櫻桃流膠病拮抗內(nèi)生細(xì)菌的篩選與初步鑒定

郭建偉等

摘要：為了篩選櫻桃流膠病病原菌葡萄座腔菌拮抗內(nèi)生細(xì)菌，將櫻桃主干樹皮、一年生枝條、樹葉等櫻桃組織經(jīng)表面消毒后各取5 g置于無菌研缽中研磨，梯度稀釋后涂布LB培養(yǎng)基，挑取并純化內(nèi)生細(xì)菌，然后接種在PDA培養(yǎng)基上與葡萄座腔菌對峙培養(yǎng)，依據(jù)生理生化特征初步鑒定獲得的拮抗內(nèi)生細(xì)菌。結(jié)果表明，從櫻桃的主干樹皮、一年生枝條、葉片分別分離到內(nèi)生細(xì)菌10、5、6株，拮抗菌株4、2、2株，表現(xiàn)出明顯的組織分布差異性；其中C2-1、C2-2、C2-3、C3-6等4株拮抗內(nèi)生細(xì)菌的抑制率在50.0%～66.7%，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。8株拮抗內(nèi)生細(xì)菌經(jīng)生理生化特征鑒定均隸屬于芽孢桿菌屬。

關(guān)鍵詞：櫻桃流膠??；內(nèi)生細(xì)菌；拮抗；篩選；鑒定；芽孢桿菌

中圖分類號： S436.629文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0172-03

櫻桃流膠?。╟herry gummosis）是普遍發(fā)生的櫻桃病害之一，主要危害枝干，引起主干、枝條等流膠，輕者樹勢衰弱、果實產(chǎn)量及質(zhì)量降低，重者主枝甚至整株枯死[1]。流膠病又分為生理性流膠病和侵染性流膠病[1-4]，后者病原為葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothoidea）[3]和丁香假單胞菌（Pesudomonas syringae）[4]。據(jù)吳小芹等報道，葡萄座腔菌能引起5個屬針葉樹和40個屬闊葉樹的潰瘍、流膠、枝枯、果實腐爛，分布幾乎遍及全球[5]。該菌引起的櫻桃流膠病在山東、四川等地果園發(fā)病率在70%以上[1，6]，云南省的富民縣、馬關(guān)縣、魯?shù)榭h、石屏縣、彝良縣、紫溪鎮(zhèn)等地均有千畝以上的規(guī)?；N植，具有潛在的暴發(fā)風(fēng)險。目前，櫻桃流膠病的化學(xué)防治主要采用銅制劑，但殺菌劑的頻繁使用會導(dǎo)致致病菌產(chǎn)生抗藥性。生物防治以其不污染環(huán)境、無生態(tài)毒性、對人畜安全等優(yōu)點成為植物保護(hù)研究的熱點之一[7-8]。據(jù)高玲玲等報道，棉花、小麥、玉米、油菜、辣椒、馬鈴薯、芭蕉、葡萄等經(jīng)濟(jì)作物內(nèi)存在豐富的內(nèi)生拮抗細(xì)菌[9]。內(nèi)生細(xì)菌系統(tǒng)地分布于植物組織內(nèi)，既能受到植物組織的保護(hù)，還可以從植物組織持續(xù)不斷地吸收充足的碳源和氮源，比暴露于強(qiáng)烈的日光、紫外線、暴風(fēng)雨、干旱等惡劣環(huán)境的附生細(xì)菌具有更穩(wěn)定的生存環(huán)境，還具有固氮、促生、抗旱等生物學(xué)功能，具有良好的開發(fā)利用前景[9-10]。目前利用櫻桃流膠病拮抗內(nèi)生細(xì)菌的研究鮮見報道，本試驗旨在探索櫻桃內(nèi)生細(xì)菌的分離方法并篩選拮抗菌株，為櫻桃的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)提供潛在的生防菌株。

1材料與方法

1.1供試材料

櫻桃流膠病病原菌葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）BOD02、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）BAA01，由紅河學(xué)院云南省高校作物高效優(yōu)質(zhì)栽培重點實驗室提供；培養(yǎng)基：馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）、LB培養(yǎng)基。

1.2內(nèi)生細(xì)菌的分離

1.2.1樣品采集從云南省蒙自縣紅河學(xué)院校園分別采集櫻桃主干樹皮、一年生枝條、樹葉，置于無菌自封袋內(nèi)帶回實驗室分離內(nèi)生細(xì)菌。

1.2.2內(nèi)生細(xì)菌的分離和純化將樹皮、枝條、葉組織修剪整齊，分別放入75%乙醇中消毒5 min，再轉(zhuǎn)入含有效氯10%的NaClO中消毒5 min（樹皮、枝條）或2 min（葉），無菌水浸洗2～3次，最后用無菌濾紙吸干表面水分；同時，以最后1遍浸洗消毒組織的無菌水涂布上述平板作為對照檢驗消毒效果。分別取5 g樣品置無菌研缽中，加15 mL無菌水研磨，靜置50 s，再吸取上清液依次稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4，取30 μL分別涂布LB，置于30 ℃恒溫箱培養(yǎng)2～3 d；待長出菌落后，根據(jù)細(xì)菌形態(tài)、顏色、質(zhì)地、大小對不同的菌落反復(fù)劃線純化[11]。

1.3內(nèi)生細(xì)菌對櫻桃流膠病病原菌的拮抗測定

1.3.1葡萄座腔菌和內(nèi)生細(xì)菌的培養(yǎng)將葡萄座腔菌接種在PDA平板上，25 ℃恒溫培養(yǎng)，待菌絲長滿平板后轉(zhuǎn)4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；將純化的?nèi)生細(xì)菌接種于LB液體培養(yǎng)基，28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，離心12 min（6 000 r/min，4 ℃），取沉淀以無菌水懸浮并調(diào)整濃度為106 CFU/mL。

1.3.2拮抗測定用打孔器在菌落邊緣取直徑為5 mm 的病原菌菌餅，將菌絲面朝下接種于PDA平板的中央，28 ℃培養(yǎng)2 d后，在距病原菌30 mm 處對稱擺放相同孔徑的滅菌單層濾紙片，再吸取5 μL供試細(xì)菌懸浮液滴加在濾紙片上，每平板4株，3個重復(fù)，以浸潤無菌水的濾紙片為對照，繼續(xù)培養(yǎng)3～7 d，檢查是否有抑菌圈形成，并測量對照病原菌菌落的擴(kuò)展半徑（R0）與對峙培養(yǎng)病原菌的擴(kuò)展半徑（Ri），以下列公式計算相對抑制率（I）。

I=（R0-Ri）/R0×100%。

1.4拮抗菌株的鑒定

對拮抗性菌株及解淀粉芽孢桿菌BAA01（主要作為革蘭氏染色、芽孢染色的陽性對照）進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色、硝酸鹽還原反應(yīng)、V-P試驗、檸檬酸鹽利用、淀粉水解、接觸酶試驗、H2S反應(yīng)、酪蛋白水解、氧化酶反應(yīng)，以及葡萄糖、D-果糖、乳糖、D-甘露醇、D-木糖產(chǎn)酸、NaCl耐受性、生長溫度范圍測試等形態(tài)學(xué)及生理生化特征分析，初步鑒定內(nèi)生細(xì)菌[12]。

2結(jié)果與分析

2.1櫻桃內(nèi)生細(xì)菌的分離

利用涂布平板法，根據(jù)菌落的形態(tài)、顏色、質(zhì)地、大小等形態(tài)學(xué)宏觀特征劃線純化，分別從櫻桃的樹皮、枝條、葉分離內(nèi)生細(xì)菌10、5、6株，共計21株。結(jié)果表明，櫻桃不同組織內(nèi)生細(xì)菌的種群密度由大到小依次為樹皮（主干）>葉>枝（一年生），這種差異可能與櫻桃組織的年齡相關(guān)。

2.2內(nèi)生細(xì)菌對葡萄座腔菌的拮抗測定

采用對峙培養(yǎng)法利用PDA培養(yǎng)基篩選出對櫻桃流膠病葡萄座腔菌具有一定拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌8株，占測試內(nèi)生細(xì)菌的38.10%。其中，4株分離自櫻桃主干樹皮，2株分離自櫻桃一年生枝條，2株分離自櫻桃葉片；分離自主干樹皮的菌株C2-1、C2-2、C2-3及分離自樹葉的C3-6有較強(qiáng)的抑菌作用（表1）。

2.3拮抗內(nèi)生細(xì)菌的鑒定

以解淀粉芽孢桿菌BAA01作為參照菌株，對8株拮抗內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定，結(jié)果（表1）表明：C1-1、C2-1、C2-2、C2-3、C2-5、C3-5、C3-6等7株拮抗內(nèi)生細(xì)菌，革蘭氏染色、芽孢染色、硝酸鹽還原反應(yīng)、V-P試驗、檸檬酸鹽利用、淀粉水解、接觸酶試驗、H2S反應(yīng)、酪蛋白水解、氧化酶反應(yīng)，以及葡萄糖、D-果糖、乳糖、D-甘露醇、D-木糖產(chǎn)酸等均呈陽性，能耐受3%～7%的NaCl，不耐10 ℃的低溫與50 ℃的高溫；C1-3革蘭氏染色、芽孢染色、硝酸鹽還原反應(yīng)、V-P試驗、淀粉水解、接觸酶試驗、H2S反應(yīng)、酪蛋白水解、氧化酶反應(yīng)，以及葡萄糖、D-果糖、乳糖、D-甘露醇、D-木糖產(chǎn)酸等均呈陽性，檸檬酸鹽利用呈陰性，能耐受3%～7%的NaCl，不耐10 ℃的低溫與50 ℃的高溫。根據(jù)上述鑒定結(jié)果，參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[12]，可以初步確定上述菌株屬于芽孢桿菌屬。

3結(jié)論與討論

研究表明，內(nèi)生細(xì)菌廣泛分布于植物體根、莖、葉等器官、組織的細(xì)胞或細(xì)胞間隙[9，11，13-15]。本研究結(jié)果表明，櫻桃內(nèi)生細(xì)菌及拮抗內(nèi)生細(xì)菌的種群密度，主干樹皮明顯高于一年生枝條和葉片，這與植物內(nèi)生菌具有組織分布差異性、組織年齡的物種多樣性及種群密度較高的研究結(jié)果[16-17]是一致的。

據(jù)田甜等報道，從42份土樣中分離到山核桃干腐病葡萄座腔菌的拮抗真菌3株、拮抗放線菌2株[18]；劉雪紅等從1份鹽堿土中分離到1株冬棗輪紋病葡萄座腔菌拮抗性芽孢桿菌[19]。上述研究均是從不含病原菌葡萄座腔菌的異地土壤篩選拮抗菌株，而本研究從櫻桃的主干樹皮、一年生枝條、葉片篩選到8株流膠病葡萄座腔菌拮抗菌株，表明接近病原菌的材料或許含有更豐富的拮抗性微生物。本研究中4株拮抗菌株的相對抑菌率在50%及以上（尤其是內(nèi)生細(xì)菌C2-3達(dá)66.7%），表現(xiàn)出良好的潛在應(yīng)用價值；8株拮抗菌株經(jīng)生理生化鑒定為芽孢桿菌屬。芽孢桿菌以抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點已有商品化菌劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)病蟲害防治[9]，但生防菌的田間防效會因物理、化學(xué)、微生物種群等因素的影響而降低[20]，因而室內(nèi)篩選的生防菌尚需盆栽試驗進(jìn)一步驗證。表18株拮抗內(nèi)生細(xì)菌對櫻桃流膠病的相對抑菌率及生理生化特征

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