芽孢桿菌BC4鉻抗性相關(guān)基因chrA的克隆表達(dá)

蒼巖　陳旭　冉鐘呂　蔡亞君

摘 要：以芽孢桿菌BC4菌株為對象，通過對其鉻抗性相關(guān)基因chrA的克隆表達(dá)來測定其編碼蛋白ChrA還原Cr（VI）的能力以及該蛋白在芽孢桿菌Cr（VI）去除中的作用，可幫助進(jìn)一步闡明芽孢桿菌與Cr（VI）的作用機(jī)理，并為芽孢桿菌應(yīng)用于鉻污染治理奠定理論基礎(chǔ)。PCR擴(kuò)增出芽孢桿菌BC4菌株鉻抗性相關(guān)基因chrA，PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆與測序，得到chrA完整的DNA序列。該序列大小為1182bp，共編碼393個氨基酸，預(yù)測編碼蛋白分子量為43kDa。根據(jù)利用NCBI所進(jìn)行的BLAST序列比對結(jié)果，判斷該基因為鉻轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因。將chrA基因PCR產(chǎn)物雙酶切后連接到表達(dá)載體pET28b并轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL21中，對其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析。結(jié)果表明，chrA基因在大腸桿菌BL21中表達(dá)約43kDa的蛋白，與預(yù)期結(jié)果相符；重組菌株對Cr（VI）的耐受能力高于對照菌株，說明ChrA蛋白在芽孢桿菌BC4的Cr（VI）抗性機(jī)制中起重要作用，且重組菌株對Cr（VI）具備較強(qiáng)的抗性。

關(guān)鍵詞：芽孢桿菌；chrA基因；基因克隆與表達(dá)；重組菌株

中圖分類號：X172文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：2095－414X（2023）05－0025－06

0引言

Cr（VI）是一種極強(qiáng)的氧化物質(zhì)，在接觸到有機(jī)體時，會引起強(qiáng)烈的腐蝕性，對生物造成損害：Cr（VI）可通過消化道、呼吸道、皮膚及鼻粘膜進(jìn)入人體，在肝臟、腎臟、內(nèi)分泌腺等器官中積累，危害人體健康[1]；高濃度的Cr（VI）會抑制植物生長，導(dǎo)致葉片黃化和壞死[2]。Cr（VI）的毒性約是Cr（III）的100倍[3]，Cr（III）在土壤、水環(huán)境中均有分布，是人體必需的痕量飲食營養(yǎng)元素，相對Cr（VI）毒性較低。因此，對鉻污染的治理通常通過將Cr（VI）還原為Cr（III）以消除或減輕其危害。

目前有關(guān)Cr（VI）污染的治理方法主要有化學(xué)、物理、生物修復(fù)３種，其中化學(xué)還原[3]、吸附[5]、反滲透[6]、電化學(xué)[7-8]等方法處理價格昂貴，不能完全將重金屬去除，且試劑消耗高，會產(chǎn)生有毒污泥而造成二次污染。因此，這些方法還不適宜處理低濃度Cr（VI）污染[9]。與傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法正好相反，生物修復(fù)方法的優(yōu)點是能量和材料要求低，且無二次污染，這使得該方法更經(jīng)濟(jì)、環(huán)保和安全。

在幾種可行的方法中，耐鉻菌將Cr（VI）生物轉(zhuǎn)化為相對無毒的Cr（III）具有投資少、操作方便、不產(chǎn)生二次污染的優(yōu)點，其已逐漸發(fā)展為一種便宜又方便，處理也十分徹底的方法。微生物對于Cr（VI）的作用機(jī)制主要有還原機(jī)制和抗性機(jī)制[10]。大量研究已分離出可高效去除Cr（VI）的微生物，但微生物對Cr（VI）抗性機(jī)制仍不清楚，大多研究都是菌種的分離和去除特性的探究方向[12]，對于微生物的Cr（VI）抗性機(jī)制以及相關(guān)基因的編碼蛋白還需要進(jìn)一步探究。

本研究前期從土壤中篩選分離得到一株對Cr（VI）具有較強(qiáng)還原和耐受能力的細(xì)菌，初步鑒定為蠟樣芽胞桿菌，為探明該菌對鉻的抗性和還原機(jī)制，本研究對芽孢桿菌BC4的一個chrA基因進(jìn)行了克隆和表達(dá)，首先將chrA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后以pET28b為表達(dá)載體，將chrA基因連接到pET28b上進(jìn)行重組質(zhì)粒的構(gòu)建，然后篩選正確的重組質(zhì)粒將其導(dǎo)入受體細(xì)胞E.coli BL21中，再將其進(jìn)行Cr（VI）誘導(dǎo)表達(dá)。通過比較重組菌株和對照菌株胞內(nèi)粗提物的Cr（VI）耐受能力，分析chrA基因編碼蛋白的功能，并成功構(gòu)建了ChrA重組菌株。重組菌株對Cr（VI）具備較強(qiáng)的抗性能力，通過鉻還原菌對Cr（VI）抗性機(jī)制的研究，可為微生物應(yīng)用于治理環(huán)境鉻污染提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

芽孢桿菌BC4為本實驗室分離所得。表達(dá)載體pET-28b和感受態(tài)細(xì)胞E.coli BL21由實驗室-80℃超低溫冰箱內(nèi)保存。

1.2 菌種與質(zhì)粒

質(zhì)粒小提試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、2×Taq Master Mix酶、6×DNA loading buffer、BM2000 DNA Marker、1KB DNA Ladder均購自大連寶生物工程公司，BamHI、SalI限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶，均購自Sigma公司；瓊脂糖（Biowest公司），LB培養(yǎng)基（每升含10g胰蛋白胨，5g酵母粉，10gNaCl，固體培養(yǎng)基另添加2%瓊脂），卡那霉素使用濃度為50ug/mL；鼠抗His-tag稀釋液（一抗：封閉液為1∶2000，4℃保存，可短期內(nèi)重復(fù)利用三次），羊抗鼠IgG-HRP稀釋液（二抗：封閉液為1∶5000，4℃保存，可短期內(nèi)重復(fù)利用三次），抗體均購自武漢亞科因生物技術(shù)有限公司，其余均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純試劑。

1.3 細(xì)菌裂解液模板的制備和質(zhì)粒的提取

將活化后的芽孢桿菌BC4菌液劃線接種到含有LB培養(yǎng)基固體平板上，在培養(yǎng)箱內(nèi)（37℃）倒置培養(yǎng)12h，挑取菌落于無菌水中，震蕩懸浮至菌體全部分散，在沸水中水浴10min，立刻冰浴。離心取上清，即得PCR擴(kuò)增所用菌裂解液模板[13]。質(zhì)粒的提取按照質(zhì)粒小提試劑盒說明書操作。

1.4 芽孢桿菌chrA基因的克隆

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中chrA基因同源序列，利用軟件Primer Premier5設(shè)計引物：

ChrA-F：CGGGATCCCGTTGGAAAATAACAAATAC（引入BamHI酶切位點）

ChrA-R：GTCGACTTACAAAATGGATAGAATATATCCGC（引入SalI酶切位點）

引物由武漢科邁欣生物科技有限公司合成。以提取的芽孢桿菌BC4的DNA為模板，ChrA-F、ChrA-R分別為上、下游引物，2×PCR Master Mix酶擴(kuò)增chrA基因。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及程序如表1所示，1%瓊脂糖凝膠電泳測定PCR產(chǎn)物，并對正確PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA提純試劑盒提純回收。

1.5 感受態(tài)細(xì)胞的制備

感受態(tài)細(xì)胞的制備方法參考《分子克隆實驗指南》第三版（2002）[14]方法進(jìn)行。

1.6 基因表達(dá)載體的構(gòu)建

用T4連接酶將純化產(chǎn)物進(jìn)行連接，將雙酶切后的目的基因片段及表達(dá)載體 pET28a雙酶切產(chǎn)物連接，根據(jù)載體和目的片段的大小和摩爾比確定二者的使用量，計算得到的連接體系（25μl）：2.5μL 10×T4 DNA Ligase Buffer，20.5μL DNA，1μL載體質(zhì)粒，1μL T4 DNA Ligase。4℃條件下反應(yīng)72h。

連接完成后，65℃水浴加熱10min使連接酶失活。將全量25μL連接產(chǎn)物加入200μL E. coli BL21感受態(tài)細(xì)胞中混合均勻，冰置30min。在42℃恒溫水浴中加熱90s，即刻冰浴2min；加入890μL于37℃預(yù)熱過的LB液體培養(yǎng)基，混勻后，37℃，120rpm振蕩培養(yǎng)3h。取350μL培養(yǎng)產(chǎn)物于含50μg/mL卡那霉素的LB平板，緩慢晃動使液體培養(yǎng)物均勻分布在培養(yǎng)基表面，待晾干后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

培養(yǎng)16h后觀察平板菌落生長狀況，挑選單菌落接種至裝有5mL含50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基試管內(nèi)，過夜培養(yǎng)后取菌液提質(zhì)粒并采用BamHI/SalI雙酶切進(jìn)行目的基因驗證。

鑒定正確的質(zhì)粒即為chrA基因在質(zhì)粒pET28a T7啟動子控制下表達(dá)的重組質(zhì)粒，將其命名為pETChrA，重組菌株命名為E-pETChrA。

1.7 重組菌株的蛋白表達(dá)

將鑒定正確的重組菌株E-pETChrA轉(zhuǎn)接到5mL含50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，120rpm條件下震蕩培養(yǎng)過夜，2％接種量轉(zhuǎn)接至100mL的新鮮的含50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，當(dāng)培養(yǎng)至OD600約0.6時，加入終濃度為40mg/L的Cr（VI）誘導(dǎo)過夜培養(yǎng)，同時誘導(dǎo)空載體轉(zhuǎn)化菌株作為空白對照。12000rpm離心1min，收集菌體。

1.8 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE及Western-blot檢測

取15?L的4×Protein SDS-PAGE loading buffer和45?L的純化蛋白混合后，沸水浴10min，8000rpm、4℃下離心1min得到蛋白膠樣品。蛋白質(zhì)電泳使用的分離膠濃度為10%、積層膠濃度為5%。具體配方如表2所示，分別吸取上述溶液添加至50mL小燒杯中，輕柔且迅速地?fù)u晃燒杯10s使其混合均勻，此步驟的目的是使丙烯酰胺能夠快

速聚合，再在兩個玻璃板中間緩慢添加液態(tài)凝膠，向凝膠上添加適量無菌水至液面與玻璃板齊平，使凝膠表層無氣泡，將制膠裝放于35℃的恒溫箱中，等待30min，待凝膠聚合結(jié)束后，濾紙條將其上無菌水吸干。將5%積層膠（3mL體系）添加至50mL小燒杯中，輕柔且迅速地?fù)u晃燒杯10s使其混合均勻，在凝膠填充前插入一個規(guī)格為0.75mm的梳子，添加凝膠后，將制膠裝置放于35℃恒溫箱，等待30min。

取預(yù)染Marker3?L、煮沸離心后的蛋白膠樣品10?L，分別在孔內(nèi)點樣，連接蛋白質(zhì)電泳裝置，設(shè)置恒定電壓100V，接通電源進(jìn)行電泳，待樣品跑到下端終止跑膠，時長約2-2.5h，根據(jù)每次的跑膠速度適當(dāng)調(diào)整。跑膠結(jié)束后用超純水清洗，然后用染色液染色20min，超純水洗去浮色后再用脫色液脫色兩次，每次15min，上述步驟均在室溫的搖床內(nèi)操作，轉(zhuǎn)速調(diào)至60rpm，脫色結(jié)束后將蛋白膠過夜浸泡在7%冰醋酸中脫去底色，拍照記錄并觀察。

Western-blot具體操作為：SDS-PAGE電泳結(jié)束后未染色的凝膠切下實驗所需部分，將三層濾紙、PVDF膜、蛋白膠、三層濾紙依次放置于轉(zhuǎn)膜裝置中，加入電轉(zhuǎn)液，接通電源，電壓20V，電流60mA，轉(zhuǎn)膜1.5h至PVDF膜上；轉(zhuǎn)膜完成后在搖床里進(jìn)行TBST（2.4gTris-base，8.7gNaCl，再加入1ml TWEEN-20，加入超純水至1L容量瓶刻度線，調(diào)節(jié)pH為7.5，滅菌后使用，4℃保存）洗膜兩次各10min，室溫、60rpm；洗膜后用封閉液（1g脫脂奶粉溶于20mL無菌的TBST中）封閉2h；后續(xù)實驗步驟均在在4℃低溫環(huán)境下；封閉結(jié)束后用TBST洗膜三次各10min；再將清洗過的膜放入鼠抗His-tag稀釋液（一抗，1∶2000）中孵育過夜，孵育完成再用TBST洗膜三次各10min，再放入羊抗鼠IgG-HRP（二抗，1∶5000）中孵育1h，然后用TBST洗膜兩次各10min；最后利用DAB顯色試劑盒進(jìn)行結(jié)合有辣根過氧化物酶的膜的顯色檢測，

觀察出現(xiàn)條帶后立刻用無菌水沖洗顯色劑，終止顯色反應(yīng)并拍照。

1.9 重組菌株的Cr（VI）抗性檢測

為了檢測重組菌株E-pETChrA的Cr（VI）抗性是否增強(qiáng)，應(yīng)用平板劃線法將重組菌株E-pETChrA和對照菌株E-pET28b分別在固體培養(yǎng)基平板上接種，其中卡那霉素的濃度為50?g/mL，37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)12h；挑單菌落至5mL含50?g/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中活化，其中一組重組菌株E-pETChrA加入50mg/L的無菌Cr（VI）溶液進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，其他組不做特殊處理，37℃，120rpm條件下培養(yǎng)24h；將重組菌株及對照菌株的分別按照2%接種量分別轉(zhuǎn)接至裝有100mL含不同濃度Cr（VI）（0、30、50、80、100、130、160、200、240mg/L）的液體培養(yǎng)基錐形瓶中（體系內(nèi)卡那霉素的濃度為50?g/mL），培養(yǎng)24h后測定其OD600，繪制菌株在不同濃度Cr（VI）培養(yǎng)條件下生長情況圖。每組設(shè)置三個平行。

2結(jié)果

2.1 PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果

以芽孢桿菌BC4基因為PCR模板，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。由上述PCR產(chǎn)物的電泳圖片可知得到的PCR產(chǎn)物大小約1200bp，與chrA基因（1182bp）大小一致，說明PCR成功擴(kuò)增出了chrA基因DNA。

2.2 芽孢桿菌chrA基因編碼蛋白氨基酸序列分析

經(jīng)全基因組測序，得到ChrA的氨基酸序列如下：

MENNKYTFHTLLEIFLVSFKLGITSFGGPVAHLGYFHHEYVEKRKWMDERIYGDLVALCQFLPGPASSQVGMGVGLLRGGVFGAIISWIGFTLPSVLVLVFFASFLNQFDLGSAGWIHGLKLVAVAIVAHAIWGMAQKLTPDRNRATIAIATASIALLWPSSWTQVTLIIISGFIGWLLYRNEPISQSQHIKVPISKNIAVSCLVLFFGLLLLLPILRPFSYYIALFDSFYRSGALVFGGGHVVLPLLEGEFVQNGMMTKEQFLAGYGLTQAMPGPLFTFASYIGAVLNGTLGAILATIAIFLPAFLLVIGVLPFWDSVRKISFIQGALLGVNAAVVGILLAAFYDPIWTSTIMNAVDFVFASLLFCLLAFWKTPPWVIVILGAFGGYILSIL

由上可以得知chrA基因可以編碼393個氨基酸，其理論分子量約為43kDa。

將氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST序列比對，并構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，與chrA基因編碼的氨基酸序列同源性最高的是Bacillus cereus菌株chromate transporter WP000429767.1，同源性最高為99.75%，基本可判斷chrA基因編碼的蛋白屬于鉻酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，該類蛋白可將進(jìn)入細(xì)胞的鉻迅速轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞[15]，從而提高鉻還原菌對鉻酸鹽的耐受性。

2.3 重組表達(dá)菌株的鑒定

大量活化含表達(dá)載體質(zhì)粒的菌株E-pETChrA并提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒均用BamHI/SalI雙酶切后膠回收其酶切產(chǎn)物，電泳檢測結(jié)果見圖3，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示：泳道2表示酶切后形成的2個DNA片段條帶，大小分別約為5300bp和1200bp，與pET28b質(zhì)粒理論長度5369bp以及chrA基因理論長度1182bp十分接近，可初步定性認(rèn)為成功構(gòu)建重組質(zhì)粒。

2.4 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析及Western-blot檢測

分別在含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)對照菌株E-pET28b和重組菌株E-pETChrA，培養(yǎng)得到的菌液各取1mL離心后棄上清，菌體用60?L ddH2O懸浮混勻，加入4loading buffer混合均勻后沸水浴10min后自然冷卻，離心取上清。取預(yù)染marker 5?L、處理得到的蛋白膠樣品各10?L點樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果見圖4，預(yù)測蛋白的分子量與SDS-PAGE膠上的蛋白大小一致，為43kDa；經(jīng)Western-blot鑒定上述特異性條帶為重組菌株所表達(dá)的目的蛋白。

3、6：E-pETChrA）

2.5 重組表達(dá)菌株的表達(dá)產(chǎn)物活性分析

分別測定重組菌株E-pETChrA和對照菌株E-pET28b在含不同濃度Cr（VI）（0、30、50、80、100、130、160、200、240mg/L）的LB液體培養(yǎng)基中的抗Cr（VI）能力。由圖5可知重組菌株具有一定的Cr（VI）的抗性能力，其最高能耐受130mg/L的Cr（VI），即重組菌株E-pETChrA的抗Cr（VI）生長能力顯著高于對照菌株E-pET28b。即ChrA蛋白的表達(dá)賦予了大腸桿菌更高的Cr（VI）耐受能力。

Cr（VI）抗性同樣在不誘導(dǎo)和經(jīng)過50mg/LCr（VI）誘導(dǎo)兩種條件下測得。初始菌液濃度基本保持一致，隨著培養(yǎng)基中Cr（VI）含量的增加，經(jīng)過Cr（VI）誘導(dǎo)的E-pETChrA菌液濃度明顯高于未經(jīng)誘導(dǎo)的菌株。經(jīng)過Cr（VI）誘導(dǎo)的E-pETChrA對Cr（VI）的最大耐受能力為130mg/L，而未經(jīng)過Cr（VI）誘導(dǎo)菌株在30mg/LCr（VI）環(huán)境下很難存活下去，OD600均未達(dá)到0.2。

3結(jié)論

本文以一株具有Cr（VI）還原能力的細(xì)菌為對象，經(jīng)基因組測序鑒定其為芽孢桿菌屬，命名為BC4，對其鉻抗性相關(guān)基因chrA的克隆及表達(dá)進(jìn)行了研究。PCR擴(kuò)增出chrA基因，經(jīng)克隆與測序得到chrA完整的DNA序列。該序列大小為1182bp，編碼393個氨基酸，預(yù)測編碼蛋白分子量為43kDa。通過NCBI進(jìn)行BLAST序列比對，構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹，判斷該基因為鉻轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因。將chrA基因PCR產(chǎn)物擴(kuò)增進(jìn)行雙酶切后連接到表達(dá)載體pET28b并轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞BL21中，對其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析。結(jié)果表明，chrA基因在大腸桿菌BL21中表達(dá)的蛋白約43kDa，與預(yù)期結(jié)果相符；重組菌株對Cr（VI）的耐受能力遠(yuǎn)高于對照菌株，最高能耐受100mg/L的Cr（VI），說明ChrA蛋白在芽孢桿菌BC4的Cr（VI）抗性機(jī)制中起重要作用，重組菌株對Cr（VI）具備較強(qiáng)的抗性。該研究為將來將基因工程菌和Cr（VI）抗性基因在Cr（VI）污染土壤或水中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，因此，該技術(shù)的發(fā)展具有十分重要的意義。

參考文獻(xiàn)：

[1] 鄭慧玲.功能化氧化石墨烯復(fù)合材料的制備及其對污染物吸附研究[D]. 合肥：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)，2020.

[2] 郝旭濤.鉻鐵渣活化制備低溫陶瓷膠凝材料[D].昆明：昆明理工大學(xué)，2016.

[3] 陳龍，李啟婷，錢坤鵬.重金屬鉻污染土壤的修復(fù)技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 應(yīng)用化工， 2022，51（10）：3058-3062.

[4] Alvarado L， Torres I R， Chen A. Integration of ion exchange and electrodeionization as a new approach for the continuous treatment of hexavalent chromium wastewater[J]. Separation and Purification Technology， 2013， 105： 55-62.

[5] Xafenias N， Zhang Y. and Banks CJ. Evaluating hexavalent chromium reduction and electricity production in microbial fuel cells with alkaline cathodes. Int. J. Environ Sci Technol，2015， 12：2435-2446.

[6] Roychowdhury R， Mukherjee P， Roy M. Identification of chromium resistant bacteria from dry fly ash sample of Mejia MTPS thermal power plant， West Bengal， India[J]. Bulletin of environmental contamination and toxicology， 2016， 96（2）： 210-216.

[7] Sanjay M S， Sudarsanam D， Raj G A， et al. Isolation and identification of chromium reducing bacteria from tannery effluent[J]. Journal of King Saud University-Science， 2020， 32（1）： 265-271.

[8] Bruno L B， Karthik C， Ma Y， et al. Amelioration of chromium and heat stresses in Sorghum bicolor by Cr6+ reducing-thermotolerant plant growth promoting bacteria[J]. Chemosphere， 2020， 244： 125521.

[9] Kumari D， Li M， Pan X， et al. Effect of bacterial treatment

on Cr （VI） remediation from soil and subsequent plantation of Pisum sativum[J]. Ecological engineering， 2014， 73： 404-408.

[10] Thatoi H， Das S， Mishra J， et al. Bacterial chromate reductase， a potential enzyme for bioremediation of hexavalent chromium： a review[J]. J Environ Manage， 2014， 146： 383-99.

[11] Thatoi H， Das S， Mishra J， et al. Bacterial chromate reductase， a potential enzyme for bioremediation of hexavalent chromium： a review[J]. Journal of environmental management， 2014， 146： 383-399.

[12] 周思敏. Serratia sp.S2中ChrA1和ChrB基因的功能及抗鉻（VI）機(jī)制研究[D].重慶：重慶醫(yī)科大學(xué)，2018.

[13] 蔡亞君. 幾丁質(zhì)酶和殺蟲晶體蛋白對蚊蟲協(xié)同毒殺作用研究[D].武漢：中國科學(xué)院研究生院（武漢病毒研究所），2007.

[14] 薩姆布魯克.分子克隆實驗指南第三版上[M].北京：科學(xué)出版社，2002.

[15] 唐晨. Sporosarcina saromensis M52耐受Cr（VI）的機(jī)制研究與chrA工程菌株的構(gòu)建[D].廈門：廈門大學(xué)，2019.

Clonal Expression of Bacillus Cereus BC4 Chromium resistance-associated gene chrA

CANG Yana， CHEN Xua， RAN Zhong-lva，CAI Ya-juna，b

（a.School of Environmental Engineering;b.Engineering Research Center for Clean Production of Textile Dyeing and Printing，

Wuhan Textile University， Wuhan Hubei 430200， China）

Abstract：In this paper， Bacillussp. BC4 strain was used as the target， and its chromium resistance-related gene chrA was cloned and expressed to determine the ability of its encoded protein ChrA to reduce Cr（VI） and the role of this protein in the removal of Cr（VI） by Bacillus， which can help to further elucidate the mechanism of Bacillus and Cr（VI） and lay the theoretical foundation for the application of Bacillus to chromium pollution treatment. The PCR amplified the chromium resistance-related gene chrA of Bacillusstrain BC4， and the PCR product was cloned and sequenced to obtain the complete DNA sequence of chrA. The sequence size was 1182bp， encoding 393 amino acids， and the predicted molecular weight of the encoded protein was 43kDa. The expression product was analyzed by double digestion of the chrA gene PCR product and ligated into the expression vector pET28b and transformed into E. coli BL21. The results showed that the chrA gene expressed about 43kDa protein in E. coli BL21， which was consistent with the expected results; the tolerance ability of the recombinant strain to Cr（VI） was higher than that of the control strain， indicating that the ChrA protein played an important role in the Cr（VI） resistance mechanism of Bacillus BC4， and the recombinant strain possessed a strong resistance to Cr（VI）.

Keywords：Bacillus cereus; chrA gene; Gene cloning and expression; Recombinant strain

（責(zé)任編輯：周莉）

*通訊作者：蔡亞君（1980-），女，副教授，博士，研究方向：環(huán)境中重金屬的鈍化修復(fù)及其生態(tài)效應(yīng).