三株產(chǎn)乳酸芽孢桿菌共生培養(yǎng)胞外代謝產(chǎn)物的活性與成分分析

鐘日聰++劉影++徐春厚

摘要：對(duì)3株產(chǎn)乳酸芽孢桿菌共生培養(yǎng)產(chǎn)生的胞外代謝產(chǎn)物的活性與化學(xué)成分進(jìn)行了初步研究，用杯碟法測(cè)定代謝產(chǎn)物的抑菌活性，用氣相色譜質(zhì)譜儀（GC/MS）分析代謝產(chǎn)物的成分。結(jié)果表明，3株菌共生培養(yǎng)產(chǎn)生的胞外代謝產(chǎn)物有抑菌活性，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制作用強(qiáng)；胞外代謝產(chǎn)物中，4-叔丁基-2，6-二甲基-3，5-二硝基苯乙酮相對(duì)含量最高，為11.16%；其次是開司米酮（5.13%）和烯丙基苯酚（4.02%）；初步確定的抑菌物質(zhì)為烯丙基苯酚，芳香類物質(zhì)為4-叔丁基-2，6-二甲基-3，5-二硝基苯乙酮和開司米酮。

關(guān)鍵詞：芽孢桿菌；共生培養(yǎng)；代謝產(chǎn)物；抑菌物質(zhì)；芳香物質(zhì)

中圖分類號(hào)：S816.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）05-0915-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.05.031

Analyses on the Activity and Composition of Extracellular Metabolites from Symbiotic Culture Liquid of Lactic acid Bacillus Strain SC， SL1 and TR

ZHONG Ri-cong1，LIU Ying2，XU Chun-hou2

（1.Guangdong Guangken Animal Husbandry Co.，Ltd.，Guangzhou 510612，China；

2.Agricultural College，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，Guangdong，China）

Abstract： The antibacterial activity and chemical composition of extracellular metabolites produced by the Lactic acid Bacillus strain SC，SL1 and TR on symbiotic culture were studied using the method of cup dish and gas chromatography-mass spectrometer. The results showed that antibacterial substances existed in the extracellular metabolites produced by three Bacillus on symbiotic culture，it had strong bacteriostatic action to gram positive bacteria. In the extracellular metabolites，the 4-tert-butyl-2，6-dimethyl-3，5-dinitroacetophenone was the highest in the relative amount，for 11.16%， followed by cashmeran（5.13%） and allylphenol（4.02%）. Allylphenol was preliminary identified as the antibacterial substances，4-tert-butyl-2，6-dimethyl-3，5-dinitroacetophenone and cashmeran were the aromatic substances.

Key words： Bacillus； symbiotic culture； metabolite； antibacterial substance； aromatic substance

微生態(tài)制劑具有調(diào)節(jié)腸道功能紊亂、抑制病原菌繁殖、維持腸道內(nèi)菌群平衡、促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)和提高免疫力等作用[1，2]，且能夠解決服用抗生素帶來的耐藥性、二重感染及藥物殘留等問題，已被廣泛用于畜牧、水產(chǎn)養(yǎng)殖及飼料等行業(yè)[3-7]。微生態(tài)制劑的制備需要益生菌，而產(chǎn)乳酸芽孢桿菌是一類既能產(chǎn)生乳酸又能形成芽孢的革蘭陽(yáng)性桿菌，同時(shí)具有乳酸菌和芽孢桿菌的優(yōu)點(diǎn)，已成為最理想的益生菌之一[8]。芽孢桿菌SC、蠟狀芽孢桿菌SL1和芽孢桿菌TR是徐春厚等[9]分離鑒定的益生菌，為了探討3株產(chǎn)乳酸芽孢桿菌共生培養(yǎng)時(shí)的胞外代謝產(chǎn)物的活性及其化學(xué)成分，進(jìn)行了抑菌試驗(yàn)和氣相色譜質(zhì)譜儀（GC/MS）分析，以期為3株益生菌的開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

芽孢桿菌SC（Bacillus sp.sc，F(xiàn)J627944）、蠟狀芽孢桿菌SL1（Bacillus cereus SL1，F(xiàn)J627945）和芽孢桿菌TR（Bacillus sp. TR，F(xiàn)J627946），3株菌均產(chǎn)生乳酸和形成芽孢，由廣東海洋大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 GYP培養(yǎng)基 蛋白胨5 g/L，酵母粉5 g/L，葡萄糖20 g/L，pH 7.2，121 ℃滅菌20 min。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基 10%黃豆汁100 mL/L，白糖80 g/L，K2HPO4 1.5 g/L，NaCl 5 g/L，MgSO4·7H2O 0.6 g/L，MnSO4·H2O 0.1 g/L，115 ℃滅菌20 min。

1.3 指示菌

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸埃希菌（Escherichia. coli）、雞白痢沙門菌（Salmonella pullorum）、多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocide）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.4 芽孢桿菌共生培養(yǎng)液的制備

用GYP培養(yǎng)基分別活化3株產(chǎn)乳酸芽孢桿菌，按5%接種量和1∶1∶1的接種比例，同時(shí)加入的接種順序，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，再靜置培養(yǎng)24 h；將培養(yǎng)物4 000 r/min離心20 min，收集上清液，微孔濾膜過濾，濾液即為3株芽孢桿菌共生培養(yǎng)液；將未接菌的發(fā)酵培養(yǎng)基同上處理，即為空白培養(yǎng)液。

1.5 代謝產(chǎn)物的抑菌活性測(cè)定

將5種指示菌分別接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12 h，配制成106 CFU/mL的菌懸液，即為指示菌液。采用杯碟法[10]測(cè)定芽孢桿菌共生培養(yǎng)液的抑菌活性，用抑菌圈直徑的大小表示抑菌活性的高低；同時(shí)，用空白培養(yǎng)液同上處理作為對(duì)照。

1.6 代謝產(chǎn)物的成分分析

1.6.1 代謝產(chǎn)物的萃取 取3株芽孢桿菌的共生培養(yǎng)液，用二氯甲烷在中性、酸性、堿性條件下萃取，共萃取3次；對(duì)照為空白培養(yǎng)液的二氯甲烷萃取物。

1.6.2 GC/MS分析 采用石英毛細(xì)管柱DB-5（30 mm×0.25 mm×0.25 μm），色譜柱程序升溫條件：初始溫度60 ℃，初始溫度保持4 min后，以5 ℃/min的速率升溫至300 ℃，并保持5 min；載體：氦氣，不分流；柱前壓：123.3 kPa；進(jìn)樣口溫度310 ℃；EI源電子轟擊能：70 eV；離子源溫度：320 ℃；掃描質(zhì)量范圍：100～400 AMU；掃描間隔：0.5 s。

2 結(jié)果與分析

2.1 代謝產(chǎn)物的抑菌活性測(cè)定

3株產(chǎn)乳酸芽孢桿菌共生培養(yǎng)液的抑菌活性測(cè)定結(jié)果見表1。由表1可知，產(chǎn)乳酸芽孢桿菌共生培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生的胞外代謝產(chǎn)物對(duì)指示菌均有抑菌效果，其中對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等革蘭陽(yáng)性菌的抑制作用強(qiáng)，最大抑菌圈直徑可達(dá)29.7 mm；對(duì)大腸埃希菌等革蘭陰性菌的抑菌作用較弱，最小抑菌圈直徑僅為11.9 mm。

2.2 空白培養(yǎng)液二氯甲烷萃取物的GC/MS分析

經(jīng)GC/MS分析得到空白培養(yǎng)液萃取后的化學(xué)組分總離子流色譜圖（圖1），經(jīng)計(jì)算機(jī)內(nèi)存的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)檢索，確定空白培養(yǎng)基萃取物有25種成分，其中相似度在75%以上的有13種（表2），相對(duì)含量最高的是4-丁基聯(lián)苯，為14.12%；其次是鄰苯二甲酸二異辛酯和開司米酮，分別為10.93%和9.01%。

2.3 芽孢桿菌共生培養(yǎng)液的GC/MS分析

經(jīng)GC/MS分析得到3株產(chǎn)乳酸芽孢桿菌共生培養(yǎng)液萃取后的化學(xué)組分總離子流色譜圖（圖2），經(jīng)計(jì)算機(jī)內(nèi)存的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)檢索，確定出3株芽孢桿菌共生培養(yǎng)產(chǎn)生的胞外代謝產(chǎn)物成分有24種，其中相似度在75%以上的有15種（表3），相對(duì)含量最高的是開司米酮，為14.14%；其次是4-叔丁基-2，6-二甲基-3，5-二硝基苯乙酮和鄰苯二甲酸二異辛酯，分別為11.16%和8.43%。

2.4 共生培養(yǎng)液與空白培養(yǎng)液萃取物的主要成分比較分析

對(duì)3株芽孢桿菌共生培養(yǎng)液與空白培養(yǎng)液萃取物進(jìn)行GC/MS檢測(cè)，主要成分比較分析結(jié)果見表4。由表4可知，3株產(chǎn)乳酸芽孢桿菌共生培養(yǎng)液二氯甲烷萃取物中檢測(cè)出的相對(duì)凈含量最高的成分是4-叔丁基-2，6-二甲基-3，5-二硝基苯乙酮，達(dá)到11.16%；其次是開司米酮（5.13%）、烯丙基苯酚（4.02%）、二甲二甲氧基-硅烷（3.62%）、丙基雙環(huán)己基乙烯（3.53%）、沙丁胺醇（2.57%）、N-乙酰-L-纈氨酸（2.16%）；其中，開司米酮、二甲二甲氧基-硅烷、丙基雙環(huán)己基乙烯等成分在空白培養(yǎng)液二氯甲烷萃取物中亦檢測(cè)出來，但含量低于3株菌共生培養(yǎng)液；而4-叔丁基-2，6-二甲基-3，5-二硝基苯乙酮、烯丙基苯酚、沙丁胺醇、N-乙酰-L-纈氨酸等成分在空白培養(yǎng)基二氯甲烷萃取物中未檢測(cè)出來，應(yīng)該是3株乳酸芽孢桿菌共生培養(yǎng)產(chǎn)生的特有成分。

3 小結(jié)與討論

益生菌能夠產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，體外抑菌試驗(yàn)表明，乳酸芽孢桿菌能夠抑制大腸埃希菌、沙門氏菌等生長(zhǎng)的活性物質(zhì)[11]。王曉翠等[12]從健康仔豬糞中分離出2株乳酸芽孢桿菌，對(duì)大腸桿菌和傷寒沙門氏菌有抑菌作用。本試驗(yàn)結(jié)果亦證明了3株產(chǎn)乳酸芽孢桿菌共生培養(yǎng)時(shí)，能夠產(chǎn)生有抑菌作用的胞外代謝產(chǎn)物，但對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的抑制作用強(qiáng)，對(duì)大腸桿菌等革蘭陰性菌抑制作用弱。

3株產(chǎn)乳酸芽孢桿菌共生培養(yǎng)的胞外代謝產(chǎn)物的二氯甲烷萃取物主要化學(xué)成分及相對(duì)凈含量分別為：4-叔丁基-2，6-二甲基-3，5-二硝基苯乙酮（11.16%）、開司米酮（5.13%）、烯丙基苯酚（4.02%）、沙丁胺醇（2.57%）、N-乙酰-L-纈氨酸（2.16%）等；其中4-叔丁基-2，6-二甲基-3，5-二硝基苯乙酮又名酮麝香或麝香酮，有類似天然麝香香氣，香氣幻想逼真，用作化妝品香精和季節(jié)性用香精的定香劑，在醫(yī)學(xué)上有抗癡呆、抗炎、抗腫瘤等作用[13]；開司米酮具有獨(dú)特的花香、麝香香氣，是一種用途廣泛的香料品種，用于配制高檔香水和化妝品香精[14]；這表明乳酸芽孢桿菌共生培養(yǎng)后可產(chǎn)生芳香類物質(zhì)，添加到飼料中可改善飼料的適口性。產(chǎn)生的烯丙基苯酚具有抑菌殺菌作用，目前的研究主要針對(duì)植物病原菌如番茄灰霉病菌、蘋果腐爛病菌和小麥紋枯病菌有抑制作用[15]。沙丁胺醇具有較強(qiáng)的支氣管擴(kuò)張作用，主要用于平喘藥；N-乙酰-L-纈氨酸可用于蛋白質(zhì)合成，是動(dòng)物生長(zhǎng)和繁殖不可缺少的氨基酸。

通過抑菌試驗(yàn)及GC/MS分析，確定3株乳酸芽孢桿菌共生培養(yǎng)時(shí)，可以產(chǎn)生具有抑菌活性和芳香性作用的胞外代謝產(chǎn)物，主要是烯丙基苯酚、4-叔丁基-2，6-二甲基-3，5-二硝基苯乙酮和開司米酮。為3株乳酸芽孢桿菌的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供了試驗(yàn)依據(jù)。

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