤增施腐植酸后，600T11 處理優(yōu)勢菌種占細(xì)菌總數(shù)的比值高于T11 和300T11，其中變形菌門、芽單胞菌門和擬桿菌門的相對豐度高于T11 和300T11 處理。說明不同連作年限土壤增施腐植酸后增加了土壤優(yōu)勢菌群的比值。

圖1 不同處理溫室黃瓜土壤細(xì)菌在門水平上的豐度變化Fig.1 Change of bacterial abundance in greenhouse cucumber soil at phylum level under different treatments

2.3.2 不同處理溫室黃瓜土壤細(xì)菌在屬水平上的豐度變化 由圖2可知，在屬的分類水平上，隨著連作年限的增加，RB41、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）和MND1 的相對豐度整體上顯著降低，假單胞菌屬（Pseudomonas）和Altereythrobacter的相對豐度則顯著 升 高。 T4 處 理 的Chryseolinea、Anaerolinea、Thermomarinilinea和特呂珀菌屬（Truepera）的相對豐度高于CK 和T11 處理，鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）的相對豐度則相反。連作4 a 土壤增施腐植酸后，300T4 處理Chryseolinea和RB41 的相對豐度最高，600T4 處理假單胞菌屬、Altereythrobacter和Thermomarinilinea的 相 對 豐 度 最高。連作11 a 的土壤增施腐植酸后，300T11 處理Chryseolinea、RB41、MND1、Thermomarinilinea和 特呂珀菌屬的相對豐度均高于T11 和600T11 處理，600T11 處理芽單胞菌屬、假單胞菌屬、Altereythrobacter和鞘氨醇單胞菌屬的相對豐度均最高。

圖2 不同處理溫室黃瓜土壤細(xì)菌在屬水平上的豐度變化Fig.2 Change of bacterial abundance in greenhouse cucumber soil at genus level under different treatments

2.3.3 不同處理溫室黃瓜土壤真菌在門水平上的豐度變化 由圖3 可知，在門分類水平上構(gòu)成溫室黃瓜根際土壤優(yōu)勢真菌群落的依次為子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、接合菌門（Zygomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）和壺菌門（Chytridiomycota）。連作增加了土壤中子囊菌門的相對豐度，而擔(dān)子菌門和壺菌門的相對豐度則降低。連作4 a 土壤增施腐植酸后，子囊菌門的相對豐度顯著升高，且表現(xiàn)為600T4 處理>300T4 處理>T4 處理；擔(dān)子菌門的變化規(guī)律則相反，以600T4 處理擔(dān)子菌門的相對豐度為最低。連作11 a 的土壤增施腐植酸后，子囊菌門的相對豐度降低，且300T11 和600T11 處理子囊菌門相對豐度分別較T11 處理降低5.61%和2.22%，300T11 處理擔(dān)子菌門、接合菌門和被孢霉門的相對豐度最高，600T11處理壺菌門的相對豐度高于300T11和T11處理。

圖3 不同處理溫室黃瓜土壤真菌在門水平上的豐度變化Fig.3 Change of fungal abundance in greenhouse cucumber soil at phylum level under different treatments

2.3.4 不同處理溫室黃瓜土壤真菌在屬水平上的豐度變化 進(jìn)一步在屬水平上對真菌進(jìn)行分析。由圖4 可知，隨著連作年限的增加，毛殼菌屬（Chaetomium）、枝頂孢屬（Acremonium）的相對豐度先升高后降低，叢赤殼屬（Nectria）、被孢霉屬（Mortierella）、帚枝霉屬（Sarocladium）和赤霉屬（Gibberella）的相對豐度降低，鬼傘屬（Coprinus）、卷旋 孢 屬（Cirrenalia）和 假 霉 樣 真 菌 屬（Pseudallescheria）的相對豐度升高。連作4 a 土壤增施腐植酸后，600T4 處理毛殼菌屬的相對豐度顯著低于300T4 和T4 處理，而帚枝霉屬和鏈格孢屬（Alternaria）的相對豐度顯著高于300T4 和T4 處理。連作11 a 的土壤增施腐植酸后，毛殼菌屬、枝頂孢屬和卷旋孢屬的相對豐度降低，而被孢霉屬、鬼傘屬和假霉樣真菌屬的相對豐度升高。連作11 a 的處理中，300T11處理被孢霉屬和鬼傘屬的相對豐度較高；600T11處理假霉樣真菌屬的相對豐度最高。

圖4 不同處理溫室黃瓜土壤真菌在屬水平上的豐度變化Fig.4 Change of fungal abundance in greenhouse cucumber soil at genus level under different treatments

2.4 腐植酸對不同連作年限溫室黃瓜土壤環(huán)境因子與微生物群落組成影響的RDA分析

RDA 能夠直觀反映各處理土壤群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系。由圖5 可知，細(xì)菌和真菌總變異量分別為52.86%、48.01%，而且隨連作年限增加，土壤細(xì)菌和真菌的樣品點(diǎn)均有明顯分離現(xiàn)象。說明連作年限對細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)影響較大。增施腐植酸后，300T11 和600T11 處理細(xì)菌和真菌與T11 處理在RDA2 方向上都存在明顯分離，說明腐植酸較大地改變了連作11 a 土壤細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)。

圖5 細(xì)菌（A）和真菌（B）群落結(jié)構(gòu)與土壤性質(zhì)間的RDA分析Fig.5 RDA of bacterial（A）and fungal（B）community structure and soil physiochemical properties

3 結(jié)論與討論

溫室是環(huán)境相對可控的半封閉空間，受人為干預(yù)的程度較大。由于溫室內(nèi)作物的長期連作，導(dǎo)致其土壤出現(xiàn)質(zhì)量退化、有害微生物增加等問題[14]。腐植酸作為自然界中廣泛存在的大分子有機(jī)物質(zhì)，被用于設(shè)施內(nèi)土壤改良方面的研究漸多。本研究結(jié)果表明，隨連作年限的增加，土壤速效養(yǎng)分和有機(jī)質(zhì)含量顯著升高，而pH 值顯著下降，這與李晶晶等[15]的研究結(jié)果一致。增施腐植酸后連作4 a 和11 a的土壤速效磷含量、速效鉀含量、全氮含量和有機(jī)質(zhì)含量均升高，這與吳炳孫等[16]的研究結(jié)果類似。一方面可能由于腐植酸具有多孔性和較強(qiáng)表面吸附能力，能夠有效結(jié)合土壤中的磷離子和鉀離子，使其形成絡(luò)合物，減少土壤對磷離子和鉀離子的固定，進(jìn)而增加土壤中速效磷含量和速效鉀含量[17]；另一方面可能由于腐植酸作為有機(jī)肥料，有機(jī)質(zhì)含量和有機(jī)氮含量高，再加上有機(jī)質(zhì)能減少化學(xué)氮素的損失，因此使得土壤中有機(jī)質(zhì)含量和全氮含量均升高[18]。pH 值作為土壤重要的基本理化性質(zhì)之一，對土壤肥力性質(zhì)、微生物群落結(jié)構(gòu)都具有較大影響。本研究增施腐植酸后，土壤pH 值降低，這可能與腐植酸中的羧基、羥基等含氫官能團(tuán)在土壤中多為酸性，可有效增加土壤中H+濃度有關(guān)[19]。

大量研究表明，微生物種群結(jié)構(gòu)失衡，有益微生物數(shù)量減少，病原微生物數(shù)量增加，且微生物種群多樣性降低，是土壤連作障礙發(fā)生的主要原因之一[20]。本研究也取得了同樣的結(jié)果，連作土壤細(xì)菌和真菌的OTU 數(shù)量、Shannon 指數(shù)和Chao1 指數(shù)均降低。腐植酸因其具有增加土壤孔隙度、降低土壤容重、改善土壤物理結(jié)構(gòu)的特性，為土壤微生物生長與繁殖提供了良好的棲息環(huán)境。袁婉潼[21]研究發(fā)現(xiàn)，適量增施腐植酸可顯著提高鹽堿土壤細(xì)菌和真菌的數(shù)量。本研究結(jié)果表明，連作4 a 土壤增施腐植酸后，只有600T4 處理細(xì)菌的Shannon 指數(shù)顯著低于T4 和300T4 處理，而對土壤真菌的多樣性并無顯著影響。張慧等[22]的研究亦表明，施用腐植酸肥料對煙草土壤細(xì)菌群落豐富度的促進(jìn)效果不顯著，黃腐酸施入土壤后不能顯著改善微生物多樣性[23]，這可能是由于增施腐植酸的濃度較低所致。YI等[24]的研究也證實(shí)了這一觀點(diǎn)，當(dāng)施入腐植酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)由0.5%增加至2.0%時(shí)，土壤微生物多樣性才會明顯升高。此外，腐植酸自身結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，含有大量不易被分解利用的芳香烴類物質(zhì)，而土壤微生物群落結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，施肥時(shí)間短難以真實(shí)反映對土壤微生物多樣性的影響。

腐植酸可以通過改變土壤理化性質(zhì)等方式間接影響微生物群落。本研究結(jié)果表明，連作導(dǎo)致土壤中變形菌門、疣微菌門和酸桿菌門的相對豐度降低，增施腐植酸可顯著提高變形菌門等的相對豐度。在屬水平上的研究同樣表明，腐植酸改變了細(xì)菌屬的群落結(jié)構(gòu)。這與施用腐植酸型生物有機(jī)肥對煙草土壤細(xì)菌群落組成的研究結(jié)果類似[22]。有研究表明，土壤碳、氮含量高，有利于變形菌門的生存[25]，而本研究結(jié)果也表明，增施腐植酸后土壤有機(jī)質(zhì)含量和全氮含量上升，提高了土壤中變形菌門的相對豐度。研究表明，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受土壤環(huán)境、作物種類等因素的影響[26?28]。施入腐植酸改變了土壤理化性質(zhì)，因此，對土壤中細(xì)菌優(yōu)勢類群相對豐度產(chǎn)生了一定影響。本研究結(jié)果還表明，不同連作年限土壤中施入腐植酸后，真菌的相對豐度在不同門和屬水平上表現(xiàn)不同。其中，連作4 a 的土壤中子囊菌門的相對豐度升高，擔(dān)子菌門的相對豐度降低。這可能由于子囊菌門屬于土壤腐生真菌，主要分解環(huán)境中的木質(zhì)素等有機(jī)質(zhì)，腐植酸施入后提高了土壤有機(jī)質(zhì)含量，因此促進(jìn)了菌群的快速增長與繁殖[29]；擔(dān)子菌門對有機(jī)質(zhì)中碳的利用能力有限，土壤有效養(yǎng)分過多，反而對擔(dān)子菌門的生長具有抑制作用[30]。連作11 a 的土壤增施腐植酸后，子囊菌門的相對豐度降低，而擔(dān)子菌門、接合菌門和被孢霉門的相對豐度卻升高，這可能是由于真菌的生存能力相對較低、受外界環(huán)境干擾程度大，導(dǎo)致穩(wěn)定性差所致，但需進(jìn)一步研究。

細(xì)菌和真菌作為土壤中主要的微生物類群，通常隨土壤養(yǎng)分、pH 值等外界條件的變化而變化[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，土壤全氮含量和有機(jī)質(zhì)含量與細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)變化有關(guān)。

綜上所述，增施腐植酸提高了連作溫室黃瓜的土壤養(yǎng)分，使pH 值趨于中性，腐植酸對細(xì)菌和真菌α多樣性總體上無顯著影響，連作4 a的土壤施入腐植酸600 倍液降低了細(xì)菌的Shannon 指數(shù)。增施腐植酸提高了部分優(yōu)勢細(xì)菌和真菌在門和屬水平的相對豐度。