黃淮麥區(qū)41 個(gè)小麥品種（系）品質(zhì)相關(guān)基因的分子檢測

李春鑫，趙明忠，韓留鵬，高 崇，李正玲，王 艷，昝香存，胡 琳

（1. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物研究所，河南 鄭州 450002；2. 河南省作物分子育種研究院，河南 鄭州 450002）

面制食品的制作、口感、色澤及外形受小麥蛋白質(zhì)含量或面筋強(qiáng)度、淀粉特性、面粉色澤、籽粒硬度等品質(zhì)性狀的綜合影響[1]。高分子質(zhì)量麥谷蛋白亞基（HMW-GS）是決定小麥面團(tuán)流變學(xué)特性和面筋特性的重要因素[2]，由位于小麥第一同源染色體上的Glu-A1、Glu-B1 和Glu-D1 位點(diǎn)的基因編碼[3]，每個(gè)位點(diǎn)都含有2 個(gè)緊密連鎖基因，分別編碼分子質(zhì)量較大的x 型和分子質(zhì)量較小的y 型亞基[3]。其中，Ax1、Ax2*、Bx7+By8 和Dx5+Dy10 等亞基是公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)亞基[2，4]。

淀粉特性影響面條的質(zhì)地，直鏈淀粉含量較低，煮熟后面條口感較好[5]。顆粒結(jié)合淀粉合成酶（Granule?bound starch synthase，GBSS）又稱Waxy 蛋白（簡稱Wx 蛋白），與直鏈淀粉合成密切相關(guān)。普通小麥含有Wx-A1、Wx-B1 和Wx-D1 三種Waxy 蛋白亞基，分別由位于7AS、4AL 和7DS 染色體上的基因位點(diǎn)編碼[6]。其中，Wx-B1 蛋白亞基缺失類型直鏈淀粉含量較低，具有優(yōu)良的面條品質(zhì)[6]。

面粉色澤直接影響面制品的外觀，是評(píng)價(jià)小麥品質(zhì)的重要指標(biāo)。面粉的色澤主要由小麥籽粒中的色素決定。其中，黃色素是小麥籽粒中的主要色素，受多基因控制。八氫番茄紅素合成酶（Phytoene synthase，Psy）、ζ-胡 蘿 卜 素 脫 氫 酶（ζ?carotene desaturase，Zds）是類胡蘿卜素生物合成過程中的關(guān)鍵酶，對(duì)小麥籽粒或面粉的黃色素含量起決定作用[7?8]。HE 等[9?10]先 后 克 隆 了 與 黃 色 素 含 量 相 關(guān) 的Psy-A1 和Psy-B1 基因。其中，位于Psy-A1 位點(diǎn)的Psy-A1a、Psy-A1b等位基因分別與高、低黃色素含量相關(guān)，位于Psy-B1 位點(diǎn)上的等位基因Psy-B1a、Psy-B1b、Psy-B1c分別與高、低、高黃色素含量相關(guān)。Zds 活性影響黃色素含量，目前在小麥上克隆了位于2D 和2A 染色體上的基因Zds-D1 和Zds-A1，其中Zds-A1a和Zds-D1b基因與低黃色素含量相關(guān)[11?12]。多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，Ppo）是引起面粉制品顏色褐變的主要因素，其主效基因Ppo-A1 和Ppo-D1 位 于 染 色 體2AL 和2DL 上[13]。SUN 等[13]開發(fā)了位于2AL 的PPO 基因標(biāo)記Ppo18，能有效區(qū)分控制高、低Ppo 活性的等位基因Ppo-A1a和Ppo-A1b；HE 等[14]開發(fā)了互補(bǔ)標(biāo)記Ppo16 和Ppo29，能有效區(qū)分Ppo-D1 位點(diǎn)等位基因Ppo-D1a（低Ppo 活性）和Ppo-D1b（高Ppo 活性）。脂肪氧化酶（Lipoxygenase，Lox）活性影響面粉白度，是一個(gè)受多基因控制的數(shù)量性狀。目前，已經(jīng)分別在小麥1AS、4A、4B、4D、5A 和5D 染色體上定位到可解釋Lox活性表型變異的QTL[15]。GENG等[16]開發(fā)了互補(bǔ)顯性標(biāo)記Lox16和Lox18，能準(zhǔn)確有效地鑒定小麥品種Lox 等位變異基因Lox-B1a（高Lox 活性）和Lox-B1b（低Lox 活性），可基本滿足小麥Lox 活性輔助選擇的需要。

籽粒硬度對(duì)小麥面粉顆粒大小、出粉率、淀粉破損率和加工品質(zhì)有重要影響。研究表明，籽粒硬度遺傳力較高，由位于5DS 上的籽粒硬度基因（Puroindoline，Pin）Pina和Pinb共同控制[17]。當(dāng)Pina和Pinb同為野生型（Pina-D1a/Pinb-D1a）時(shí)，籽粒為柔軟表型，兩者任何一個(gè)基因發(fā)生突變或缺失都會(huì)使籽粒變硬[18]。CHEN 等[19]還發(fā)現(xiàn)與Pinb高度同源的基因Pinb-2v，可能對(duì)籽粒硬度具有微效的調(diào)節(jié)作用。研究表明，擁有Pinb-2v3類型的小麥品種產(chǎn)量相關(guān)性狀表現(xiàn)優(yōu)于Pinb-2v2類型；且與Pinb-2v2類型相比，Pinb-2v3類型小麥品種有更高的籽粒硬度和更優(yōu)的籽粒性狀[20]。

隨著生活水平的提高和膳食習(xí)慣的改變，人們對(duì)優(yōu)質(zhì)小麥的需求量日益增加。黃淮麥區(qū)是我國小麥主產(chǎn)區(qū)，也是小麥品質(zhì)改良和小麥選育的重要貢獻(xiàn)區(qū)，但由于品種數(shù)量多、品種來源廣，小麥品質(zhì)涉及的位點(diǎn)和基因數(shù)量多。而現(xiàn)有相關(guān)報(bào)道對(duì)該地區(qū)小麥品質(zhì)相關(guān)基因的研究大多集中于1 個(gè)或2個(gè)品質(zhì)性狀方面，缺乏對(duì)多個(gè)品質(zhì)性狀的系統(tǒng)檢測。為此，選用41 個(gè)黃淮麥區(qū)小麥品種（系），利用23 個(gè)分子標(biāo)記對(duì)面粉的面筋強(qiáng)度、淀粉特性、色澤及籽粒硬度等品質(zhì)性狀相關(guān)基因進(jìn)行檢測，明確相關(guān)品質(zhì)基因在這些品種中的分布情況，為我國小麥品質(zhì)育種提供材料和數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試材料為41個(gè)黃淮麥區(qū)小麥品種（系），均來自河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所資源研究室種質(zhì)庫，所有品種（系）在試驗(yàn)前均經(jīng)過連續(xù)2 a 的田間嚴(yán)格去雜和性狀一致性鑒定。

1.2 基因組DNA的提取

每份材料挑選飽滿種子5 粒，放置于玻璃培養(yǎng)皿中20 ℃培養(yǎng)，7～10 d 后，剪取生長健康葉片提取基因組DNA，DNA 提取方法參照LAGUDAH 等[21]的方法，用1%瓊脂糖凝膠檢測DNA 提取的質(zhì)量和完整 性，所 有 樣 品DNA 均 稀 釋 為100 ng/μL，置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴(kuò)增及分子標(biāo)記檢測

根據(jù)已發(fā)表的與小麥各品質(zhì)特性相關(guān)的分子標(biāo)記合成23 對(duì)引物，引物全部由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。相應(yīng)的引物名稱、序列及其他相關(guān)信息見表1。PCR 擴(kuò)增在Eppendorf 的Mastercycler Pro S （Eppendorf AG，Hamburg，Germany）上 進(jìn) 行，PCR 反 應(yīng) 體 系 為10 μL，包 括2.0 μL DNA 模 板、1.0 μL 10×buffer（Mg2+）、0.2 μL dNTPs（10 mmol/L）、0.2 μL 上游引物（10 pmol/μL）、0.2 μL 下 游 引 物（10 pmol/μL）、0.06 UTaqDNA polymerase（5 U/μL）、6.34 μL 無菌水。各引物PCR擴(kuò)增程序?qū)φ諈⒖嘉墨I(xiàn)[9?14，16，19?20，22?24]進(jìn)行設(shè)置。

表1 小麥品質(zhì)相關(guān)基因及其引物信息Tab.1 Wheat quality related genes and their primers information

續(xù)表1 小麥品質(zhì)相關(guān)基因及其引物信息Tab.1（Continued） Wheat quality related genes and their primers information

2 結(jié)果與分析

2.1 黃淮麥區(qū)41個(gè)小麥品種（系）面筋強(qiáng)度相關(guān)基因分子檢測

41 份黃淮麥區(qū)小麥材料在Glu-A1 和Glu-D1位點(diǎn)共檢測出5 種類型蛋白亞基基因（表2）。其中，3 份材料Glu-A1 位點(diǎn)為稀有亞基基因Ax2*，頻率為7.32%，38 份材料Glu-A1 位點(diǎn)為Ax1/null；Glu-D1 位點(diǎn)檢測出Dx5+Dy10、Dx2+Dy12基因組合類型，分別在18、23 份材料中出現(xiàn)，頻率分別為43.90%、56.10%。

2.2 黃淮麥區(qū)41個(gè)小麥品種（系）淀粉特性相關(guān)基因分子檢測

由表2 可知，在Wx-A1 位點(diǎn)，41 份黃淮麥區(qū)小麥材料全部表現(xiàn)為Wx-A1 正常表達(dá)（Wx-A1a）；在Wx-B1 位 點(diǎn)，1 份 材 料 表 現(xiàn) 為Wx-B1 缺 失（Wx-B1b），頻率為2.44%；在Wx-D1位點(diǎn)，41份材料全部表現(xiàn)為Wx-D1正常表達(dá)（Wx-D1a）。表明供試小麥品種（系）Wx 基因組成以野生型為主，等位變異類型不夠豐富。

2.3 黃淮麥區(qū)41個(gè)小麥品種（系）面粉色澤相關(guān)基因分子檢測

2.3.1 Psy-A1、Psy-B1 位點(diǎn) 由表2 可知，41 份黃淮麥區(qū)小麥材料中有25 份材料含Psy-A1a基因，頻率為60.98%；16 份材料含Psy-A1b基因，頻率為39.02%。對(duì)41 份小麥材料中Psy-B1 位點(diǎn)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)Psy-B1a、Psy-B1b、Psy-B1c基因分別在16、18、7 份材料中出現(xiàn)，頻率分別為39.03%、43.90%、17.07%，其中與低黃色素含量相關(guān)的Psy-B1b基因出現(xiàn)頻率最高。

表2 黃淮麥區(qū)41個(gè)小麥品種（系）品質(zhì)性狀基因型Tab.2 Genotypes of quality traits of 41 wheat varieties（lines）in Huang-Huai wheat region

續(xù)表2 黃淮麥區(qū)41個(gè)小麥品種（系）品質(zhì)性狀基因型Tab.2（Continued） Genotypes of quality traits of 41 wheat varieties（lines）in Huang-Huai wheat region

2.3.2 Zds-A1、Zds-D1 位點(diǎn) 對(duì)41 份黃淮麥區(qū)小麥材料進(jìn)行Zds-A1、Zds-D1 位點(diǎn)等位變異類型分析（表2），發(fā)現(xiàn)Zds-A1 位點(diǎn)存在Zds-A1a、Zds-A1b2種基因類型，頻率分別為51.22%、48.78%；而在Zds-D1位點(diǎn)，所有材料均為Zds-D1b基因類型。

2.3.3 Ppo 基因 由表2 可知，在41 份黃淮麥區(qū)小麥材料中，Ppo-A1a、Ppo-A1b基因分別在20、21 份材料中出現(xiàn)，頻率分別為48.78%、51.22%；Ppo-D1a、Ppo-D1b基因分別在25、16 份材料中出現(xiàn)，頻率分別為60.98%、39.02%。

2.3.4 Lox 基因 表2 顯示，在41 份黃淮麥區(qū)小麥材料中，6 份材料中出現(xiàn)Lox-B1a基因，頻率為14.63%；35 份材料中出現(xiàn)Lox-B1b基因，頻率為85.37%。

2.4 黃淮麥區(qū)41個(gè)小麥品種（系）籽粒硬度基因分子檢測

由表2 可知，在41 份黃淮麥區(qū)小麥材料中，8 份材料表現(xiàn)為Pina-D1b類型，頻率為19.52%；33 份材料表現(xiàn)為Pina-D1a類型，頻率為80.48%。對(duì)Pinb位點(diǎn)的等位變異類型進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)Pinb-D1a類型在11 個(gè)材料中出現(xiàn)，頻率為26.83%；Pinb-D1b類型在30 個(gè)材料中出現(xiàn)，頻率為73.17%。對(duì)Pinb-2 位點(diǎn)的等位變異類型進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)為Pinb-2v2類型的材料有14 份，頻率為34.15%；表現(xiàn)為Pinb-2v3類型的材料有27分，頻率為65.85%。

2.5 黃淮麥區(qū)41個(gè)小麥品種（系）品質(zhì)性狀優(yōu)質(zhì)基因組合

在41 份黃淮麥區(qū)小麥材料中共檢測出14 個(gè)品質(zhì)相關(guān)優(yōu)質(zhì)基因（表2），優(yōu)質(zhì)基因組合共16 個(gè)（表3），對(duì)于HWM-GS 和Wx 基因來說，優(yōu)質(zhì)基因組合Ax2*/Dy10+Dx5和Dy10+Dx5/Wx-B1b頻率均為2.44%。對(duì)于Psy、Zds 基因，優(yōu)質(zhì)基因組合Psy-A1b/Psy-B1b、Zds-A1a/Zds-D1b、Psy-A1b/Zds-A1a/Zds-D1b、Psy-B1b/Zds-A1a/Zds-D1b、Psy-A1b/Psy-B1b/Zds-A1a/Zds-D1b頻 率 分 別 為21.95%、51.22%、4.88%、7.32%、17.07%。同時(shí)存在4 個(gè)低黃色素優(yōu)質(zhì)基因的品種（系）共7 份，分別是鄭0856、鄭1325、鄭9188、鄭9062-5、鄭9062-9、新麥28 和西農(nóng)979（表2）。對(duì)于Ppo、Lox 基因，Ppo-A1b、Ppo-D1a及Lox-B1b為優(yōu)質(zhì)基因，優(yōu)質(zhì)基因組合為Ppo-A1b/Ppo-D1a、Ppo-A1b/Lox-B1b、Ppo-A1b/Ppo-D1a/Lox-B1b，頻率分別為29.27%、4.88%、2.44%。對(duì)于硬度基因Pin，Pina-D1a/Pinb-D1a基因組合表現(xiàn)為軟質(zhì)，其頻率為7.32%；Pina-D1a/Pinb-D1b和Pina-D1b/Pinb-D1a基因組合表現(xiàn)為硬質(zhì)，頻率分別為73.17% 和19.51%；Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-2v3、Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-2v3和Pina-D1b/Pinb-D1a/Pinb-2v3基因組合出現(xiàn)頻率分別為4.88%、43.90%和17.07%。

表3 黃淮麥區(qū)41個(gè)小麥品種（系）品質(zhì)性狀優(yōu)異基因組合Tab.3 Excellent gene combinations for quality traits of 41 wheat varieties in Yellow-Huai wheat region

3 結(jié)論與討論

近年來，品質(zhì)育種已成為小麥育種的主要目標(biāo)之一。小麥的品質(zhì)性狀是基因和環(huán)境共同作用的結(jié)果，受基因型、外界環(huán)境、酸堿度、熱敏感性等多種因素影響[25]。在育種過程中，可以通過對(duì)高遺傳力性狀的分子輔助選擇，提高后代選擇的精準(zhǔn)性。本研究利用23 對(duì)分子標(biāo)記對(duì)黃淮麥區(qū)41 份小麥材料中的33個(gè)品質(zhì)性狀相關(guān)基因進(jìn)行檢測，研究結(jié)果可為今后小麥品質(zhì)育種親本選擇和品種布局提供參考。

HMW-GS 的類別和數(shù)量是影響小麥面團(tuán)特性和面筋強(qiáng)度的關(guān)鍵因素[2]。Glu-A1位點(diǎn)的Ax1、Ax2*基因類型優(yōu)于null；Glu-D1 位點(diǎn)Dx5+Dy10基因組合優(yōu)于普通亞基Dx2+Dy12基因組合[4?5]。本研究中的41 份小麥材料在Glu-A1 和Glu-D1 位點(diǎn)共檢測出5 種變異類型，類型比較豐富，其中Ax2*和Dx5+Dy10頻率分別為7.32%和43.90%。Ax2*亞基是稀有優(yōu)質(zhì)亞基，在我國普通小麥品種中分布較少。董永梅等[26]2007年在200份我國小麥代表性地方品種中檢測到的Ax2*基因頻率為0.5%；郝浩楠[27]2019 年發(fā)現(xiàn)Ax2*基因在294份我國核心種質(zhì)小麥材料中的頻率為3.68%。本研究中Ax2*基因頻率為7.32%，這是我國育種單位近年來重視強(qiáng)筋品種選育的結(jié)果。品種陜墾10 號(hào)中出現(xiàn)Ax2*/Dx5+Dy10優(yōu)質(zhì)亞基基因組合，可優(yōu)先考慮作為小麥強(qiáng)筋育種的親本。

小麥直鏈淀粉含量是影響小麥面粉品質(zhì)的重要因素。Wx 蛋白作為小麥直鏈淀粉合成過程中的重要蛋白，包含3 種亞基，任一種Wx 蛋白亞基的缺失或失活可導(dǎo)致直鏈淀粉含量降低[6]。本研究中41份小麥材料中Wx-A1、Wx-D1 蛋白全表現(xiàn)為正常，僅有1 份材料鄭麥366 表現(xiàn)為Wx-B1 蛋白缺失，遠(yuǎn)低于李式昭等[28]從四川省小麥品種中檢測出的Wx-B1蛋白缺失水平（32.4%）。供試的黃淮麥區(qū)小麥材料中有關(guān)直鏈淀粉含量的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源類型十分稀缺，下一步應(yīng)加強(qiáng)黃淮麥區(qū)Wx 蛋白缺失類型品種的引進(jìn)及新種質(zhì)資源的創(chuàng)制。

Psy 和Zds 作為小麥籽粒黃色素合成過程中的關(guān)鍵酶，其活性影響面粉的色澤[12]。本研究共檢測出4 個(gè)高黃色素含量相關(guān)基因和4 個(gè)低黃色素含量相關(guān)基因，基因類型十分豐富。Psy-A1位點(diǎn)上高黃色素含量相關(guān)基因Psy-A1a頻率為60.98%，Psy-B1位點(diǎn)上低黃色素含量相關(guān)基因Psy-B1b頻率為43.90%，這與陳杰等[29]的研究結(jié)果一致。而相吉山等[30]研究發(fā)現(xiàn)，新疆維吾爾自治區(qū)小麥中Psy-A1a頻率超過90%，這可能與研究時(shí)間、材料來源和地域有一定的關(guān)系。在41 份小麥材料中，來自Zds-A1 位點(diǎn)的高、低黃色素含量基因頻率接近，Zds-D1位點(diǎn)只檢出了低黃色素含量基因，低黃色素含量基因頻率比張鈺玉等[31]研究結(jié)果有大幅度提高，表明為提高面條、饅頭和餃子等傳統(tǒng)面食的亮度和白度，低黃色素含量基因已被大量用于黃淮麥區(qū)品種選育。此外，低黃色素含量相關(guān)基因最優(yōu)組合Psy-A1b/Psy-B1b/Zds-A1a/Zds-D1b頻率為17.07%，表明優(yōu)質(zhì)低黃色素含量基因已在部分品種中得到聚合，為后續(xù)選育優(yōu)良品質(zhì)的小麥品種奠定了較好的基礎(chǔ)。

低Ppo活性可降低面粉在加工和貯存過程中的褐變程度，具有低Ppo 活性的小麥品種更適合加工傳統(tǒng)面食[18，30]。本研究發(fā)現(xiàn)，低Ppo 活性Ppo-A1b基因在41 個(gè)小麥材料中出現(xiàn)頻率基本與全國水平持平（52%），Ppo-D1a基因頻率略高于全國水平（59.4%）[32]；Ppo-A1b和Ppo-D1a基因頻率高于楊子博等[33]的研究結(jié)果。Lox 活性同樣影響小麥的品質(zhì)，高Lox 活性可以提高面粉及其制品的白度[16]。41 份小麥材料中Lox-B1a和Lox-B1b基因頻率分別為14.63%和85.37%。本研究中高Lox 活性相關(guān)基因頻率偏低，與楊芳萍等[34]和張福彥等[35]的研究結(jié)果一致，這可能是因?yàn)楦週ox 活性的小麥籽粒不耐長時(shí)間儲(chǔ)藏，使攜帶此類基因的材料在選育過程中被淘汰。鄭麥7698 是41 份小麥材料中唯一攜帶優(yōu)質(zhì)基因組合Ppo-A1b/Ppo-D1a/Lox-B1a的品種，為今后小麥籽粒色澤改良和育種親本選擇提供參考。

本研究在Pina-D1、Pinb-D1 和Pinb-2 三個(gè)位點(diǎn)共檢測出6 種基因型，41 份小麥材料的籽粒以硬質(zhì)為主，與劉紅美等[36]研究發(fā)現(xiàn)的黃淮麥區(qū)小麥核心種質(zhì)中的軟質(zhì)麥占比較低、硬質(zhì)麥占比較高的結(jié)果相一致；而胡文靜等[37]研究發(fā)現(xiàn)，揚(yáng)州市育成小麥品種（系）以軟質(zhì)類型基因組合為主，這可能與不同小麥品種生態(tài)類型以及生產(chǎn)需求不同有關(guān)。Pina-D1 和Pinb-D1 位點(diǎn)產(chǎn)生的基因組合類型有3 種，其中Pina-D1a/Pinb-D1b基因頻率最高，這與桑偉等[38]、CHEN 等[20]研究結(jié)果相符。Pinb-2 位點(diǎn)的Pinb-2v3基因具有很高的分布頻率，與前人的研究相一致[21，39]。這可能是由于Pinb-2v3與高產(chǎn)性狀相關(guān)基因協(xié)同效應(yīng)更好，使育種家選擇高產(chǎn)的同時(shí)保留了這一基因。籽粒硬度基因中優(yōu)勢基因組合為Pina-D1a/Pinb-D1a/Pinb-2v3、Pina-D1a/Pinb-D1b/Pinb-2v3和Pina-D1b/Pinb-D1a/Pinb-2v3，以上3 種基因組合的頻率共達(dá)65.85%，表明黃淮麥區(qū)小麥品質(zhì)改良和育種工作取得了很大的進(jìn)步。