芽孢桿菌aiiA基因抗病研究進展

陳珺君+閔勇+劉曉艷+楊自文

摘 要：aiiA基因編碼的AiiA蛋白是一類由芽孢桿菌產(chǎn)生的酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶，能夠?qū)Ｒ恍缘厮飧锾m氏陰性菌分泌的AHLs信號分子，從而破壞依賴群體感應(yīng)系統(tǒng)的致病機制，減輕病原菌的致病性。綜述了aiiA基因與AiiA蛋白的研究現(xiàn)狀、aiiA基因在抗病方面的研究進展及AiiA蛋白在工業(yè)發(fā)展的應(yīng)用現(xiàn)狀等，以期為aiiA基因在更多領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：芽孢桿菌；群體感應(yīng)；aiiA基因；N-?；呓z氨酸內(nèi)酯（AHLs）

1994年，F(xiàn)uqua等[1]將細菌之間的一種細胞密度依賴的基因表達調(diào)控機制命名為群體感應(yīng)（Quorum sensing，QS），其在能夠生物發(fā)光（冷光）的海洋細菌——費氏弧菌（Vibrio fischeri）中被發(fā)現(xiàn)。研究證明，群體感應(yīng)系統(tǒng)存在于許多細菌之中，參與自身的許多生理過程，并且與其致病性相關(guān)。該系統(tǒng)是一種被細菌所利用的的信號系統(tǒng)，通過對細胞密度的改變來調(diào)控許多動植物病原菌致病基因的表達。具體來說，細菌自身能夠分泌一種小的化學(xué)信號分子，被稱為自誘導(dǎo)物（Autoinducer，AI），具有可擴散性，可自由通過細胞壁和細胞膜。其隨著細菌數(shù)量的增加而增加，當(dāng)達到一個臨界濃度時，細菌群體就會表現(xiàn)為一個多細胞生命體，通過響應(yīng)信號分子來調(diào)控它們的群體行為，對高的細胞密度做出反應(yīng)，從而表現(xiàn)出單個細菌無法從事的某些生物行為和生理功能，獲得對自身有利的優(yōu)勢[2]。此外，研究者發(fā)現(xiàn)，細菌的群體感應(yīng)與動植物病原菌毒性因子的產(chǎn)生、生物膜的形成、抗生素的產(chǎn)生以及生物發(fā)光有關(guān)，被越來越多的細菌用于強化它們與其他細菌、真菌、植物和動物的生存競爭[3～5]?？紤]到許多細菌都為動植物病原菌，且利用群體感應(yīng)來調(diào)節(jié)自身生理過程增強其競爭力，因此，靶向干擾這種種內(nèi)間細菌交流的模式對醫(yī)學(xué)、環(huán)境、農(nóng)業(yè)都有著重要的意義，它已成為微生物研究的一大熱點。

研究發(fā)現(xiàn)，N-酰高絲氨酸內(nèi)酯（N-acylhomoserine lactones，AHLs）是一類廣泛存在于革蘭氏陰性細菌群體感應(yīng)系統(tǒng)中的信號分子，AHLs介導(dǎo)的革蘭氏陰性菌群體感應(yīng)系統(tǒng)是目前備受關(guān)注并且研究最有成效的[6]。研究表明，細胞合成AHLs信號分子和AHLs合成酶的活性相關(guān)，這種酶通常由LuxI的同源基因編碼，當(dāng)所累積的AHLs分子濃度達到一定閾值時，就會與費氏弧菌（Vibriofischeri）LuxR蛋白同源轉(zhuǎn)錄調(diào)控子相互作用[3]，這些調(diào)控子便可調(diào)控微生物的許多生理行為，如可誘導(dǎo)調(diào)控胡蘿卜軟腐歐文氏菌（Erwinia carotovora）、費氏弧菌（Vibriofischeri）和銅綠假單胞（Pseudomonas aeruginosa）等許多病原菌致病基因的表達[1]，根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）Ti質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移[1]，以及伯克氏菌（Burkholderia）的群集和蹭行運動、脂肪酶的產(chǎn)生、β-溶血作用、碳代謝等[7]。同時，它還能夠調(diào)控其他多種不同的生物功能，如毒力因子、抗生素、二級代謝物的產(chǎn)生、生物膜的形成、生成孢子以及生物發(fā)光等[3，8]。

研究發(fā)現(xiàn)，在大部分芽孢桿菌中存在的AiiA蛋白，能夠使AHLs的內(nèi)酯環(huán)斷裂導(dǎo)致其失活，從而破壞革蘭氏陰性細菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)，減弱動植物病原菌的致病性[9]。近年來，越來越多的研究報道了芽孢桿菌屬中分布有AiiA蛋白。因此，本文介紹了aiiA基因和AiiA蛋白的研究現(xiàn)狀，aiiA基因在植物抗病方面的進展和轉(zhuǎn)aiiA基因植物方面的應(yīng)用現(xiàn)況，以及AiiA蛋白在工業(yè)發(fā)展中的應(yīng)用現(xiàn)狀，為進一步研究aiiA基因奠定基礎(chǔ)。

1 aiiA基因和AiiA蛋白的研究

1.1 aiiA基因的克隆

從2000年Dong等[9]首次從芽孢桿菌240B1克隆了一種新的內(nèi)酯酶基因aiiA之后，國內(nèi)外對aiiA基因越來越關(guān)注，接著Dong等[10]又從不同來源的菌株中獲得了9個具有AHLs內(nèi)酯酶功能的基因，并對其基因序列進行分析，結(jié)果表明這些基因和aiiA240B1屬于同一個N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯酶家族。2004年，周燚等[11]根據(jù)蠟狀芽孢桿菌中的aiiA基因序列設(shè)計引物，從篩選得到的具有較強抗軟腐病活性的蘇云金芽孢桿菌H38中成功擴增出aiiA基因。河北工業(yè)大學(xué)的王艷敏[12]以馬鈴薯為材料，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌Bt4和蘇云金芽孢桿菌山東亞種ACCC10314能有效地抑制病原菌對馬鈴薯的侵染，證明這2種菌中含有水解AHLs的水解酶。根據(jù)文獻發(fā)表的基因序列設(shè)計特異性引物，從這2個菌株中克隆出了aiiA基因。

為了更好地研究aiiA基因的功能，黃天培等[13～15]分別從蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt），蠟質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus cereus，Bc）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，Bs）中成功克隆出了aiiA基因。近十幾年來許多研究也均能從Bt、Bc及Bs中克隆出aiiA基因，并在不同表達系統(tǒng)中表達具有高活性的AiiA蛋白。2013年丁賢等[16]根據(jù)細菌群體感應(yīng)信號降解酶（AiiA）基因設(shè)計簡并引物，從海洋微生物ZD02基因組中擴增編碼AiiA的基因aiiA，篩選其陽性克隆，測序后并對其進行序列分析。以上研究為該序列的重組表達及其相關(guān)活性研究奠定了基礎(chǔ)。

在國內(nèi)外學(xué)者的不斷探索下，最近對aiiA基因的來源有新的發(fā)現(xiàn)。Khoiri等[17]從31株細菌中分離出4株抗蘭花軟腐病致病菌Dickeya dadantii的細菌B37、BT2、GG3、GG6，通過對其16s rRNA進行序列分析，結(jié)果表明這些細菌和短小芽孢桿菌、蠟質(zhì)芽孢桿菌ATCC14579和蘇云金芽孢桿菌ATCC10792有很高的相似性，這是首次以短小芽孢桿菌作為群體淬滅細菌進行報道。

1.2 aiiA基因和AiiA蛋白的生物信息學(xué)分析endprint

隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，許多研究人員利用生物信息學(xué)的工具對aiiA基因的序列和AiiA蛋白的結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)aiiA基因有753個堿基，序列具有高度保守性和同源性[18]，與GeneBank上登陸的aiiA基因經(jīng)序列比對，相似度均在80%以上[19]。

AiiA蛋白含有250個氨基酸殘基，推測其分子量為28 kDa左右，等電點為4～5，含有金屬-β-內(nèi)酰胺酶超家族和鋅依賴的水解酶及乙二醛酶這2個結(jié)構(gòu)域[18]。該酶的氨基酸序列存在比較保守的區(qū)域，即HXHXDH基序，為含鋅水解酶家族的成員。在AHL水解酶中，His119、His188、His210組成催化活性中心。通過定點突變試驗，發(fā)現(xiàn)蛋白序列中保守區(qū)域和組氨酸殘基都是維持AiiA蛋白活性所必需的[9，12]。

2005年Liu等[20]利用單波長反常散射法測出了蘇云金芽孢桿菌AHL內(nèi)酯酶即AiiA蛋白的三維結(jié)構(gòu)，該研究表明該酶是金屬-β-內(nèi)酰胺酶家族的成員，并且在它的活性中心有2個鋅離子，這些鋅離子起著調(diào)控許多配體的作用，被認為是將AHLs水解為開環(huán)產(chǎn)物的親核試劑，能夠破壞革蘭氏陰性細菌的群體感應(yīng)。了解AiiA蛋白的詳細結(jié)構(gòu)和作用的機制，有助于我們研究出更有效的生物防治的方法，為解決依賴群體感應(yīng)系統(tǒng)的病害的消除提供一條新思路。

2 aiiA基因在抗病方面的進展

大部分動植物致病菌都為革蘭氏陰性細菌，利用群體感應(yīng)進行侵害[21]。當(dāng)其自身分泌的信號分子增加到臨界值時，細菌就會啟動自身致病基因的表達，從而達到使動植物致病的目的。例如主要由歐文氏菌（Erwinia）導(dǎo)致的馬鈴薯、蘭花、甜菜、玉米、胡蘿卜、芹菜、洋蔥等多種植物的軟腐病[10，22]，它能夠使正在生長以及儲存運輸中的植物發(fā)生腐爛；伯克氏菌（Burkholderia）群體感應(yīng)引起的羊紅細胞的β-溶血作用[7]；哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）導(dǎo)致的養(yǎng)殖對蝦和魚類的發(fā)炎充血癥狀[23]；以及銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，Pa）引起的呼吸道感染、敗血癥、骨髓炎、心內(nèi)膜炎和尿路感染等疾病[24]等。因此，尋找一條有效解決革蘭氏陰性致病菌群體感應(yīng)的途徑對動植物抗病來說非常有必要。近幾十年科研結(jié)果表明，AiiA蛋白對降解AHLs信號分子有著顯著的作用，所以，可以從aiiA基因著手，通過構(gòu)建工程菌以及轉(zhuǎn)基因動植物來抵抗病原菌的群體感應(yīng)。

2.1 構(gòu)建工程菌提高AiiA蛋白的活性

在aiiA基因的發(fā)現(xiàn)以及群體感應(yīng)系統(tǒng)研究更為深入之后，近年來許多研究將目標轉(zhuǎn)向了尋找可以高效表達AiiA蛋白的表達系統(tǒng)，其中包括大腸桿菌、芽孢桿菌及酵母等表達系統(tǒng)。為了提高AiiA蛋白的活性，周燚等[11]從Bt中克隆出aiiA基因，并利用大腸桿菌表達載體PET-28a在BL21（DE3）中進行表達，獲得大量的包涵體蛋白，致病性檢測純化的AiiA蛋白對魔芋軟腐病菌CZY具有較強的致病活性。楊梅等[25]克隆了6株來源不同的蘇云金芽孢桿菌中的aiiA基因，并將aiiA-B15基因插入到大腸桿菌表達載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達，經(jīng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后得到大量的融合蛋白，并對表達條件進行優(yōu)化，結(jié)果表明，0.6 mmol/L IPTG，30℃下誘導(dǎo)3 h為最佳誘導(dǎo)條件。致病性檢測表明，該融合蛋白對胡蘿卜歐文氏軟腐病菌具有較強的抗病作用。由于所表達的融合蛋白多為不可溶的包涵體，楊梅等[26]又經(jīng)過分離、變性溶解、復(fù)性獲得具有生物活性的蛋白質(zhì)，抑菌試驗證明，復(fù)性后的AiiA蛋白能夠有效抑制胡蘿卜歐文氏菌引起的馬鈴薯軟腐病。此外，楊梅等[27]還將蘇云金芽孢桿菌LLB15中aiiA基因克隆到pET-29a，在大腸桿菌BL21（DE3）中表達，經(jīng)過低溫IPTG誘導(dǎo)，獲得大量的可溶性蛋白，并在國內(nèi)外首次純化了帶6-His標記的AiiA蛋白。

研究表明，芽孢桿菌中的AiiA蛋白為一種胞內(nèi)蛋白，不能分泌到細胞外直接降解環(huán)境中的AHLs信號分子，且表達量低，因此構(gòu)建外源高效分泌表達AiiA蛋白的工程菌是一條有效的解決途徑。朱晨光等[28]利用重疊延伸PCR，用殺蟲晶體蛋白基因cry3Aa啟動子替換aiiA基因本身的啟動子，構(gòu)建了融合基因pro3A-aiiA并裝入穿梭載體pHT304，得到重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化Bt無晶體突變株BMB171，結(jié)果重組菌株AiiA蛋白表達量大幅度增加，并且對降解AHLs和抑制胡蘿卜歐文氏菌感染馬鈴薯的能力也明顯增強。這一研究成功將AiiA蛋白分泌到胞外，解決了AiiA蛋白表達和降解信號分子AHLs的局限性，大大提高了對病原菌的抑制作用。吳懷光等[29]為了進一步提高抗軟腐病工程菌的抗病活性，除了用殺蟲晶體蛋白基因cry3Aa啟動子來提高aiiA基因的表達量外，還利用蘇云金芽孢桿菌s-層表面展示系統(tǒng)構(gòu)建了融合基因slh-aiiA，將2個融合pro3A-aiiA和slh-aiiA基因單獨或同時裝入穿梭載體中，轉(zhuǎn)化蘇云金芽孢桿菌無晶體突變株BMB171，同時利用溫度敏感型輔助質(zhì)粒pEG922，在Bt體內(nèi)發(fā)生同源重組，消除抗性基因等非必需片段，減少質(zhì)粒的壓力。結(jié)果獲得的3個重組菌都能在Bt中穩(wěn)定高效地表達AiiA蛋白，其降解AHLs分子的能力和對胡蘿卜軟腐歐文氏菌的抑制作用都有所增強，且同時裝入2個融合基因AiiA蛋白的表達量和活性最高。這種同時將2個融合基因裝入同一表達載體的方法，對我們提高蛋白的表達量及活性有著重要的啟示，為基因工程操作提供了一種新方法。

此外，國內(nèi)外學(xué)者為了獲得高效的生防效果，紛紛將aiiA基因轉(zhuǎn)入熒光假單胞菌中表達AiiA蛋白。2003年，Molina等[30]把aiiA基因轉(zhuǎn)入生防效果不顯著的熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）P3中，構(gòu)建了能夠降解AHLs的生物防治菌株，轉(zhuǎn)化株P(guān)3/pME6863能夠顯著地減弱由胡蘿卜歐文氏菌導(dǎo)致的馬鈴薯腐爛以及土壤農(nóng)桿菌導(dǎo)致的番茄冠癭病。張霞等[31]將aiiA基因?qū)氲街参锔H促生熒光假單胞菌P303中，構(gòu)建了防治效果良好的植物工程菌，其能在一定程度上抑制馬鈴薯和大白菜的軟腐病。endprint

婁瑞娟等[32]將aiiA基因克隆到畢赤酵母表達載體pPIC3.5K，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，經(jīng)一系列篩選過后獲得高拷貝表達盒的酵母轉(zhuǎn)化子，誘導(dǎo)表達后經(jīng)RT-PCR可檢測到重組菌中編碼aiiA基因的mRNA，同時SDS-PAGE和Western blot檢測結(jié)果顯示，aiiA基因在畢赤酵母中成功表達，以紫色桿菌突變株CV026為指示菌檢測發(fā)現(xiàn)目的蛋白能夠降解N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯。

為了提高AiiA的表達量，近年來許多研究利用在不同表達系統(tǒng)中密碼子的偏好性，通過優(yōu)化aiiA基因密碼子的方式來實現(xiàn)。

曾世涌等[33]對蘇云金芽孢桿菌中aiiA基因的密碼子使用情況進行分析，比較了aiiA基因在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌以及畢赤酵母中的密碼子偏好性。結(jié)果表明，aiiA基因偏好使用以A、T結(jié)尾的密碼子，且aiiA基因的密碼子用法在這幾種菌中都有不同程度的偏好差異，其中與畢赤酵母的密碼子用法差異最大；比較了aiiA基因分別以這幾種菌為宿主時密碼子的使用頻率，發(fā)現(xiàn)都存在不同程度的低頻密碼子聚集現(xiàn)象，這為以后在上述幾種表達系統(tǒng)中實現(xiàn)aiiA基因的高效表達提供了新思路。2014年，簡思美等[34]利用定點突變技術(shù)，對aiiA基因進行密碼子優(yōu)化，在畢赤酵母中進行分泌表達，抗病性實驗分析結(jié)果表明，分泌表達的AiiA蛋白能有效抑制胡蘿卜軟腐歐文氏菌（Erwinia carotovora）的致病性；之后，簡思美等[35]基于畢赤酵母基因組偏好密碼子數(shù)據(jù)表對編碼AiiA蛋白的堿基序列進行密碼子優(yōu)化，并構(gòu)建多拷貝重組表達載體，成功表達出具有活性的AiiA蛋白。試驗結(jié)果表明，優(yōu)化后aiiA基因的表達量較優(yōu)化前的表達量有成倍地提高，但優(yōu)化后的多拷貝表達量增加并不明顯，結(jié)果表明優(yōu)化密碼子可以有效提高AiiA蛋白在畢赤酵母中的表達量，但是多拷貝表達載體對AiiA的表達促進作用并不顯著，提示未來探索AiiA蛋白在畢赤酵母中的高表達時，通過增加拷貝數(shù)來提高產(chǎn)量并不是一個很好的途徑，而進行密碼子的優(yōu)化可以有效提高產(chǎn)量。此外，AiiA蛋白在畢赤酵母中的分泌表達，拓寬了AiiA蛋白的獲取途徑，為AiiA蛋白的產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)。

2.2 轉(zhuǎn)aiiA基因植物的抗病研究

相比較傳統(tǒng)的昂貴且對環(huán)境不利的化學(xué)抗病方法，轉(zhuǎn)基因技術(shù)對于植物抗病研究也是一種有效的應(yīng)對群體感應(yīng)系統(tǒng)的途徑。2001年，Dong

等[36]將aiiA基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯和煙草花葉中后，這2種轉(zhuǎn)基因植物表達的AHL內(nèi)酯酶能夠淬滅群體感應(yīng)的信號分子，并且提高對胡蘿卜軟腐歐文氏菌的抗性。柴鑫莉等[37]和Ban等[38]分別將蘇云金芽孢桿菌的aiiA基因的密碼子進行優(yōu)化后，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法將人工合成優(yōu)化后的aiiA基因?qū)牖в笾校珹HLs酶活性檢測表明轉(zhuǎn)aiiA魔芋葉片的蛋白可以降解AHLs信號分子。且有相關(guān)研究證明，aiiA基因在轉(zhuǎn)基因魔芋中是穩(wěn)定和可遺傳的[39]。陳磊等[40]利用PCR技術(shù)從馬鈴薯塊莖基因組DNA中克隆塊莖特異性啟動子patatin，從蘇云金芽孢桿菌218中克隆aiiA基因，構(gòu)建抗軟腐病植物表達載體pBI121-patatin-aiiA，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將aiiA基因?qū)牖в?，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化后的植株經(jīng)GUS染色，僅在花魔芋的球莖部位出現(xiàn)藍色斑點，經(jīng)PCR檢測，RT-PCR及Southern雜交檢測證實aiiA基因已整合到花魔芋基因組，初步表明aiiA基因可在魔芋球莖內(nèi)特異性表達。本研究對今后魔芋通過分子遺傳工程改良軟腐病抗性具有一定的應(yīng)用價值。

細菌軟腐病也是石斛蘭及其他蘭花栽培和生產(chǎn)中的一大病害。潘麗晶等[41]從Bt菌中克隆出aiiA基因，并裝載入植物表達載體構(gòu)建出pSAN載體轉(zhuǎn)入石斛蘭中，獲得了轉(zhuǎn)aiiA基因植株，肖揚[42]將aiiA基因和抗菌肽hacD基因的成熟肽片段融合插入到一個雙元轉(zhuǎn)化載體中，構(gòu)建了高效植物表達載體pC-AH。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化石斛蘭，經(jīng)過PCR、Southern blot分析，從13株獲得的抗性轉(zhuǎn)基因苗中確定了3株抗性苗的基因組中已整合了融合基因aiiA-hacD。這些研究為獲得具有抗軟腐病的石斛蘭品種打下基礎(chǔ)。

尾巨桉是尾葉桉與巨桉雜交種，樹高40m以上用途廣泛，但隨著桉樹林的擴大，病蟲侵害這一問題已逐漸成為桉樹種植的一大障礙。為了提高其抗病害的能力，Ouyang等[43]從枯草芽孢桿菌中克隆aiiA基因，構(gòu)建植物表達載體Pcam-PPP3-aiiA，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入尾巨桉中進行表達，RT-PCR檢驗表明aiiA基因成功導(dǎo)入巨尾桉，致病性檢測結(jié)果表明轉(zhuǎn)aiiA基因植物較非轉(zhuǎn)基因而言，能夠延遲萎蔫和降低疾病的病情指數(shù)。這些試驗表明，aiiA基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達水平很高，足以減弱病原菌的生長以及疾病的發(fā)展，也意味著這種方法可以應(yīng)用于其他農(nóng)作物，以達到增強抵抗植物病原菌能力的目的。

除了利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法獲得轉(zhuǎn)aiiA植物，我國學(xué)者還嘗試了幾種其他將外源基因?qū)胫参锏姆椒?。例如韓麗偉[44]利用花粉管道法將aiiA基因轉(zhuǎn)入大白菜二牛心品種中獲得轉(zhuǎn)aiiA基因大白菜；張言朝等[45]用子房注射法對南瓜子房進行aiiA基因的遺傳轉(zhuǎn)化等，這些研究表明，基因操作技術(shù)的進步為轉(zhuǎn)基因植物的發(fā)展奠定了堅實的技術(shù)基礎(chǔ)，有利于我們獲得更有益的轉(zhuǎn)基因植物及食品。

3 AiiA蛋白在酶的工業(yè)化方面的進展

AiiA蛋白是一種非常好的用于發(fā)展生物凈化藥物的材料，它能夠破壞工業(yè)和環(huán)境微生物的群體感應(yīng)系統(tǒng)，但對于AiiA的商業(yè)化生產(chǎn)來說，有幾個局限，包括酶生產(chǎn)的高成本和缺少從應(yīng)用環(huán)境中回收再利用的方法。對于高成本的問題，可以通過相同成本使產(chǎn)量最大化。Rajesh等[46]利用響應(yīng)優(yōu)面化（RSM）及中心合成設(shè)計軟件優(yōu)化植物內(nèi)生菌產(chǎn)氣腸桿菌培養(yǎng)條件，以C6-HSL為底物，和內(nèi)生植物病菌的上清液共培養(yǎng)，以紫色桿菌CV026作指示菌，設(shè)計不同培養(yǎng)溫度，共培養(yǎng)時間，底物濃度及pH值來檢驗AHL內(nèi)酯酶的產(chǎn)量以及相對活性，活性檢測結(jié)果表明，植物內(nèi)生菌產(chǎn)氣腸桿菌能夠有效地抑制紫色桿菌素的產(chǎn)生，且優(yōu)化培養(yǎng)條件后增加了1.33倍的相對活性；二次回歸模型的方差數(shù)據(jù)分析表明RSM模型非?？煽?，有著較高的回歸系數(shù)以及低的變異系數(shù)。由此可見，優(yōu)化培養(yǎng)條件的策略對于酶的最大產(chǎn)生是一種非常有價值的手段。endprint

AiiA蛋白商業(yè)化的另一個局限性是從環(huán)境中回收再利用，也有一些專家做過一些嘗試。

Beladiya等[47]克隆、純化了重組的AiiA蛋白（r-AiiA），將其共價固定在磁性納米粒子（MNPs）上，并且在水溶液中對r-AiiA-MNPs納米生物催化劑群體感應(yīng)淬滅的能力進行檢測，結(jié)果表明它能夠水解3-O-C10AHL以及在水溶液中抑制群體感應(yīng)，并且利用外部磁場能夠?qū)⑵鋸姆磻?yīng)混合物中再生，且多次再生的r-AiiA-MNPs仍能夠水解3-O-C10AHL。

4 研究目的、意義及前景展望

隨著對AHLs信號分子調(diào)控的群體感應(yīng)系統(tǒng)（QS）研究的深入，細菌的AiiA蛋白在抑制許多病原菌中發(fā)揮越來越重要的作用，已經(jīng)成為解決利用群體感應(yīng)細菌病害的新方法，但其中仍有許多機制和過程不太清楚，有待進一步研究和探索。例如，如何讓來源于芽孢桿菌的aiiA在外源表達系統(tǒng)中高效表達，并且有抑菌活性；來源不同的aiiA基因，降解AHLs的效果差異很大的原因以及AiiA蛋白在細胞生長過程中何時發(fā)揮作用。此外，對于農(nóng)業(yè)和工業(yè)來說，AiiA蛋白的酶活力、熱穩(wěn)定性和存儲穩(wěn)定性極其重要。因此，發(fā)現(xiàn)新的aiiA基因，研究細菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控機理，不僅具有重要的理論意義，而且具有重要的實踐價值。目前研究aiiA基因的表達系統(tǒng)多集中在大腸桿菌、蘇云金芽孢桿菌、酵母等微生物中，除此之外，枯草芽孢桿菌也是當(dāng)下研究和應(yīng)用十分廣泛的微生物殺菌劑之一，其菌種資源十分豐富，能夠分泌抑菌物質(zhì)和多種抗菌多肽，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)行業(yè)。因此，在芽孢桿菌中表達aiiA基因，產(chǎn)生高效的AiiA蛋白，對構(gòu)建植物生防菌有著重要的啟示。另外，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物也是預(yù)防病原菌的一條重要的途徑，所以我們要深入研究AiiA蛋白的作用機制，利用基因工程的工具，為構(gòu)建更高效、廣譜的殺菌劑或殺蟲劑奠定基礎(chǔ)。

參考文獻

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