美洲礬根愈傷組織誘導(dǎo)及其快繁技術(shù)體系研究

陳錦++楊侃侃++王志偉++朱菲瑩++賀愛國

摘要：以礬根（Heuchera micrantha）植株不同器官為外植體材料，MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，探索了礬根組織培養(yǎng)與快繁技術(shù)體系。結(jié)果表明，選取幼芽作為外植體時快繁效率最高，最適芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，采用4/5MS+0.2 mg/LNAA的生根培養(yǎng)方案較為適宜。

關(guān)鍵詞：礬根（Heuchera micrantha）；組織培養(yǎng)；愈傷組織；快繁

中圖分類號：S682.36；Q813.1+2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）05-0973-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.05.047

Study on Callus Induction and Its Rapid Propagation System

in America Heuchera micrantha

CHEN Jin，YANG Kan-kan，WANG Zhi-wei，ZHU Fei-ying，HE Ai-guo

（Hunan Institute of Watermelon and Melon，Changsha 410125，China）

Abstract： The different organs of Heuchera micrantha as explants were used to experiment by MS medium basic medium to explore the tissue culture and rapid propagation system of Heuchera micrantha. The results showed that it had the highest efficiency when buds were used as explants，the optimum bud induction medium formula was MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，and the most suitable rooting culture medium was 4/5MS+0.2 mg/L NAA.

Key words： Heuchera micrantha； tissue culture； callus； rapid propagation

礬根（Heuchera micrantha）又名珊瑚鈴，是虎耳草科礬根屬多年生草本花卉[1，2]。在美國的園林景觀中應(yīng)用廣泛，也是近些年從國外引入的多年生宿根花卉[3，4]。礬根具有喜半蔭、耐全光、淺根性、耐寒性和耐寒性強(qiáng)生理等特性[5-8]，多適用于園林林下花境、地被、庭院綠化等[9]。其主要采用分株方式繁殖，因品種更新速度快，而母株數(shù)量較少，導(dǎo)致擴(kuò)繁速度緩慢，短期內(nèi)難以大規(guī)模成苗[10，11]。若大批量引進(jìn)種苗又價格昂貴，這極大地制約了礬根類花卉品種更新和應(yīng)用的速度。本試驗以紫色宮殿礬根為材料，研究礬根類花卉組培快繁和基質(zhì)育苗技術(shù)，為國內(nèi)礬根類花卉工廠化育苗技術(shù)提供實踐指導(dǎo)和技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

礬根采自湖南省西瓜甜瓜研究所試驗基地花卉棚，分別選取其幼芽、葉柄和葉片為外植體材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體預(yù)處理和篩選 取外植體前一個月施用800倍稀釋后的多菌靈殺菌2次。選取生長勢旺盛、無病蟲害且幼芽側(cè)芽多的植株，且外表無明顯病斑和污物，用1%洗潔精溶液浸泡30 min，后用流水沖洗1 h。將外植體轉(zhuǎn)入超凈臺上無菌三角瓶中，用75%乙醇加0.1% Tween20處理外植體60 s，用無菌水清洗1次，再用0.1%升汞加0.1% Tween20消毒5～6 min，期間放入搖床180 r/min振蕩。再經(jīng)無菌水洗滌5～8次，去除殘留升汞。在MS+0.5 mg/L 6-BA+5 g瓊脂粉+30 g蔗糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，依據(jù)愈傷組織誘導(dǎo)率確定最適宜外植體。

1.2.2 繼代培養(yǎng)基的篩選 以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑，30 d后觀察各類培養(yǎng)基配方下愈傷組織生長勢及芽增殖數(shù)量。

1.2.3 生根培養(yǎng) 以不同濃度大量元素的MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加0.5 mg/L NAA+6 g瓊脂粉+30 g蔗糖+0.2 g活性炭。培養(yǎng)條件為22 ℃，光周期為16 h光照+8 h黑暗，光照度2 000～3 000 lx。

1.2.4 煉苗移栽 移栽前，在苗床大棚中放置3～5 d，使其適應(yīng)大田自然光溫環(huán)境。而后開蓋適應(yīng)有菌環(huán)境5 d，期間適當(dāng)噴水保濕，防止幼苗萎蔫。再洗去瓶苗基部培養(yǎng)基，并移栽入細(xì)泥炭與河沙（1∶1，V∶V，下同）混合基質(zhì)中。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體材料對礬根愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

試驗選取日光溫室栽培礬根幼芽、葉柄、葉片、莖段各100個作為外植體材料（重復(fù)3次），消毒后轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中（培養(yǎng)基加入頭孢青霉素500 mg/L，羧芐青霉素500 mg/L），以愈傷組織誘導(dǎo)率確定適宜外植體。由表1可知，礬根幼芽的誘導(dǎo)率最高，達(dá)到74%，且死亡率較低，與葉柄和葉片相比，是比較適合的組培材料。圖1為礬根幼芽誘導(dǎo)培養(yǎng)形成的愈傷組織。

2.2 愈傷組織繼代培養(yǎng)和芽誘導(dǎo)增殖

將經(jīng)過初代培養(yǎng)后獲得的帶有愈傷組織的無菌芽體轉(zhuǎn)入各類誘導(dǎo)芽增殖的培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)45 d，繼代培養(yǎng)基基本配方為MS+6 g瓊脂粉+30 g蔗糖+200 mg/L頭孢青霉素+200 mg/L羧芐青霉素。試驗結(jié)果（表2）顯示，當(dāng)6-BA濃度為2.0 mg/L和NAA濃度為0.5 mg/L時，幼芽增殖系數(shù)最高，新芽體大量叢生成球狀。雖然有輕度玻璃化，不過在后期的生根培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)輕度玻璃化的帶有愈傷組織的芽體可以在生根培養(yǎng)條件下解除玻璃化，正常生根并長出大量新葉，成為健壯植株。圖2為礬根幼芽愈傷組織誘導(dǎo)形成叢生芽。

2.3 生根培養(yǎng)

經(jīng)過45 d的幼芽誘導(dǎo)培養(yǎng)后，把叢生芽體分割成多棵幼嫩植株，連帶植株基部的愈傷組織一同轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中。在前期按照一般作物使用1/2MS培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)一段時間后，不論NAA使用濃度如何，都會出現(xiàn)重生芽體停止生長，葉色暗淡至枯萎，最終愈傷組織都會褐化死亡。而后將生根培養(yǎng)基中大量元素濃度增加到4/5MS大量元素+MS微量元素+MS鐵鹽+MS有機(jī)（肌醇100 mg/L+VB1 0.1 mg/L+VB3 1 mg/L+VB6 1 mg/L+谷氨酸2 mg/L），加入6 g瓊脂粉、30 g蔗糖、0.2 g活性炭和不同濃度NAA。試驗結(jié)果（表3）發(fā)現(xiàn)，在0.2 mg/L NAA和0.2 g/L AC的條件下礬根生根效果最為理想，根系粗壯、數(shù)量多，且上部莖桿生長旺盛葉片茂密，達(dá)到最適宜的標(biāo)準(zhǔn)。圖3為礬根愈傷組織叢生芽生根培養(yǎng)結(jié)果。

2.4 組培瓶苗移栽

將已大量生根的健壯瓶苗開蓋后放置于大棚內(nèi)，放置3～5 d進(jìn)行煉苗，期間注意每天灑水保濕，而后取苗洗盡根部培養(yǎng)基并用1 000倍多菌靈消毒，再栽培于細(xì)泥炭與河沙（1∶1）混合基質(zhì)中。覆膜并保持溫度20～25 ℃和濕度80%左右，每周使用一次800倍多菌靈殺菌，以防止真菌滋生，侵害弱苗。7～10 d后去掉覆膜，置于遮陽網(wǎng)下，保持較弱光照。三周后幼苗長出新葉，統(tǒng)計成活率接近80%（圖4）。

3 討論

在礬根快繁試驗過程中，發(fā)現(xiàn)幼芽為最適宜的外植體材料，其愈傷組織誘導(dǎo)率和芽增殖培養(yǎng)過程中的出芽率都明顯高于其他外植體材料。外植體消毒方法是獲取礬根無菌苗的關(guān)鍵技術(shù)。研究過程中發(fā)現(xiàn)，在取外植體前，提前14 d施用殺菌劑可有效降低誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中外植體的污染率。本試驗結(jié)果表明，葉柄和葉片在誘導(dǎo)培養(yǎng)時偶爾有根系發(fā)生但無新芽，說明其若有適合的培養(yǎng)條件也有誘導(dǎo)形成完整植株的可能。另外在試驗過程中還發(fā)現(xiàn)，礬根愈傷組織誘導(dǎo)時使用高濃度6-BA造成其玻璃化不會造成愈傷組織玻璃化致死，反而可誘導(dǎo)出大量叢生芽，在后續(xù)生根培養(yǎng)過程中這些叢生芽都可恢復(fù)成正常葉和莖，這樣處理大大加快了礬根組培快繁進(jìn)程。在生根試驗中按常規(guī)生根配方使用1/2MS培養(yǎng)時，愈傷組織褐化死亡，不能長成完整植株，需要提高培養(yǎng)基中大量元素濃度方可解決此問題，分析其原因可能是礬根的品種特性需要高濃度鹽分促進(jìn)其分化形成不定根，也可能是在芽誘導(dǎo)過程中使用高濃度6-BA造成愈傷組織和叢生芽體輕度玻璃化，生根時需要大量鹽分刺激其打破玻璃化繼續(xù)生長。礬根作為觀葉景觀植物在園林綠化中有著廣闊的應(yīng)用前景，本研究有效解決了傳統(tǒng)分根繁殖方式耗時費(fèi)力且繁殖系數(shù)低的難題，為以后礬根的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)?；缣峁┙梃b和技術(shù)參考。

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