• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    不同酶處理的啤酒酵母蛋白酶解液功能肽組學(xué)分析

    2023-11-16 13:50:30燕禹彤高春雨張曉梅安子哲馬蘊(yùn)真韓林林張鴻偉
    色譜 2023年11期
    關(guān)鍵詞:啤酒酵母蛋白酶解木瓜

    燕禹彤, 高春雨, 張曉梅, 安子哲,馬蘊(yùn)真, 韓林林, 張鴻偉*, 趙 雪*

    (1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島 266003; 2.青島海關(guān)技術(shù)中心,山東 青島 266109; 3.山東大學(xué)國(guó)家糖工程技術(shù)研究中心,山東 青島 266237; 4.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)巴瑟斯未來農(nóng)業(yè)科技學(xué)院,山東 青島 266109)

    啤酒酵母(Saccharomycespastorianus)是一種由釀酒酵母(S.cerevisiae)和真貝酵母(S.eubayanus)雜交獲得的重要工業(yè)生產(chǎn)菌株[1],2022年我國(guó)啤酒生產(chǎn)的副產(chǎn)品酵母粉的總產(chǎn)量約5.35萬噸。啤酒酵母可用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和酵母抽提物等活性物質(zhì),已廣泛地應(yīng)用于飼料、健康食品和調(diào)味料中[2-5]。啤酒酵母蛋白質(zhì)含量豐富,是一種便宜、豐富的蛋白質(zhì)資源[6]。目前研究報(bào)道表明,酵母蛋白酶解物中發(fā)現(xiàn)了抗氧化肽、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制肽、抗糖尿病肽、抗菌肽、免疫調(diào)節(jié)肽等,且廣泛地應(yīng)用于健康食品和化妝品中[7,8]。

    目前,生產(chǎn)酵母蛋白肽主要使用酶解法和發(fā)酵法降解酵母蛋白,酶解法主要采用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶等高效蛋白酶酶解制備啤酒酵母蛋白肽,酶解工藝以水解度、多肽的相對(duì)分子質(zhì)量、多肽含量等指標(biāo)來優(yōu)化[9-11]。比較發(fā)現(xiàn),雖然復(fù)合酶解可以獲得較高的水解度和肽得率,但是深度酶解會(huì)導(dǎo)致很多活性肽被水解,不是制備活性肽的最佳方式[7]。蛋白酶解產(chǎn)物中多肽種類和結(jié)構(gòu)復(fù)雜,酶的種類和酶解條件對(duì)蛋白肽的肽指紋譜圖和活性肽的影響還缺少系統(tǒng)的研究。對(duì)于啤酒酵母而言,已有研究對(duì)其特有蛋白質(zhì)、獨(dú)特功能以及不同條件下的蛋白質(zhì)變化等進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析,而對(duì)于肽序列及其活性方面的肽組學(xué)研究較少。因此酶解工藝與產(chǎn)物組成之間的關(guān)系仍然需要進(jìn)一步系統(tǒng)的研究,對(duì)揭示蛋白肽產(chǎn)品的構(gòu)效關(guān)系具有重要作用。

    肽組學(xué)是蛋白質(zhì)組學(xué)的一個(gè)分支,是對(duì)生物樣品中的肽進(jìn)行全面定性和定量描述的技術(shù)?;谫|(zhì)譜平臺(tái)的肽組學(xué)分析技術(shù)有著一定的分析優(yōu)勢(shì):可以獲得反映生物樣品特質(zhì)的足夠的分子信息且可以進(jìn)行數(shù)據(jù)采集后回溯分析;質(zhì)譜方法具有檢測(cè)準(zhǔn)確性高、在線分離能力強(qiáng)、靈敏度高[12-15]以及多目標(biāo)和高通量分析的優(yōu)勢(shì);多肽的序列結(jié)構(gòu)對(duì)于某些加工過程(如加熱、剪切等)具有更好的分析穩(wěn)定性。因此,基于質(zhì)譜平臺(tái)的肽組學(xué)分析技術(shù)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物中多肽指紋譜圖、鮮味肽和活性肽的分析鑒定[15-17]。但是質(zhì)譜分析的難點(diǎn)在于需要計(jì)算和鑒定生物樣品中幾千或幾萬個(gè)長(zhǎng)短肽的序列和含量,工作量非常巨大。

    多肽的鑒定最常見的方法是質(zhì)譜法,其通過對(duì)多肽離子質(zhì)荷比(m/z)的分析,測(cè)定其相對(duì)分子質(zhì)量和分子結(jié)構(gòu),依賴現(xiàn)有可用的數(shù)據(jù)庫(kù)匹配實(shí)驗(yàn)中的質(zhì)譜數(shù)據(jù),實(shí)現(xiàn)對(duì)多肽的定性分析。并且通過研發(fā)一系列聯(lián)用設(shè)備、開發(fā)多項(xiàng)新化學(xué)技術(shù)和優(yōu)化儀器參數(shù)等方法,形成更穩(wěn)定的“y”或“b”離子來更好地實(shí)現(xiàn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的匹配。但該法的一個(gè)顯著缺點(diǎn)是不能用于鑒定來自未知基因組的蛋白質(zhì)。而基于人工智能算法的PEAKS Online云計(jì)算平臺(tái),解決了批量質(zhì)譜數(shù)據(jù)集高通量解析的難題[18,19]。PEAKS Online是一種基于bottom up技術(shù)路線的蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析軟件,采用蛋白質(zhì)從頭測(cè)序de novo算法,不依賴于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù),計(jì)算所有可能的氨基酸組合中的最佳可能序列,用于在不使用數(shù)據(jù)庫(kù)的情況下提取氨基酸序列信息,進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化,對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定及定量分析。研究發(fā)現(xiàn),與目前國(guó)際上其他算法平臺(tái)相比較,PEAKS Online平臺(tái)可以多解析出5%~30%的肽段序列,把對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)依賴型采集(data dependent acquisition,DDA)和數(shù)據(jù)非依賴型采集(data independent acquisition,DIA)數(shù)據(jù)的解析和挖掘能力提升到了一個(gè)全新的高度。

    本研究采用超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜(ultra-high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry,UHPLC-HRMS),結(jié)合PEAKS Online云計(jì)算平臺(tái)和BIOPEP、Peptide Ranker在線數(shù)據(jù)庫(kù),分析比較了酵母蛋白的中性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解液的肽指紋譜圖和活性肽的差異,揭示了不同蛋白酶對(duì)酵母蛋白肽產(chǎn)品組成的影響。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 儀器、試劑與材料

    Ultimate 3000 UHPLC system色譜儀和Q-Exactive四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo公司); ZipTip C18微量層析柱(ZTC18S008)、超濾管(UFC501008)、Milli-Q超純水制備系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司); SIGMA 1-14低溫冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司); PEAKS Online軟件(版本1.7,加拿大Bioinformatics Solutions Inc公司);Peptide Ranker在線數(shù)據(jù)庫(kù)(distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker),用于預(yù)測(cè)多肽的生物活性;數(shù)據(jù)庫(kù)BIOPEP(https://biochemia.uwm.edu.pl/biopep/start_biopep.php),用于預(yù)測(cè)多肽的生物功能活性。

    中性蛋白酶(比活力5×104U/g)、木瓜蛋白酶(比活力80×104U/g)均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;質(zhì)譜級(jí)甲酸購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司;質(zhì)譜級(jí)乙腈、質(zhì)譜級(jí)甲醇均購(gòu)自德國(guó)Merck公司。

    啤酒酵母粉由青島啤酒有限公司提供。

    1.2 樣品前處理

    啤酒酵母粉以料液比1∶4(g∶mL)加入蒸餾水清洗酵母,3 000 r/min離心10 min,收集酵母沉淀,重復(fù)洗滌5次。酵母沉淀以料液比1∶4(g∶mL)加入蒸餾水混勻,制成酵母懸浮液。用高壓均質(zhì)機(jī)在90 MPa下破壁處理10 min,破壁后的酵母懸浮液分別在中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的最佳條件下進(jìn)行酶解(中性蛋白酶:添加量2 000 U/g,pH 7.0,溫度50 ℃,時(shí)間30 h;木瓜蛋白酶:添加量9 600 U/g,pH 6.0,溫度50 ℃,時(shí)間45 h)。酶解液在100 ℃加熱15 min滅酶活后,5 000 r/min離心10 min,收集上清液,用10 kDa超濾膜過濾,收集小于10 kDa的濾液為啤酒酵母蛋白酶解液[20-22]。

    酵母蛋白酶解液用ZipTip C18微量層析柱脫鹽,收集乙腈-甲酸(1∶1,v/v)洗脫液,真空干燥。用50%(v/v)乙腈水溶液溶解成1 mg/mL,用0.22 μm超濾膜過濾后,進(jìn)行UHPLC-HRMS分析。

    1.3 UHPLC-HRMS條件

    色譜條件 色譜柱:C18(150 mm×1.0 mm,1.7 μm);柱溫:40 ℃;流速:0.15 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL;進(jìn)樣時(shí)間:50 min;流動(dòng)相:含0.1%甲酸的乙腈(A),0.1%甲酸水溶液(B);流動(dòng)相梯度:0~2 min,5%A; 2~27 min,5%A~10%A; 27~37 min,10%A~25%A; 37~39 min,25%A~80%A; 39~42 min,80%A; 42~43 min,80%A~5%A; 43~50 min,5%A。

    質(zhì)譜條件 電噴霧正離子(ESI+)模式;噴霧電壓為3.4 kV;在數(shù)據(jù)依賴型采集模式下,m/z掃描范圍:200~1 500;其他參數(shù)設(shè)置如下:(1)一級(jí)質(zhì)譜:分辨率70 000;掃描阱容量為1×106。(2)二級(jí)質(zhì)譜:分辨率17 500;掃描阱容量為1×105;每個(gè)采集循環(huán)中監(jiān)測(cè)的最強(qiáng)離子數(shù)目為20;碰撞能量分別為20、35、45 eV;鞘氣(氮?dú)?流速為40 Arb;輔助氣體流速為10 Arb;毛細(xì)管溫度為320 ℃;輔助氣體加熱溫度為300 ℃;信號(hào)強(qiáng)度閾值為1.6×105。

    1.4 多肽質(zhì)譜數(shù)據(jù)的分析

    使用PEAKS Online軟件分析不同酶解產(chǎn)物中所有多肽的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜,根據(jù)多肽的二級(jí)質(zhì)譜譜圖,采用de novo從頭測(cè)序算法計(jì)算出所有多肽的氨基酸序列。具體搜索設(shè)置如下。

    模式選擇:PEAKS DB;參數(shù)設(shè)置:前體質(zhì)量誤差(precursor mass error tolerance)15×10-6(15 ppm);片段質(zhì)量誤差(fragment mass error tolerance)0.05 Da;酶(enzyme):無;漏切位點(diǎn)(missed cleavage)3;目標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)(target database)為Saccharomycespastorianus.fasta;置信度(ALC)大于50%;錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)小于1%。

    根據(jù)每條肽的提取離子流圖計(jì)算其離子強(qiáng)度,歸一化計(jì)算獲得其相對(duì)離子強(qiáng)度。

    1.5 多肽生物活性的預(yù)測(cè)和篩選

    將啤酒酵母蛋白酶解物中經(jīng)PEAKS Online軟件解析出的所有多肽序列,使用在線數(shù)據(jù)庫(kù)Peptide Ranker預(yù)測(cè)多肽的生物活性。網(wǎng)站為每個(gè)個(gè)體肽序列提供了從0到1的生物活性概率,越接近1的肽,其具有生物活性的概率越高,評(píng)分大于0.50的多肽被認(rèn)為具有較高的生物活性[23]。使用數(shù)據(jù)庫(kù)BIOPEP對(duì)多肽的功能活性進(jìn)行分析[24],該數(shù)據(jù)庫(kù)中的肽均為已驗(yàn)證報(bào)道的生物活性肽,且隨著實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不斷補(bǔ)充。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 啤酒酵母蛋白酶解物多肽指紋圖譜的分析比較

    采用應(yīng)用廣泛且成本低的中性蛋白酶和木瓜蛋白酶對(duì)啤酒酵母蛋白進(jìn)行酶解,因酶解因素之間存在復(fù)雜的交互作用,酶解產(chǎn)物因酶解方法及酶解條件的不同存在很大差異,本文目的在于探究不同酶體系下的酶解產(chǎn)物肽組學(xué)差異,因此經(jīng)過單因素優(yōu)化,獲得最佳酶解條件(見1.2節(jié)),并以此制備酶解產(chǎn)物。采用UHPLC-HRMS對(duì)酶解產(chǎn)物中的多肽組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,圖1為兩種酶解產(chǎn)物中多肽的總離子流圖。

    圖1 UHPLC-HRMS分析不同啤酒酵母蛋白酶解產(chǎn)物中多肽的總離子流圖

    PEAKS Online分析肽序列所采用的方法可以概括為4個(gè)步驟:(1)預(yù)處理;(2)候選計(jì)算;(3)精確評(píng)分;(4)全局和位置置信度評(píng)分。PEAKS Online基于特征譜峰檢測(cè)算法來有效地計(jì)算最佳肽序列,其片段離子可以很好地解釋MS/MS譜中的峰,分析結(jié)果可給出具有整個(gè)序列的置信度評(píng)分的氨基酸序列,以及序列中各個(gè)位置氨基酸的評(píng)分。與其他分析軟件相比,PEAKS基于特征譜峰檢測(cè)算法,測(cè)序快速而準(zhǔn)確,可深度挖掘質(zhì)譜數(shù)據(jù);不僅能計(jì)算出更多最優(yōu)的序列和氨基酸,而且還能輸出位置置信度得分,從而可靠地確定哪些序列或氨基酸可能性最大[25]。如圖2所示,采用PEAKS解析序列為FLSL的四肽,根據(jù)特征譜峰所反映的相對(duì)分子質(zhì)量,找到對(duì)應(yīng)的b、y離子以及其他對(duì)應(yīng)離子,y1(m/z=132.10)、y2(m/z=219.13)、y3(m/z=332.21)、b2(m/z=261.16)、b3(m/z=348.18)、y2-H2O、b2-NH3等,推算出該譜圖所對(duì)應(yīng)肽段序列為FLSL,且結(jié)果中給出序列FLSL評(píng)分為84.7,氨基酸評(píng)分分別為89、89、92、68。

    圖2 PEAKS Online解析酶解產(chǎn)物中多肽組成示例圖

    利用多肽的二級(jí)質(zhì)譜和PEAKS Online 1.7軟件,從中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶解產(chǎn)物中分別解析出聚合度2~16的多肽7 221條和7 062條。表1的多肽組成比較發(fā)現(xiàn),酶解產(chǎn)物中,四肽、五肽和六肽的數(shù)量占比較高,其中五肽數(shù)量為最多。木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物中三肽和四肽的相對(duì)離子強(qiáng)度顯著高于中性蛋白酶酶解產(chǎn)物,分別是28.41%和26.90%;而二肽(相對(duì)離子強(qiáng)度為22.62%)、六肽及以上多肽的相對(duì)離子強(qiáng)度顯著低于中性蛋白酶酶解產(chǎn)物,說明木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物中多肽的相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)更低。

    表1 不同啤酒酵母蛋白酶解產(chǎn)物中多肽的組成

    由表1可知,兩種酶解產(chǎn)物中共有肽為980條,其中97.35%為2~5肽。而中性蛋白酶酶解產(chǎn)物中特有肽6 241條,木瓜蛋白酶的酶解產(chǎn)物中特有肽為6 082條,說明兩種不同蛋白酶降解產(chǎn)物的肽指紋譜圖有很大的差異。

    此外,相較于傳統(tǒng)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù),PEAKS Online采用de novo測(cè)序,分析得到更多五肽及其以下寡肽,使其樣品中肽段數(shù)據(jù)更加全面,更好地實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中生物活性肽的預(yù)測(cè)及篩選。

    2.2 使用Peptide Ranker對(duì)啤酒酵母蛋白酶解物中生物活性肽的預(yù)測(cè)

    Peptide Ranker是一個(gè)較為系統(tǒng)的肽數(shù)據(jù)庫(kù),可以評(píng)價(jià)肽的生物活性概率。Peptide Ranker算法是基于支持向量機(jī)(support vector machine,SVM)的機(jī)器學(xué)習(xí)算法。該算法通過訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中的肽序列和對(duì)應(yīng)的生物活性數(shù)據(jù),建立一個(gè)分類模型。該模型可以根據(jù)輸入的肽序列,預(yù)測(cè)其生物活性,并給出一個(gè)相應(yīng)的評(píng)分。使用Peptide Ranker數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)啤酒酵母蛋白酶解產(chǎn)物中所有多肽進(jìn)行了活性功能預(yù)測(cè),活性評(píng)分高于0.50則被標(biāo)記為具有生物活性。

    木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物中評(píng)分大于0.50的活性肽有3 095條,占總肽數(shù)目的43.83%,顯著高于中性蛋白酶酶解產(chǎn)物中活性肽數(shù)目(3 013條,占41.73%);其中兩種酶解產(chǎn)物的980條共有肽中,評(píng)分大于0.50的活性肽有521條,占比53.16%,說明啤酒酵母蛋白酶解產(chǎn)物中有大量的活性肽。表2列舉了不同酶解產(chǎn)物中評(píng)分較高的10條活性肽的氨基酸序列和質(zhì)譜解析結(jié)果。其中五肽FGFWF占多肽總離子強(qiáng)度的0.109 1%,其他活性肽的相對(duì)離子強(qiáng)度都低于0.1%,說明單條活性肽在酶解物中的相對(duì)離子強(qiáng)度都非常低。

    表2 啤酒酵母蛋白酶解產(chǎn)物中評(píng)分最高的10條活性肽的質(zhì)譜解析結(jié)果

    2.3 使用BIOPEP對(duì)啤酒酵母蛋白酶解物中生物活性肽的預(yù)測(cè)

    使用BIOPEP對(duì)酶解產(chǎn)物中鑒定到的所有肽進(jìn)行活性驗(yàn)證,經(jīng)過對(duì)比分析得到不同酶解物中所含有的生物活性肽,來比較不同酶解產(chǎn)物中活性肽的區(qū)別。將PEAKS Online解析得到的啤酒酵母蛋白酶解產(chǎn)物的所有多肽序列輸入BIOPEP數(shù)據(jù)庫(kù),搜索已報(bào)道的活性肽。附表1為中性蛋白酶和木瓜蛋白酶中篩選出的所有活性肽的氨基酸序列。圖3為活性肽的數(shù)量和相對(duì)離子強(qiáng)度的比較。

    圖3 啤酒酵母蛋白酶解產(chǎn)物中活性肽的數(shù)量和相對(duì)離子強(qiáng)度的比較

    中性蛋白酶的酶解產(chǎn)物的7 221條多肽中,共發(fā)現(xiàn)295條活性肽段(占7 221條多肽總離子強(qiáng)度的58.88%),其中有107條為ACE抑制肽,占總肽離子強(qiáng)度的20.30%;90條二肽基肽酶Ⅳ抑制肽,占總肽離子強(qiáng)度的20.12%;40條抗氧化肽,占總肽離子強(qiáng)度的2.96%,17條二肽基肽酶Ⅲ抑制肽,占總肽離子強(qiáng)度的2.36%;8條腎素抑制肽,相對(duì)離子強(qiáng)度為2.11%。從木瓜蛋白酶的7 062條多肽中,共發(fā)現(xiàn)357條活性肽段,占7 062條多肽的總離子強(qiáng)度的48.41%,活性肽數(shù)量高于中性蛋白酶,但是活性肽的總含量低于中性蛋白酶產(chǎn)物。其中有134條多肽為ACE抑制肽,占總肽離子強(qiáng)度的15.89%。其次為101條二肽基肽酶Ⅳ抑制肽,占總肽離子強(qiáng)度的17.73%,48條抗氧化肽占總肽離子強(qiáng)度的3.02%,20條二肽基肽酶Ⅲ抑制肽占總肽離子強(qiáng)度的2.66%,9條腎素抑制肽占總肽離子強(qiáng)度的1.67%。比較發(fā)現(xiàn),活性肽在木瓜蛋白酶的酶解產(chǎn)物中含量低于中性蛋白酶產(chǎn)物。酶解產(chǎn)物中少數(shù)活性肽有區(qū)別:中性蛋白酶酶解產(chǎn)物中有少量的抗病毒肽、抗糖尿病肽、α-淀粉酶抑制肽,而木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物中有少量的阿片類肽、阿片類激動(dòng)肽和抗癌肽。

    3 結(jié)論

    本文以啤酒酵母粉為原料,利用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解制備酵母蛋白肽,基于UHPLC-HRMS分析和PEAKS Online 1.7計(jì)算,從中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶解產(chǎn)物解析出聚合度2~16的多肽有7 221條和7 062條,其中共有肽980條,中性蛋白酶特有肽6 241條,木瓜蛋白酶特有肽6 082條,說明兩種酵母蛋白酶解產(chǎn)物的肽指紋譜圖有很大的差異。使用Peptide Ranker預(yù)測(cè)兩種酶解液中的活性肽,中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶解產(chǎn)物中分別有3 013條和3 095條肽為潛在的活性肽。搜索BIOPEP數(shù)據(jù)庫(kù),發(fā)現(xiàn)中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶解產(chǎn)物中分別有295條和357條活性肽段,占總肽離子強(qiáng)度的58.88%和48.41%,其中ACE抑制肽和二肽基肽酶Ⅳ抑制肽為主要活性肽。比較發(fā)現(xiàn),木瓜蛋白酶產(chǎn)物中活性肽數(shù)量高于中性蛋白酶,但是活性肽的相對(duì)離子強(qiáng)度卻低于中性蛋白酶產(chǎn)物。不同蛋白酶生產(chǎn)的酵母蛋白肽產(chǎn)品的肽指紋譜圖和活性預(yù)測(cè)的比較,為篩選高活性酵母蛋白肽產(chǎn)品提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),有利于進(jìn)一步挖掘酵母蛋白肽中的活性肽。

    猜你喜歡
    啤酒酵母蛋白酶解木瓜
    同叫“木瓜”,功效不同
    正交法探究幾種因素對(duì)啤酒酵母發(fā)酵PYF現(xiàn)象的影響
    木瓜老奶奶的云
    木瓜老奶奶的云
    現(xiàn)代釀酒酵母品系源自歐洲葡萄酒和亞洲黃酒品系混合體
    添加普魯蘭酶對(duì)啤酒酵母生長(zhǎng)的影響
    生物化工(2018年1期)2018-03-01 11:58:14
    植物幫之木瓜
    小麥蛋白酶解物中抗氧化肽的純化與鑒定
    干拌料方式添加液態(tài)酵益的菌群活性變化
    茶葉籽蛋白酶解物的制備及其抗氧化活性
    亚洲综合色网址| 久久鲁丝午夜福利片| 欧美在线黄色| 一二三四中文在线观看免费高清| 欧美日韩精品成人综合77777| 极品少妇高潮喷水抽搐| 久久精品夜色国产| 青青草视频在线视频观看| av福利片在线| av有码第一页| 看免费成人av毛片| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲精品国产av蜜桃| 久热久热在线精品观看| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 哪个播放器可以免费观看大片| 久久亚洲国产成人精品v| 国产精品久久久av美女十八| av在线app专区| 久久精品国产a三级三级三级| 久久狼人影院| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 亚洲av电影在线进入| 交换朋友夫妻互换小说| 日本色播在线视频| xxx大片免费视频| 一级毛片电影观看| 亚洲 欧美一区二区三区| 黄色毛片三级朝国网站| 9191精品国产免费久久| 一区在线观看完整版| 欧美精品av麻豆av| 大片电影免费在线观看免费| 欧美精品国产亚洲| 亚洲精品视频女| 热re99久久精品国产66热6| 麻豆av在线久日| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 日韩人妻精品一区2区三区| 亚洲天堂av无毛| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产精品一区二区在线不卡| 精品久久久精品久久久| 黄色怎么调成土黄色| 午夜福利视频精品| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | av国产精品久久久久影院| 免费观看性生交大片5| 99九九在线精品视频| 9热在线视频观看99| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产在线一区二区三区精| 日韩电影二区| 女性生殖器流出的白浆| 免费观看a级毛片全部| 国产精品人妻久久久影院| 美女国产视频在线观看| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲四区av| 一级黄片播放器| 韩国av在线不卡| 韩国精品一区二区三区| 日韩在线高清观看一区二区三区| 超碰97精品在线观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 下体分泌物呈黄色| 777米奇影视久久| 国产亚洲最大av| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 欧美 日韩 精品 国产| 曰老女人黄片| 日本欧美国产在线视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 久久久久人妻精品一区果冻| av国产久精品久网站免费入址| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产深夜福利视频在线观看| 亚洲在久久综合| 香蕉丝袜av| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 大码成人一级视频| 久久精品国产综合久久久| 少妇 在线观看| 男女午夜视频在线观看| 永久网站在线| 啦啦啦在线观看免费高清www| 99久久精品国产国产毛片| 午夜福利视频在线观看免费| 精品人妻偷拍中文字幕| 校园人妻丝袜中文字幕| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲精品aⅴ在线观看| 亚洲精品国产一区二区精华液| a级毛片黄视频| 国产淫语在线视频| 满18在线观看网站| 成人毛片a级毛片在线播放| 免费观看性生交大片5| 国产精品偷伦视频观看了| 精品一品国产午夜福利视频| 精品人妻一区二区三区麻豆| 亚洲伊人色综图| 99久久人妻综合| 国产淫语在线视频| 天天操日日干夜夜撸| 国产国语露脸激情在线看| 欧美精品av麻豆av| 国产日韩欧美视频二区| tube8黄色片| 黄色配什么色好看| 国产黄频视频在线观看| 伦理电影免费视频| 狂野欧美激情性bbbbbb| 婷婷成人精品国产| 免费在线观看完整版高清| 满18在线观看网站| 一边亲一边摸免费视频| 一本大道久久a久久精品| 成人午夜精彩视频在线观看| 久久久久国产网址| 99香蕉大伊视频| 国产精品三级大全| 成年人午夜在线观看视频| 九九爱精品视频在线观看| 久久av网站| 免费观看av网站的网址| 亚洲av男天堂| 国产精品女同一区二区软件| 日韩av免费高清视频| 亚洲一区二区三区欧美精品| 欧美xxⅹ黑人| 久久久a久久爽久久v久久| 老女人水多毛片| 丁香六月天网| 久久女婷五月综合色啪小说| 亚洲成国产人片在线观看| 嫩草影院入口| 九九爱精品视频在线观看| 不卡视频在线观看欧美| 免费观看a级毛片全部| 伦理电影免费视频| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 国产精品国产三级专区第一集| 亚洲av.av天堂| 综合色丁香网| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲图色成人| 人体艺术视频欧美日本| 日本vs欧美在线观看视频| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 这个男人来自地球电影免费观看 | 国产欧美日韩一区二区三区在线| 香蕉精品网在线| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 如何舔出高潮| 赤兔流量卡办理| 天堂中文最新版在线下载| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 中文字幕av电影在线播放| 午夜激情av网站| 精品久久久精品久久久| 色视频在线一区二区三区| 国产精品欧美亚洲77777| 国产男女内射视频| 久久ye,这里只有精品| 两个人看的免费小视频| 天堂8中文在线网| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 欧美激情高清一区二区三区 | 一本大道久久a久久精品| 午夜福利一区二区在线看| 黄片无遮挡物在线观看| 咕卡用的链子| 一区二区日韩欧美中文字幕| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 赤兔流量卡办理| 精品国产乱码久久久久久小说| 99久久精品国产国产毛片| kizo精华| 女人精品久久久久毛片| 成人二区视频| 永久免费av网站大全| 久久热在线av| 亚洲国产看品久久| 国产极品粉嫩免费观看在线| 亚洲欧美精品综合一区二区三区 | 亚洲av国产av综合av卡| 中国国产av一级| 青春草国产在线视频| 国产午夜精品一二区理论片| 99香蕉大伊视频| 国产精品亚洲av一区麻豆 | a级毛片在线看网站| av在线观看视频网站免费| 成年美女黄网站色视频大全免费| 九草在线视频观看| 伦精品一区二区三区| 久久鲁丝午夜福利片| 国产有黄有色有爽视频| 国产免费现黄频在线看| 精品福利永久在线观看| 亚洲综合色网址| 日本欧美国产在线视频| 午夜福利一区二区在线看| 熟女电影av网| 色吧在线观看| 国产激情久久老熟女| 一本大道久久a久久精品| 老女人水多毛片| 精品国产乱码久久久久久男人| 又大又黄又爽视频免费| 9191精品国产免费久久| 欧美在线黄色| 亚洲久久久国产精品| 久久97久久精品| 中文天堂在线官网| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 黑人猛操日本美女一级片| 丝袜脚勾引网站| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 久久久欧美国产精品| 日韩电影二区| 久久久久国产网址| 99香蕉大伊视频| 一区二区av电影网| 一级爰片在线观看| 久久av网站| 一级,二级,三级黄色视频| 国产精品人妻久久久影院| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产成人精品久久久久久| 中文字幕人妻丝袜制服| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲第一区二区三区不卡| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 国产男人的电影天堂91| 9191精品国产免费久久| 丰满饥渴人妻一区二区三| 高清视频免费观看一区二区| 看非洲黑人一级黄片| 国产视频首页在线观看| 国产免费视频播放在线视频| 在线观看www视频免费| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 国产av精品麻豆| 观看av在线不卡| 亚洲,一卡二卡三卡| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 亚洲久久久国产精品| 永久网站在线| 成人毛片a级毛片在线播放| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 日韩伦理黄色片| 午夜久久久在线观看| 国产成人免费无遮挡视频| 老熟女久久久| 成人毛片60女人毛片免费| 欧美中文综合在线视频| 最近的中文字幕免费完整| 十八禁高潮呻吟视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国产一区二区在线观看av| av国产久精品久网站免费入址| 久久久a久久爽久久v久久| 黄色一级大片看看| 视频区图区小说| 男女边吃奶边做爰视频| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 哪个播放器可以免费观看大片| 日韩 亚洲 欧美在线| 久久久久久久久久人人人人人人| 国精品久久久久久国模美| 国产不卡av网站在线观看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 久久久久久人人人人人| 亚洲天堂av无毛| 国产 精品1| 欧美+日韩+精品| 精品国产乱码久久久久久小说| 咕卡用的链子| 日韩欧美一区视频在线观看| 成人国产麻豆网| 成年人午夜在线观看视频| 久久久欧美国产精品| 超色免费av| www日本在线高清视频| 性高湖久久久久久久久免费观看| 久久久精品94久久精品| 亚洲国产欧美网| 制服人妻中文乱码| 人人澡人人妻人| 国产在视频线精品| 九九爱精品视频在线观看| av视频免费观看在线观看| 90打野战视频偷拍视频| 日本wwww免费看| 日本欧美国产在线视频| 欧美+日韩+精品| 最新中文字幕久久久久| 欧美人与性动交α欧美软件| 18+在线观看网站| 99香蕉大伊视频| 午夜福利影视在线免费观看| 少妇被粗大的猛进出69影院| 中文字幕人妻熟女乱码| av国产久精品久网站免费入址| 天堂俺去俺来也www色官网| 亚洲中文av在线| 最近最新中文字幕免费大全7| 亚洲国产最新在线播放| 新久久久久国产一级毛片| 九草在线视频观看| 黄片小视频在线播放| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲av电影在线进入| 亚洲一码二码三码区别大吗| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 午夜免费鲁丝| 国产精品蜜桃在线观看| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 少妇人妻久久综合中文| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| xxxhd国产人妻xxx| 热re99久久国产66热| av女优亚洲男人天堂| 久久人人97超碰香蕉20202| 亚洲,欧美,日韩| 一级片免费观看大全| 一级片'在线观看视频| 超碰97精品在线观看| 国产男女超爽视频在线观看| 国产精品偷伦视频观看了| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 成年女人在线观看亚洲视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 大话2 男鬼变身卡| 十分钟在线观看高清视频www| 国产免费视频播放在线视频| 婷婷成人精品国产| 精品视频人人做人人爽| 成人毛片a级毛片在线播放| av在线播放精品| 久久久国产欧美日韩av| 欧美激情高清一区二区三区 | 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 少妇被粗大猛烈的视频| av国产精品久久久久影院| 自线自在国产av| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲成国产人片在线观看| 亚洲精品国产av成人精品| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲久久久国产精品| 午夜日本视频在线| 日本wwww免费看| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲国产色片| 精品国产一区二区三区四区第35| 哪个播放器可以免费观看大片| 久久青草综合色| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产 一区精品| 99久国产av精品国产电影| 亚洲国产精品999| 精品一区二区免费观看| 少妇 在线观看| 午夜福利在线免费观看网站| 精品第一国产精品| 新久久久久国产一级毛片| 色网站视频免费| 国产97色在线日韩免费| 国产亚洲最大av| 亚洲综合精品二区| 在线观看www视频免费| 18+在线观看网站| 亚洲av.av天堂| 国产精品一二三区在线看| 性高湖久久久久久久久免费观看| 一边亲一边摸免费视频| 97精品久久久久久久久久精品| 久久女婷五月综合色啪小说| 欧美国产精品一级二级三级| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 高清黄色对白视频在线免费看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 欧美av亚洲av综合av国产av | 在线观看www视频免费| 麻豆乱淫一区二区| 国产综合精华液| 老司机影院成人| 亚洲,欧美精品.| 大片电影免费在线观看免费| 激情视频va一区二区三区| 电影成人av| 欧美国产精品va在线观看不卡| videosex国产| 午夜福利影视在线免费观看| 不卡视频在线观看欧美| 午夜福利视频精品| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 中文字幕av电影在线播放| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲 欧美一区二区三区| 欧美人与善性xxx| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 国产成人av激情在线播放| 久久这里有精品视频免费| 多毛熟女@视频| 久久久精品免费免费高清| 亚洲av福利一区| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 夫妻午夜视频| 免费在线观看完整版高清| 天堂8中文在线网| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲av电影在线进入| 性色avwww在线观看| 制服丝袜香蕉在线| 97人妻天天添夜夜摸| 视频在线观看一区二区三区| 老汉色∧v一级毛片| 香蕉国产在线看| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 亚洲精品国产av蜜桃| 日韩制服骚丝袜av| 午夜影院在线不卡| 制服人妻中文乱码| 国产欧美亚洲国产| 精品久久久精品久久久| 亚洲av日韩在线播放| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲一区二区三区欧美精品| 韩国高清视频一区二区三区| 99热国产这里只有精品6| 乱人伦中国视频| 桃花免费在线播放| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 国产97色在线日韩免费| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 久久这里有精品视频免费| 国产一区二区 视频在线| 捣出白浆h1v1| 午夜老司机福利剧场| 永久免费av网站大全| 国产精品免费视频内射| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 极品人妻少妇av视频| 国产日韩欧美在线精品| 亚洲精品国产色婷婷电影| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 天天影视国产精品| 伦理电影免费视频| 成年女人毛片免费观看观看9 | 大片免费播放器 马上看| 国产精品.久久久| 人妻人人澡人人爽人人| 久久久亚洲精品成人影院| 一边摸一边做爽爽视频免费| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 日本爱情动作片www.在线观看| 热99久久久久精品小说推荐| 美女国产视频在线观看| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产黄色免费在线视频| 精品国产国语对白av| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产精品人妻久久久影院| 黄色 视频免费看| 国产熟女欧美一区二区| 看免费av毛片| 人妻 亚洲 视频| 桃花免费在线播放| 国产成人欧美| 欧美日韩成人在线一区二区| 亚洲国产色片| 国产在线免费精品| 91久久精品国产一区二区三区| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 国产福利在线免费观看视频| 99久久综合免费| 日本黄色日本黄色录像| 国产精品三级大全| 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲av欧美aⅴ国产| av卡一久久| 伦精品一区二区三区| 高清av免费在线| 成年女人在线观看亚洲视频| 午夜久久久在线观看| h视频一区二区三区| 在线观看三级黄色| 亚洲少妇的诱惑av| 欧美日韩精品成人综合77777| 国产精品国产三级国产专区5o| 一级片免费观看大全| 国产精品嫩草影院av在线观看| 欧美最新免费一区二区三区| 日本av手机在线免费观看| 宅男免费午夜| 欧美中文综合在线视频| 日本欧美视频一区| 日日撸夜夜添| 午夜精品国产一区二区电影| 亚洲美女黄色视频免费看| av女优亚洲男人天堂| av.在线天堂| 免费日韩欧美在线观看| 精品国产露脸久久av麻豆| 国产免费视频播放在线视频| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 男女国产视频网站| 亚洲第一av免费看| 一级毛片 在线播放| 丝瓜视频免费看黄片| 一区二区av电影网| 中文字幕制服av| 观看av在线不卡| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲人成电影观看| 一二三四在线观看免费中文在| 久久99一区二区三区| 在现免费观看毛片| 在线看a的网站| 一本大道久久a久久精品| 99精国产麻豆久久婷婷| av卡一久久| 90打野战视频偷拍视频| 免费观看性生交大片5| 热99国产精品久久久久久7| 深夜精品福利| 啦啦啦在线免费观看视频4| 18禁国产床啪视频网站| 国产视频首页在线观看| 美女午夜性视频免费| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 一级黄片播放器| 婷婷色麻豆天堂久久| 国产精品久久久久久精品电影小说| 满18在线观看网站| 9191精品国产免费久久| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 午夜免费鲁丝| 精品人妻熟女毛片av久久网站| xxxhd国产人妻xxx| 欧美日本中文国产一区发布| 黄色怎么调成土黄色| 欧美+日韩+精品| 青青草视频在线视频观看| 深夜精品福利| 国产av国产精品国产| 黄色配什么色好看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 宅男免费午夜| 久久99热这里只频精品6学生| 日韩在线高清观看一区二区三区| 中文字幕最新亚洲高清| 尾随美女入室| 观看美女的网站| 亚洲中文av在线| 亚洲国产最新在线播放| 1024视频免费在线观看| 精品亚洲成国产av| 久久久久久久久免费视频了| 免费观看在线日韩| 久久久久久人人人人人| www.精华液| 90打野战视频偷拍视频| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 女人精品久久久久毛片| 久久久久精品人妻al黑| a级毛片黄视频| 日韩精品有码人妻一区| 赤兔流量卡办理| 亚洲精品国产av成人精品| 成人手机av| 成年女人在线观看亚洲视频| 好男人视频免费观看在线| 最新的欧美精品一区二区| 一个人免费看片子| xxxhd国产人妻xxx| 一级,二级,三级黄色视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 最近中文字幕高清免费大全6| 永久免费av网站大全| 乱人伦中国视频| 丰满迷人的少妇在线观看| 99re6热这里在线精品视频| 久久青草综合色| 夫妻性生交免费视频一级片| 欧美国产精品va在线观看不卡| 男女边摸边吃奶| 黄色 视频免费看| 日日撸夜夜添| 日韩视频在线欧美| 在线观看三级黄色| 午夜福利一区二区在线看| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 在线天堂中文资源库| 大片免费播放器 马上看| 欧美xxⅹ黑人| 一级a爱视频在线免费观看| 欧美日韩成人在线一区二区| 中文字幕制服av| 一本色道久久久久久精品综合| 欧美97在线视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 女人精品久久久久毛片| 一区福利在线观看|