咔唑近紅外熒光探針可視化線粒體及體內(nèi)成像應(yīng)用

顧亞琴，丁勁峰，陳金娥，謝文娜，肖林霞

（江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院,鹽城 224002）

所有活細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)都含有胞內(nèi)細(xì)胞器和生物大分子，如蛋白質(zhì)和核酸［1，2］.這些細(xì)胞器執(zhí)行其職責(zé)并影響重要的生物功能，包括代謝、能量運輸和細(xì)胞增殖［3，4］.所有這些功能都需要能量，而能量則由線粒體產(chǎn)生.它是活細(xì)胞內(nèi)能量產(chǎn)生的樞紐，是細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)、信號傳導(dǎo)和細(xì)胞自噬、凋亡的關(guān)鍵參與者［5，6］.線粒體功能障礙通常會導(dǎo)致多種嚴(yán)重疾病，包括腫瘤、神經(jīng)退行性疾病和心血管疾病以及肥胖癥、糖尿病和非酒精性脂肪肝?。∟AFLD）等在內(nèi)的代謝疾?。?，7］.因此，開展對線粒體的動態(tài)成像將有助于揭示相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展過程.自19 世紀(jì)50 年代以來，通過測量煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH/NAD+）的自發(fā)熒光來監(jiān)測線粒體活性一直是最實用的方法［8］，但因受到背景熒光干擾、低靈敏度及短發(fā)射波長的限制，制約了其在生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用.在過去的十年中，熒光分子成像技術(shù)取得了巨大進步，并隨著高分辨率顯微鏡技術(shù)的完善及細(xì)胞內(nèi)分子事件的可視化［9］，種類繁多的有機熒光分子被應(yīng)用于線粒體的監(jiān)測，如羅丹明類［10～12］、花菁或半花菁類［13，14］、BODIPY類［15］以及香豆素類［16］，然而大部分線粒體熒光探針受到短發(fā)射波長以及小Stokes位移的限制，難以實現(xiàn)體內(nèi)的熒光成像.近紅外熒光探針的出現(xiàn)較好地克服了傳統(tǒng)熒光探針的缺點，其具有發(fā)射波長長（650～900 nm）［17，18］、對細(xì)胞損傷?。?9，20］、組織穿透性強［21］和自發(fā)熒光背景低［22］等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞、組織等復(fù)雜生物系統(tǒng)中生物分子的檢測、示蹤和成像.

咔唑是一類芳香類含氮雜環(huán)化合物.在結(jié)構(gòu)上，咔唑由2 個苯環(huán)和1 個吡咯環(huán)組成，具有雙對稱軸、優(yōu)良的空孔傳輸能力［23］和剛性的平面結(jié)構(gòu)，通常被用作電子給體分子，其衍生物由于原料容易獲得［24］、熱穩(wěn)定性好且結(jié)構(gòu)易于修飾［25］，在有機發(fā)光二極管（OLEDs）和熒光傳感器等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用.本文基于咔唑衍生物優(yōu)良的物理化學(xué)和光學(xué)特性，設(shè)計合成了一系列具有大Stokes位移的近紅外熒光探針（化合物6g～6j）.大Stokes位移熒光探針由于減少了熒光傳感中的自猝滅和自熒光，從而顯著改善了生物成像應(yīng)用中的信噪比.目前，大多數(shù)大Stokes位移的熒光染料通過引入給電子基使HOMO能級上升，能帶隙變窄，斯托克斯位移變大，但卻導(dǎo)致其熒光量子產(chǎn)率降低，而咔唑類熒光染料卻在擁有大Stokes 位移的同時具有高熒光量子產(chǎn)率.實驗結(jié)果表明，化合物6j 在水溶液中發(fā)射波長達(dá)668 nm，且具有大Stokes位移（146 nm）和高熒光量子產(chǎn)率（Φ=0.45），并表現(xiàn)出極好的線粒體靶向能力（P=0.90）.該探針能對裸鼠卵巢癌移植瘤組織進行熒光成像，并能持續(xù)16 h以上，為臨床上腫瘤的精準(zhǔn)診斷和治療提供了新策略.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

2，3，3-三甲基-3H-吲哚、1，1，2-三甲基-1H-苯并［e］吲哚、4-甲基喹啉、4-甲基吡啶、碘甲烷（CH3I）、氫化鈉（NaH）、溴化芐和甲基溴化鎂，分析純，上海畢得醫(yī)藥科技股份有限公司；4-甲基吡啶、苯并［cd］吲哚-2（1H）-酮、碘化鉀（KI）、溴乙烷和咔唑，分析純，上海笛柏生物科技有限公司；乙酸乙酯、甲醇、乙醇、二氯甲烷、石油醚、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、乙腈、四氫呋喃（THF）和三氯氧磷，分析純，安徽澤升科技有限公司；鹽酸、哌啶、氫氧化鉀和無水硫酸鈉，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司.

Bruker AVANCE NEO 400M 和AVANCE 600M 型核磁共振波譜儀（NMR），瑞士Bruker 公司；RF-5301PC型熒光分光光度計（FL），日本島津公司；UV-1800PC型紫外-可見分光光度計（UV-VIS），中國菁華儀器有限公司；IVIS Spectrum小動物成像系統(tǒng)，美國PerkinElmer公司；Leica TCS SP5 LSM共聚焦顯微鏡，德國徠卡公司；Agilent Technologies LC/MSD TOF液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司.

1.2 中間體及目標(biāo)產(chǎn)物的合成

化合物6g～6j的合成路線如Scheme 1所示.

Scheme 1 Synthesis route of compound 6g—6j

1.2.1 1，2，3，3-四甲基-3H-吲哚-1-碘鹽（1A）的合成 在氮氣保護下，將1.59 g（10 mmol）2，3，3-三甲基-3H-吲哚、1.44 g（10.1 mmol）碘甲烷和50 mL MeCN混合，于80 ℃攪拌反應(yīng)8 h.將所得混合物減壓濃縮并用乙酸乙酯洗滌殘余固體，干燥后得到2.77 g粉紅色固體粉末，粗收率92%.產(chǎn)品未經(jīng)進一步純化，直接用于下一步反應(yīng).1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：7.94～7.88（m，1H），7.86～7.80（m，1H），7.66～7.58（m，2H），3.98（s，3H），2.78（s，3H），1.53（d，J=1.1 Hz，6H）.

1.2.2 1，1，2，3-四甲基-1H-苯并［e］吲哚-3-碘鹽（1B）的合成 以2.09 g（10 mmol）1，1，2-三甲基-1H-苯并［e］吲哚代替2，3，3-三甲基-3H-吲哚，采用合成化合物1A的方法合成化合物1B，得到3.16 g灰白色固體，產(chǎn)率90%.1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：8.36（d，J=8.4 Hz，1H），8.29（d，J=8.9 Hz，1H），8.22（d，J=8.2 Hz，1H），8.09（d，J=8.5 Hz，1H），7.79（dd，J=8.4，6.9 Hz，1H），7.73（t，J=7.5 Hz，1H），4.08（s，3H），2.86（s，3H），1.75（d，J=1.1 Hz，6H）.

1.2.3 1，4-二甲基吡啶-1-碘鹽（2A）的合成 以0.93 g（10 mmol）4-甲基吡啶代替2，3，3-三甲基-3H-吲哚，采用合成化合物1A 的方法合成化合物2A，得到2.12 g 黃色固體，產(chǎn)率90%.1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：8.86～8.79（m，2H），7.96（d，J=6.3 Hz，2H），4.28（s，3H），2.60（s，3H）.

1.2.4 1，4-二甲基喹啉-1-碘鹽（2B）的合成 以1.43 g（10 mmol）4-甲基喹啉代替2，3，3-三甲基-3H-吲哚，采用合成化合物1A 的方法合成化合物2B，得到2.54 g 黃色固體，產(chǎn)率89%.1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：9.35（d，J=6.1 Hz，1H），8.62～8.39（m，2H），8.34～8.19（m，1H），8.07（dd，J=14.2，6.8 Hz，2H），4.58（s，3H），3.01（s，3H，CH3）.

1.2.5 甲基苯并［cd］吲哚-2（1H）-酮的合成 在氮氣保護下，將5 g（29.6 mmol）苯并［cd］吲哚-2（1H）-酮與50 mL DMF 混合，在0 ℃及攪拌下加入2.8 g（118.3 mmol）NaH，攪拌反應(yīng)30 min 后，加入8.4 g（59.2 mmol）碘甲烷并在室溫下攪拌反應(yīng)5 h.將混合物倒入冰水中淬滅反應(yīng)，用1 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH值至中性，用飽和食鹽水洗滌并用乙酸乙酯多次萃取，然后用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮.殘留物經(jīng)硅膠色層析分離純化，用乙酸乙酯/石油醚（體積比1∶20）展開劑沖洗，得到4.95 g 黃綠色固體，產(chǎn)率91%.1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：8.18（d，J=8.1 Hz，1H），8.05（d，J=7.0 Hz，1H），7.80（dd，J=8.1，7.0 Hz，1H），7.64（d，J=8.3 Hz，1H），7.55（dd，J=8.5，7.0 Hz，1H），7.15（d，J=7.0 Hz，1H），3.35（s，3H）.

1.2.6 1，2-二甲基苯并［cd］吲哚-1-碘鹽（3）的合成 在氮氣保護下，將986 mg（5 mmol）甲基苯并［cd］吲哚-2（1H）-酮與10 mL THF 混合，加入2 mL 3 mol/L 甲基溴化鎂的THF 溶液，將混合物于60 ℃攪拌1 h.向混合物中加入10 mL 2 mol/L 鹽酸.減壓干燥除去THF，加入5 mL 1 mol/L KI 溶液，得到紅色沉淀.粗產(chǎn)物經(jīng)過濾后，用水和乙酸乙酯洗滌，得到1.36 g 橙色固體化合物3，產(chǎn)率84%.1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：8.99（d，J=7.2 Hz，1H），8.81（d，J=7.9 Hz，1H），8.57～8.40（m，2H），8.18（t，J=7.6 Hz，1H），8.02（t，J=7.8 Hz，1H），4.22（s，3H），3.20（s，3H）.

1.2.7 化合物4a，4b，5a，5b 的合成 參照文獻(xiàn)［26］方法合成化合物4a，4b，5a 和5b，其中化合物4a（N-乙基咔唑）為已知化合物.

化合物4b：1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：8.18（dt，J=7.7，1.0 Hz，2H），7.63（dt，J=8.2，1.0 Hz，2H），7.43（ddd，J=8.3，7.1，1.2 Hz，2H），7.29～7.15（m，7H），5.67（s，2H）.

化合物5a：1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：10.06（d，J=1.4 Hz，1H），8.76（d，J=1.6 Hz，1H），8.29（d，J=7.8 Hz，1H），8.00（dd，J=8.5，1.9 Hz，1H），7.78（d，J=8.5 Hz，1H），7.70（d，J=8.2 Hz，1H），7.54（t，J=7.7 Hz，1H），7.31（t，J=7.5 Hz，1H），4.51（q，J=7.1 Hz，2H），1.34（t，J=7.1 Hz，3H）.

化合物5b：1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：10.07（s，1H），8.80（d，J=1.6 Hz，1H），8.33（dt，J=7.8，1.0 Hz，1H），7.99（dd，J=8.5，1.6 Hz，1H），7.84（d，J=8.6 Hz，1H），7.72（dt，J=8.3，0.9 Hz，1H），7.52（ddd，J=8.3，7.1，1.2 Hz，1H），7.37～7.15（m，6H），5.76（s，2H）.

1.2.8 （E）-2-［2-（9-乙基-9H-咔唑-3-）乙烯基］-1，3，3-三甲基-3H-吲哚-1-碘鹽（6a）的合成 將3 g（10 mmol）化合物1A，2.28 g（10.2 mmol）化合物5a與50 mL 乙醇混合，滴加3～4滴哌啶作催化劑，將混合物于80 ℃攪拌反應(yīng)6 h.將混合物減壓濃縮，抽濾，濾餅用少量乙醇洗滌，干燥后得到4.25 g紅色固體粉末狀化合物6a，收率84%.1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：9.11（d，J=1.7 Hz，1H），8.65（d，J=16.1 Hz，1H），8.38（dd，J=8.6，1.6 Hz，1H），8.28～8.23（m，1H），7.89～7.82（m，3H），7.77～7.70（m，2H），7.65～7.57（m，3H），7.41～7.34（m，1H），4.55（q，J=6.5 Hz，2H），4.16（s，3H），1.85（s，6H），1.41～1.35（m，3H）.13C NMR（150 MHz，DMSO-d6），δ：181.62，155.62，143.67，143.43，142.42，140.88，129.34，129.11，127.48，126.27，123.63，123.27，122.86，121.04，115.03，110.69，109.76，52.17，44.24，38.02，34.57，26.30，22.68，22.07，14.33.HRMS-ESI（M+）calcd.for C27H27N2+，m/z：379.2169；found：379.2174.

1.2.9 （E）-2-［2-（9-苯基-9H-咔唑-3-）乙烯基］-1，3，3-三甲基-3H-吲哚-1-碘鹽（6b）的合成 以2.91 g（10.2 mmol）化合物5b 代替化合物5a，采用合成化合物6a 的方法合成化合物6b，得到4.66 g 紅色固體，產(chǎn)率82%.1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：9.12（d，J=2.6 Hz，1H），8.69～8.60（m，1H），8.40～8.32（m，1H），8.26（dd，J=8.1，2.7 Hz，1H），7.92～7.84（m，3H），7.77～7.69（m，2H），7.64～7.53（m，3H），7.31～7.19（m，6H），5.79（d，J=3.4 Hz，2H），4.23～4.06（m，3H），1.84（d，J=3.0 Hz，6H）.13C NMR（150 MHz，DMSO-d6），δ：181.68，155.47，144.06，143.70，142.43，141.44，137.61，129.36，129.18，128.00，127.58，127.30，126.63，123.70，123.28，122.92，121.30，115.09，111.23，111.17，110.05，52.21，46.44，44.25，34.53，26.24，22.69，22.08.HRMS-ESI（M+）calcd.for C32H29N2+，m/z：441.2325；found：441.2332.

1.2.10 （E）-2-［2-（9-乙基-9H-咔唑-3-）乙烯基］-1，1，3-三甲基-1H-苯并［e］吲哚-3-碘鹽（6c）的合成 以3.51 g（10 mmol）化合物1B代替化合物1A，采用合成化合物6a的方法合成化合物6c，得到4.45 g紅色固體，產(chǎn)率80%.1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：9.38（d，J=1.1 Hz，1H），9.24（d，J=2.3 Hz，1H），8.71（d，J=16.3 Hz，1H），8.50～8.43（m，3H），8.13（d，J=9.0 Hz，1H），8.03～7.90（m，3H），7.87～7.79（m，2H），4.80～4.52（m，2H），4.32（s，3H），2.08（s，6H），1.06（t，J=7.0 Hz，3H）.13C NMR（150 MHz，DMSO-d6），δ：192.34，182.42，154.49，143.53，140.87，140.01，137.82，133.42，131.22，130.51，128.74，127.24，126.31，123.51，122.88，121.34，120.60，110.07，60.23，53.82，44.26，37.86，35.15，26.06，22.69，22.06，14.18.HRMS-ESI（M+）calcd.for C31H29N2+，m/z：429.2325；found：429.2328.

1.2.11 （E）-2-［2-（9-苯基-9H-咔唑-3-）乙烯基］-1，1，3-三甲基-1H-苯并［e］吲哚-3-碘鹽（6d）的合成 以3.51 g（10 mmol）化合物1B代替化合物1A，2.91 g（10.2 mmol）化合物5b代替化合物5a，采用合成化合物6a的方法合成化合物6d，得到4.82 g紅色固體，產(chǎn)率78%.1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：8.87～8.79（m，3H），8.58（d，J=16.1 Hz，1H），8.35～8.26（m，4H），8.22（dd，J=7.8，1.1 Hz，1H），8.16（dd，J=8.6，1.7 Hz，1H），7.92（ddd，J=8.4，6.1，1.8 Hz，2H），7.75（d，J=8.7 Hz，1H），7.72～7.64（m，2H），7.52（ddd，J=8.3，7.0，1.2 Hz，5H），7.30～7.23（m，1H），4.51（q，J=7.1 Hz，2H），2.42（s，6H），1.36（q，J=6.9 Hz，3H）.13C NMR（150 MHz，DMSO-d6），δ：192.35，182.47，154.35，143.96，141.45，137.66，137.64，129.18，127.30，127.20，121.25，120.90，110.84，110.56，65.38，56.51，53.87，44.28，35.12，26.01，22.72，19.04，15.64.HRMS-ESI（M+）calcd.for C36H31N2+，m/z：491.2481；found：491.2490.

1.2.12 （E）-4-［2-（9-乙基-9H-咔唑-3-）乙烯基］-1-甲基吡啶-1-碘鹽（6e）的合成 以2.35 g（10 mmol）化合物2A代替化合物1A，采用合成化合物6a的方法合成化合物6e，得到3.78 g橙黃色固體，產(chǎn)率86%.1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：8.83～8.75（m，2H），8.58（d，J=1.7 Hz，1H），8.20（ddd，J=13.4，6.6，1.4 Hz，4H），7.94～7.87（m，1H），7.75（dd，J=8.6，1.2 Hz，1H），7.68（dd，J=8.0，1.3 Hz，1H），7.57～7.49（m，2H），7.33～7.25（m，1H），4.50（q，J=7.2 Hz，2H），4.24（d，J=1.3 Hz，3H），1.39～1.31（m，3H）.13C NMR（150 MHz，DMSO-d6），δ：153.57，145.22，142.82，141.42，140.63，126.95，126.70，123.25，123.21，122.61，121.66，120.99，120.42，120.16，110.35，110.20，47.15，37.74，14.26.HRMS-ESI（M+）calcd.for C22H21N2+，m/z：313.1699；found：313.1702.

1.2.13 （E）-4-［2-（9-苯基-9H-咔唑-3-）乙烯基］-1-甲基吡啶-1-碘鹽（6f）的合成 以2.35 g（10 mmol）化合物2A代替化合物1A，2.91 g（10.2 mmol）化合物5b代替化合物5a，采用合成化合物6a的方法合成化合物6f，得到4.40 g 紅色固體，產(chǎn)率90%.1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：8.81（d，J=6.7 Hz，2H），8.62（d，J=1.6 Hz，1H），8.27～8.13（m，4H），7.88（dd，J=8.8，1.6 Hz，1H），7.79（d，J=8.7 Hz，1H），7.69（d，J=8.3 Hz，1H），7.57～7.47（m，2H），7.33～7.18（m，6H），5.73（s，2H），4.24（s，3H）.13C NMR（150 MHz，DMSO-d6），δ：153.49，145.15，142.61，142.02，141.21，137.84，129.14，127.91，127.22，126.94，123.31，122.68，121.65，121.05，120.62，110.76，47.17，46.26.HRMSES（IM+）calcd.for C27H23N2+，m/z：375.1856；found：375.1860.

1.2.13 （E）-4-［2-（9-乙基-9H-咔唑-3-）乙烯基］-1-甲基喹啉-1-碘鹽（6g）的合成 以2.85 g（10 mmol）化合物2B 代替化合物1A，采用合成化合物6a 的方法合成化合物6g，得到3.97 g 紅色固體，產(chǎn)率81%.1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：9.28（d，J=6.6 Hz，1H），9.14（d，J=8.6 Hz，1H），8.88（s，1H），8.51（d，J=6.6 Hz，1H），8.48～8.35（m，3H），8.27（t，J=9.5 Hz，2H），8.14（d，J=8.6 Hz，1H），8.08（t，J=7.8 Hz，1H），7.78（d，J=8.6 Hz，1H），7.70（d，J=8.2 Hz，1H），7.55（t，J=7.7 Hz，1H），7.32（t，J=7.4 Hz，1H），4.52（s，5H），1.37（t，J=7.2 Hz，3H）.13C NMR（150 MHz，DMSO-d6），δ：153.51，148.02，145.37，141.74，140.69，139.29，135.34，129.43，128.00，127.17，127.01，126.59，123.34，122.75，122.37，121.06，120.26，119.73，116.65，115.58，110.27，44.88，37.78，14.29.HRMS-ES（IM+）calcd.for C26H23N2+，m/z：363.1856；found：363.1862.

1.2.14 （E）-4-［2-（9-苯基-9H-咔唑-3-）乙烯基］-1-甲基喹啉-1-碘鹽（6h）的合成 以2.85 g（10 mmol）化合物2B代替化合物1A，2.91 g（10.2 mmol）化合物5b代替化合物5a，采用合成化合物6a的方法合成化合物6h，得到4.80 g 紅色固體，產(chǎn)率87%.1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：9.30（d，J=6.7 Hz，1H），9.14（d，J=7.8 Hz，1H），8.91（s，1H），8.52（d，J=6.6 Hz，1H），8.44～8.38（m，2H），8.29（d，J=7.9 Hz，2H），8.15～8.06（m，2H），7.84（d，J=8.6 Hz，1H），7.72（d，J=8.2 Hz，1H），7.51（d，J=7.7 Hz，1H），7.37～7.28（m，2H），7.23（d，J=7.1 Hz，2H），5.77（s，2H），4.54（s，3H），1.24（s，3H）.13C NMR（150 MHz，DMSO-d6），δ：153.47，148.08，145.17，142.37，141.29，139.28，137.91，135.35，129.46，129.14，128.93，128.12，127.90，127.55，127.29，127.13，126.93，126.61，123.44，122.84，122.30，121.09，120.56，119.75，116.97，115.69，110.75，46.31，44.92.HRMSES（IM+）calcd.for C31H25N2+，m/z：425.2012；found：425.2019.

1.2.15 （E）-2-［2-（9-乙基-9H-咔唑-3-）乙烯基］-1-甲基苯并［cd］吲哚-1-碘鹽（6i）的合成 以3.09 g（10 mmol）化合物3代替化合物1A，采用合成化合物6a的方法合成化合物6i，得到3.19 g藍(lán)色固體，產(chǎn)率62%.1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：9.35～9.31（m，1H），9.19（d，J=1.1 Hz，1H），9.12～9.09（m，1H），9.06（s，1H），8.51（d，J=6.5 Hz，1H），8.47～8.39（m，4H），8.35（s，1H），8.32～8.25（m，1H），8.18～8.05（m，2H），7.92～7.86（m，2H），4.60（q，J=6.2 Hz，2H），4.55（s，3H），1.39（t，J=7.1 Hz，3H）.13C NMR（150 MHz，DMSO-d6），δ：155.97，150.39，143.80，142.21，140.71，138.51，135.29，130.74，129.05，128.33，128.16，127.16，123.32，123.24，122.68，121.19，120.43，119.22，114.80，110.40，46.75，37.84，14.60，14.29.HRMS-ESI（M+）calcd.for C28H23N2+，m/z：387.1856；found：387.1860.

1.2.16 （E）-2-［2-（9-苯基-9H-咔唑-3-）乙烯基］-1-甲基苯并［cd］吲哚-1-碘鹽（6j）的合成 以3.09 g（10 mmol）化合物3代替化合物1A，2.91 g（10.2 mmol）化合物5b代替化合物5a，采用合成化合物6a的方法合成化合物6j，得到3.34 g藍(lán)色固體，產(chǎn)率58%.1H NMR（400 MHz，DMSO-d6），δ：9.04～8.98（m，1H），8.88（s，1H），8.67（d，J=9.2 Hz，1H），8.59～8.51（m，2H），8.38～8.33（m，1H），8.29（dd，J=7.7，0.9 Hz，1H），8.20～8.12（m，2H），7.97～7.91（m，1H），7.90～7.83（m，2H），7.73（d，J=8.2 Hz，1H），7.58～7.49（m，1H），7.38～7.16（m，6H），5.20（d，J=7.3 Hz，2H），4.57（s，3H）.13C NMR（150 MHz，DMSO-d6），δ：155.91，150.06，146.08，143.95，142.76，141.26，138.47，137.73，135.79，135.39，131.10，130.75，129.51，129.16，128.33，128.17，127.97，127.26，126.83，125.98，123.42，123.19，122.72，121.27，120.75，119.14，115.10，110.80，47.64，46.83，46.32，22.74，14.53，13.84.HRMS-ESI（M+）calcd.for C33H25N2+，m/z：449.2012；found：449.2019.

1.3 性能表征

1.3.1 紫外和熒光光譜測定 在脫氧DMSO 中制備熒光探針6a～6g 的儲備溶液（1.0 mmol/L）.熒光探針（5，10，20 μmol/L）檢測溶液由含1%（體積分?jǐn)?shù)）DMSO 的水、乙腈和甲醇溶液配制，紫外吸收光譜用UV1800PC型分光光度計記錄.然后以最大吸收波長的激光作為激發(fā)源，記錄550～900 nm范圍內(nèi)的發(fā)射光譜.

1.3.2 熒光量子產(chǎn)率的測定 參考文獻(xiàn)［27］方法獲得熒光探針6a～6g在不同溶劑中的熒光量子產(chǎn)率，結(jié)果列于表1.

Table 1 Photophysical properties of carbazole derivatives in different solvents

1.3.3 熒光穩(wěn)定性測試 光穩(wěn)定性：將探針溶液以200 μL/孔的濃度加入96 孔不透明板中，采用NIR小動物成像系統(tǒng)成像.選擇600～700 nm濾光片連續(xù)照射6 h，激光功率為3 W.生理條件穩(wěn)定性：對照組將探針溶液加入等體積的PBS 緩沖液中；其余各組探針溶液分別添加20 μmol/L H2O2，GSH，Na+，K+，Cu2+，F(xiàn)e2+，Zn2+，Vc，NQO1，NTR和H+；于37 ℃孵育60 min后，測定上述溶液的熒光光譜.

1.3.4 細(xì)胞毒性 采用HeLa 細(xì)胞系評估近紅外熒光探針（6a～6j）的細(xì)胞毒性.首先，將細(xì)胞在37 ℃，5% CO2的96 孔板中培養(yǎng)24 h，然后去除培養(yǎng)基，將細(xì)胞暴露于不同濃度（1，10，100，1000，10000 和20000 nmol/L）的熒光探針中再培養(yǎng)24 h.隨后，采用噻唑藍(lán)比色法（MTT）評估HeLa細(xì)胞的細(xì)胞活力.

1.3.5 細(xì)胞共聚焦成像 通過共聚焦激光顯微鏡評估了化合物在HeLa細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器定位.將1×105HeLa細(xì)胞接種到35 mm玻璃底細(xì)胞培養(yǎng)皿中并孵育12 h，然后將所有細(xì)胞用PBS溶液洗滌2次，并在DMEM 培養(yǎng)基中與20 μmol/L 的熒光探針一起孵育4 h.然后，用PBS 溶液洗滌細(xì)胞并用Mito-tracker green 或Lyso-tracker green 染色1 h.熒光成像采用Leica TCS SP5 LSM 共聚焦顯微鏡成像，使用40×物鏡；熒光探針激光激發(fā)：450～550 nm，濾光片組：600～700 nm.Mito Tracker Green，激光激發(fā)：490 nm激光，濾光片組：490～550 nm.Lyso-tracker green，激光激發(fā)：510 nm 激光，濾光片組：510～550 nm.

1.3.6 體內(nèi)成像實驗 BALB/c裸鼠（6～8周齡，18～20 g）購自南通大學(xué)實驗動物中心.當(dāng)腫瘤體積達(dá)到約500 mm3時進行實驗.實驗前將BALB/c 小鼠隨機分組，將熒光探針6j（40 mg/kg）尾靜脈注入荷瘤BALB/c裸鼠體內(nèi)，在選定的時間點用含2.5%異氟烷的氧氣麻醉小鼠，并使用IVIS Lumina成像系統(tǒng)捕獲全身NIR熒光圖像.最后，小鼠被安樂死，并立即收集它們的心、肝、脾、肺、腎、腸道和腫瘤組織器官，在IVIS Lumina系統(tǒng)上進行離體熒光成像.

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光探針的合成與結(jié)構(gòu)表征

熒光探針分子6a～6g的結(jié)構(gòu)和合成路線如Scheme 1所示.首先，發(fā)色團在乙腈和碘甲烷作用下季胺化，以較高產(chǎn)率獲得季銨鹽1A，1B，2A和2B.另外，以1，8-萘內(nèi)酰亞胺為原料，通過在NaH和碘甲烷作用下發(fā)生N-甲基化反應(yīng)，并與格氏試劑甲基溴化鎂進一步反應(yīng)獲得發(fā)色團3，產(chǎn)率較高且無需純化.接著咔唑9 位N 在氫氧化鉀條件下與鹵代烷烴發(fā)生烷基化反應(yīng)，并在POCl3和DMF 作用下發(fā)生Vilsmeier-Haack反應(yīng)，獲得醛基咔唑衍生物5a和5b.最后，發(fā)色團3與咔唑醛基發(fā)生Knoevenagel縮合反應(yīng)，以較高產(chǎn)率和純度獲得目標(biāo)化合物.上述反應(yīng)條件溫和、后處理方便且不需要貴金屬催化，有利于降低制備成本.所有產(chǎn)物在空氣中都非常穩(wěn)定，并通過核磁共振波譜和高分辨質(zhì)譜進行了結(jié)構(gòu)表征.

2.2 熒光探針的光譜特性

圖1及表1示出了熒光探針的紫外-可見吸收光譜、熒光發(fā)射光譜、Stokes 位移以及熒光量子產(chǎn)率數(shù)據(jù).該系列咔唑熒光探針的最大發(fā)射波長均＞580 nm，其中發(fā)色團為1，4-二甲基喹啉-1-碘鹽和1，2-二甲基苯并［cd］吲哚-1-碘鹽的熒光探針6g～6j 最大發(fā)射波長均＞650 nm（其中6i 的最大發(fā)射波長達(dá)到672 nm）.值得注意的是，即使在水溶液中其最大發(fā)射波長也都達(dá)到近紅外區(qū).另外，熒光探針6g～6j的Stokes位移＞100 nm，熒光量子產(chǎn)率也較高，優(yōu)異的光學(xué)特性為體內(nèi)外熒光成像提供了基礎(chǔ).不同溶劑對探針熒光量子產(chǎn)率及其最大吸收和發(fā)射波長的影響并不是特別顯著，表明探針分子受溶劑影響較小.

Fig.1 Normalized absorbance and emission spectra of probes 6g—6j(A—D) in different solvents

2.3 熒光探針的穩(wěn)定性

為了進一步探究熒光探針6g～6j的穩(wěn)定性，進行了光穩(wěn)定性實驗.結(jié)果顯示，熒光探針6g～6j在長達(dá)6 h的光照下仍能夠保持較強的熒光強度（圖2）.另外，生命體擁有復(fù)雜的生理環(huán)境，實驗中考察了各種生理環(huán)境中的物種對探針熒光的影響.結(jié)果表明，絕大多數(shù)的生理物種對探針的熒光沒有顯著影響，但是酸性環(huán)境能夠提高探針的熒光強度，可能是季銨鹽基團在不同酸堿環(huán)境中使探針光學(xué)特性發(fā)生變化所致.

Fig.2 Optical and physiological stability of different probes

2.4 探針的細(xì)胞毒性及細(xì)胞攝取能力

采用噻唑藍(lán)比色法（MTT）評估了探針6a～6j 的細(xì)胞毒性.結(jié)果表明，探針細(xì)胞毒作用較弱（IC50＞20 μmol/L）（圖3），可見熒光探針安全性高.用正常人卵巢上皮細(xì)胞（IOSE-80）和人宮頸癌細(xì)胞（HeLa）對探針的攝取能力進行了分析.實驗結(jié)果表明，用探針6j 處理兩種細(xì)胞后，隨著孵育時間的變化，可以觀察到探針的紅色通道熒光增強，表現(xiàn)出時間依賴性變化.其中，HeLa 細(xì)胞對探針6j 的攝取速率明顯高于正常細(xì)胞，且在6 h后比正常細(xì)胞的熒光值提高了約3倍（圖4）.

Fig.3 Cytotoxicity of probes

Fig.4 Normal and HeLa cell uptake capacity in vitro

2.5 熒光探針對線粒體的靶向能力

研究表明，線粒體代謝與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，從而使線粒體成為癌癥治療的有前途的新靶點［28］.目前，帶正電荷的三苯基膦（TPP）在線粒體靶向癌癥治療中占據(jù)優(yōu)勢［29～31］，這歸因于超極化的腫瘤細(xì)胞膜和線粒體膜可能允許選擇性地積累線粒體靶向藥物［28］.因此，基于腫瘤細(xì)胞的線粒體膜電位高于正常細(xì)胞，使用離域親脂性陽離子作為載體的線粒體靶向策略是提高小分子抗腫瘤作用的優(yōu)勢策略.設(shè)計之初，我們選擇芳香親脂性陽離子片段作為發(fā)色團，并與親脂性咔唑母核連接來達(dá)到線粒體靶向作用.熒光共聚焦實驗結(jié)果表明，熒光探針和商用Mito-Tracker Green（線粒體探針）、Lyso-Tracker Green（溶酶體探針）一起孵育（圖5）.探針6g～6j 均與Mito-Tracker Green 的熒光信號顯著重疊，Pearson相關(guān)系數(shù)（PCC）均＞0.8，其中探針6j線粒體定位最佳，推測是咔唑N-9位引入的芳香環(huán)進一步增加了探針的脂溶性，使其更容易在線粒體蓄積.然而，探針與其他細(xì)胞器沒有定位作用，如溶酶體，其Pearson相關(guān)系數(shù)（PCC）較低.以上結(jié)果表明，該類探針在線粒體中選擇性積累，有可能成為準(zhǔn)確診斷腫瘤的潛在策略.另外，線粒體膜電位是監(jiān)測細(xì)胞健康狀態(tài)的重要生理參數(shù).由于該類探針在線粒體中選擇性積累，因此將其用于精確監(jiān)測線粒體膜電位變化（Δψm）.使用降低線粒體膜電位的化學(xué)氧化磷酸化抑制劑-間氯苯基腙（CCCP）處理后進行線粒體損傷示蹤，結(jié)果顯示，CCCP處理后探針的熒光明顯降低，與商用Mito-Tracker Green 結(jié)果保持一致且熒光變化更為顯著（圖6），表明該類探針還可用于監(jiān)測線粒體膜電位變化（Δψm）.

Fig.5 Colocalization assay of probe and commercial reagents

Fig.6 Performance of probe 6j in mitochondrial membrane potential

2.6 熒光探針體內(nèi)成像

由于探針6j優(yōu)異的光物理特性及對線粒體的高靶向能力，因此將其應(yīng)用到小鼠體內(nèi)熒光成像.所有小鼠均靜脈注射探針6j，荷瘤小鼠腫瘤部位的熒光強度隨時間逐漸增強.如圖7所示，荷瘤小鼠在注射8 h后表現(xiàn)出強烈的熒光，并保持在高強度水平至少12 h.此外，還收集了小鼠其它主要器官（心臟、肝臟、肺、脾臟、腎臟和腫瘤）.除腫瘤部位外，其它器官無明顯的熒光信號.上述結(jié)果表明，熒光探針在體內(nèi)主要分布在腫瘤部位，探針6j可作為腫瘤診斷探針，該探針通過實時監(jiān)測線粒體的變化來診斷腫瘤疾病.

Fig.7 Real-time in vivo fluorescence imaging of mice and isolated major organs

3 結(jié)論

以咔唑為母核，與不同的親脂性陽離子通過條件溫和、處理方便的方法合成了一系列線粒體靶向的近紅外熒光探針6g～6j.性能測試結(jié)果表明，該類探針具有近紅外發(fā)射、大Stokes位移和高熒光量子產(chǎn)率.細(xì)胞實驗結(jié)果表明，該類探針不僅可以進入活細(xì)胞，而且對細(xì)胞線粒體靶向性良好，熒光成像能力顯著.小鼠體外成像結(jié)果顯示，探針6j在體內(nèi)能夠分布在腫瘤組織并能進行熒光成像，為臨床上腫瘤的精準(zhǔn)診斷提供新的策略.