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    添加普魯蘭酶對啤酒酵母生長的影響

    2018-03-01 11:58:14汪裕強(qiáng)
    生物化工 2018年1期
    關(guān)鍵詞:啤酒酵母普魯蘭吸光

    汪裕強(qiáng)

    (黔南州食品藥品檢驗(yàn)所,貴州都勻 558000)

    普魯蘭酶能夠?qū)R恍郧虚_α-1,6糖苷鍵并形成直鏈淀粉[1-2],該酶符合聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織要求的食品級酶制[3],但普魯蘭酶在食品加工方面的應(yīng)用甚少。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),普魯蘭酶能夠增加啤酒中的風(fēng)味物質(zhì)和提高發(fā)酵度[4-5],而啤酒酵母與啤酒發(fā)酵密切相關(guān)[6-9]。

    本文通過添加0、60、90、120 U/kg普魯蘭酶,觀察啤酒酵母菌落形態(tài)和生長曲線,研究普魯蘭酶對啤酒酵母的影響,希望為普魯蘭酶作用的開發(fā)和提高啤酒酵母的利用率提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    普魯蘭酶(酶活力為1 000 U/mL,最適pH 4.5~5.5,最適溫度55~60℃)、安琪啤酒干酵母、酵母膏、瓊脂、二棱大麥。

    1.2 儀器與設(shè)備

    超凈工作臺、721分光光度計(jì)、水浴恒溫振蕩器、微生物培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液器、接種環(huán)、高壓滅菌鍋。

    1.3 方法

    1.3.1 制備麥芽汁固體培養(yǎng)基

    大麥經(jīng)制麥、發(fā)芽等過程獲得麥芽,粉碎麥芽,加水于60℃糖化2~3 h,攪拌至糖化完全,糖化液經(jīng)12層紗布過濾后獲得麥芽汁。取1 000mL錐形瓶,加入麥芽汁800mL、瓊脂16 g、酵母膏72 g,用棉花封瓶,置于滅菌鍋滅菌1.05 kg/cm2,20 min;在培養(yǎng)基滅菌后倒平板25mL且未凝固前添加不同濃度的普魯蘭酶,混勻備用。制作麥芽汁斜面培養(yǎng)基:取15mm×150mm試管,加入4mL麥芽汁,用棉花封好試管口,用報(bào)紙包裹好置于滅菌鍋滅菌1.05 kg/cm2,20 min。

    1.3.2 觀察啤酒酵母菌落

    將啤酒酵母活化后,從瓶子中接種到10mL麥芽汁斜面培養(yǎng)基中復(fù)壯最少4支,于25℃培養(yǎng)25 h。按照無菌操作從4支斜面培養(yǎng)基中選出生長良好的進(jìn)行斜面劃線3個(gè),于25℃培養(yǎng)48 h。按照無菌操作挑選健壯、飽滿的4~5個(gè)啤酒酵母分別接種到添加不同濃度普魯蘭酶的麥芽培養(yǎng)基上于25℃培養(yǎng)。分別于4 d后和11 d后,在麥芽汁培養(yǎng)基上觀察啤酒酵母菌落。

    1.3.3 測定啤酒酵母的生長曲線

    麥芽汁液體培養(yǎng)基配制:取1 000mL錐形瓶,加入麥芽汁800mL、酵母膏72 g,用棉花封瓶,置于滅菌鍋滅菌1.05 kg/cm2,20 min。用接種環(huán)從斜面培養(yǎng)基上挑取1環(huán)菌;接種于10mL麥芽汁液體培養(yǎng)基,于25℃恒溫培養(yǎng)48 h,作為種子液。取種子液10mL接種于100mL麥芽汁液體培養(yǎng)基,在28℃恒溫200 r/min振蕩培養(yǎng)20 h,此時(shí)培養(yǎng)液渾濁。將721型分光光度計(jì)波長調(diào)整至560 nm,預(yù)熱30 min。取盛有90mL無菌麥芽汁液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶5個(gè),各加入振蕩培養(yǎng)20 h的酵母培養(yǎng)液10mL,于25℃下恒溫振蕩培養(yǎng),培養(yǎng)6 h后每瓶分別加入0、6、9、12 μL普魯蘭酶。于0、4、8、12、16、20、24、28、32 h和36 h分別用無菌移液管從各瓶吸取培養(yǎng)液2mL,經(jīng)過一系列梯度稀釋后,以未接種的麥芽汁液體培養(yǎng)基校正比色計(jì)的零點(diǎn),在光密度為560 nm條件下測定吸光值(A)記錄于表格中,每個(gè)吸光值測3次(n=3),以時(shí)間(h)為橫坐標(biāo),吸光值(A560)×稀釋倍數(shù)為縱坐標(biāo)繪制成酵母生長曲線[8-10]。

    1.3.4 數(shù)據(jù)分析

    利用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行F檢驗(yàn)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 普魯蘭酶對啤酒酵母菌落的影響

    將啤酒酵母通過無菌操作培養(yǎng)在添加4種不同濃度(0、60、90、120 U/kg)普魯蘭酶的麥芽培養(yǎng)基上,于4 d后觀察啤酒酵母菌落的形態(tài),如圖1A~1D所示;于11 d后觀察啤酒酵母菌落的形態(tài),如圖2A~2D。

    圖1 添加普魯蘭酶4 d后啤酒酵母的菌落形態(tài)

    在添加普魯蘭酶4 d后,啤酒酵母都在麥芽培養(yǎng)基上出現(xiàn)明顯的白色菌落(圖1),此時(shí)經(jīng)4種不同普魯蘭酶濃度處理的啤酒酵母菌落顏色都很暗,菌落呈現(xiàn)的差異不明顯。

    圖2 添加普魯蘭酶11 d后啤酒酵母的菌落形態(tài)

    添加普魯蘭酶11 d后),啤酒酵母在麥芽汁培養(yǎng)基上都形成差異明顯的乳白色菌落。在普魯蘭酶的添加量為0 U/kg的條件下(圖2A),啤酒酵母的菌落小且不飽滿,表明啤酒酵母在未添加普魯蘭酶的條件下,生長緩慢不夠發(fā)達(dá)。在普魯蘭酶的添加量為60 U/kg的條件下(圖2B),啤酒酵母的生長得到促進(jìn),菌落比未添加普魯蘭酶的大、飽滿且有光澤。啤酒酵母在普魯蘭酶的添加量為90 U/kg的條件下(圖2C),較添加60 U/kg普魯蘭酶而言,體積、飽滿程度相差不大。當(dāng)普魯蘭酶的添加量為120 U/kg時(shí)(圖2D),啤酒酵母的生長狀況有明顯的促進(jìn)作用,菌落顏色呈乳白色、有光澤、最飽滿,且生長旺盛的孢子散落在其他未點(diǎn)樣的地方。結(jié)合啤酒酵母在麥芽培養(yǎng)基的生長狀況(圖1和圖2),隨著普魯蘭酶添加量的增多和時(shí)間的推移,啤酒酵母在麥芽汁培養(yǎng)基的生長狀況出現(xiàn)了明顯的變化,對啤酒酵母生長的促進(jìn)作用隨著普魯蘭酶濃度的升高而增加。這系由于在啤酒酵母代謝過程中,普魯蘭酶將麥芽汁中的使α-1,6糖苷鍵脫支,促進(jìn)糖化分解,且普魯蘭酶本身無毒無害,不會對啤酒酵母產(chǎn)生質(zhì)的變化,則啤酒酵母能充分利用培養(yǎng)基中的單糖以補(bǔ)充自身生長所需的碳源,充足的酵母膏為啤酒酵母提供生長所需的氮源,因而啤酒酵母在添加普魯蘭酶的培養(yǎng)基上形成的菌落更大更飽滿。綜上所述,普魯蘭酶對啤酒酵母的生長有良好的促進(jìn)作用。

    2.2 普魯蘭酶對啤酒酵母生長的影響

    將啤酒酵母培養(yǎng)在添加4種不同普魯蘭酶濃度的麥芽汁液體培養(yǎng)基中,于0、4、8、12、16、20、24、28、32 h和36 h分別用無菌移液管從各瓶吸取培養(yǎng)液2mL,經(jīng)過一系列梯度稀釋后,以未接種的麥芽汁液體培養(yǎng)基校正比色計(jì)的零點(diǎn),利用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),在光密度為560 nm的條件下測定吸光值,見表1,每個(gè)吸光值測3次(n=3),并進(jìn)行方差分析(表2)。最后以時(shí)間(h)為橫坐標(biāo),吸光值(A560)×稀釋倍數(shù)為縱坐標(biāo)制作出四條酵母生長曲線,如圖3所示。

    根據(jù)方差分析表(表2)可知,時(shí)間處理的F值為28.592 6,普魯蘭酶濃度處理的F值為2 171.846 6,則普魯蘭酶的影響效果更為顯著,且P值均小于0.001,因此本研究的結(jié)果有極顯著差異。本研究的誤差項(xiàng)很小,說明本研究的精確度高。

    圖3 不同普魯蘭酶濃度下啤酒酵母的生長曲線

    表1 添加四種濃度普魯蘭酶后啤酒酵母在不同時(shí)間培養(yǎng)液的吸光度(±S)

    表1 添加四種濃度普魯蘭酶后啤酒酵母在不同時(shí)間培養(yǎng)液的吸光度(±S)

    注:1.吸光度為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;2.同列數(shù)字旁星號表示有顯著差異(*表示P<0.05,**表示P<0.01)。

    時(shí)間/h 0 U/kg 60 U/kg 90 U/kg 120 U/kg 稀釋倍數(shù)0 0.038±0.002** 0.038±0.002** 0.039±0.003** 0.039±0.003** 14 0.069±0.005** 0.072±0.006** 0.073±0.005** 0.076±0.007** 18 0.177±0.011** 0.193±0.013** 0.199±0.014** 0.230±0.016** 1 12 1.189±0.037** 1.242±0.044** 1.254±0.050** 1.277±0.054** 5 16 3.101±0.111** 3.332±0.126** 3.512±0.123** 3.700±0.134** 10 20 4.105±0.160** 4.425±0.183** 4.618±0.177** 4.825±0.189** 15 24 7.420±0.211** 7.742±0.236** 7.910±0.242** 8.218±0.257* 20 28 8.510±0.295* 8.850±0.308* 9.112±0.312* 9.324±0.318* 30 32 8.815±0.283** 9.170±0.309* 9.398±0.312* 9.582±0.334* 30 36 3.876±0.165** 4.127±0.161** 4.295±0.169** 4.581±0.177** 20 40 2.586±0.138** 2.858±0.163** 2.994±0.151** 3.210±0.174** 15 44 2.546±0.160** 2.799±0.167** 2.920±0.142** 3.101±0.168** 10 48 2.579±0.173** 2.829±0.177** 2.952±0.182** 3.123±0.198** 10

    表2 方差分析表

    本研究采用比濁計(jì)數(shù)法,經(jīng)一系列梯度稀釋后,根據(jù)測定的吸光值(表1)繪制成4條生長曲線(圖3),啤酒酵母在不同普魯蘭酶濃度處理下均出現(xiàn)了4個(gè)階段:啤酒酵母的生長在0~8 h為遲緩期,8~24 h為指數(shù)期,24~36 h為穩(wěn)定期,36 h后進(jìn)入衰亡期,這也是4條生長曲線的共性,在30 h時(shí)生長最為旺盛,菌株活力很強(qiáng),吸光值×稀釋倍數(shù)達(dá)到9以上,十分適合菌種采樣,生長曲線反映了啤酒酵母在培養(yǎng)繁殖過程中的生長規(guī)律,則普魯蘭酶不會對酵母細(xì)胞的生長周期產(chǎn)生影響。但從縱向觀察四條生長曲線,當(dāng)加入不同濃度的普魯蘭酶后,吸光值A(chǔ)(代表樣品菌液濃度)隨著普魯蘭酶濃度的升高而增加,根據(jù)朗伯比爾定律(A=Kbc),在摩爾吸光吸收系數(shù)K與吸收層厚度b不變的條件下,吸光度A只與物質(zhì)的濃度c有關(guān),因此經(jīng)4種濃度處理后的啤酒酵母在液體培養(yǎng)基中的吸光值(A560)與細(xì)菌懸濁液成正比關(guān)系,通過分光光度計(jì)測量后就掌握了酵母細(xì)胞的濃度變化。當(dāng)添加普魯蘭酶濃度為60 U/kg時(shí),R2(決定系數(shù))=0.183 3。當(dāng)添加普魯蘭酶濃度為60 U/kg時(shí),酵母細(xì)胞濃度從指數(shù)期開始比添加0 U/kg普魯蘭酶時(shí)高,增幅較大,R2=0.196 9。當(dāng)添加普魯蘭酶濃度為90 U/kg時(shí),酵母細(xì)胞濃度從指數(shù)期開始比添加60 U/kg普魯蘭酶時(shí)高,增幅較小,兩條曲線之間的間隙也較小,R2=0.201 6。當(dāng)添加普魯蘭酶濃度為120 U/kg時(shí),酵母細(xì)胞濃度從指數(shù)期開始比添加90 U/kg普魯蘭酶時(shí)高,而增幅非常小,R2=0.212 1。由于四條酵母生長曲線R2都趨近于0,因此吸光度A與時(shí)間的線性關(guān)系很小。

    由于在啤酒酵母代謝過程中,普魯蘭酶將麥芽汁中的使α-1,6糖苷鍵脫支,促進(jìn)糖化分解,且普魯蘭酶本身無毒無害,啤酒酵母能充分利用培養(yǎng)基中的單糖以補(bǔ)充自身生長所需的碳源,充足的酵母膏為啤酒酵母提供生長所需的氮源。啤酒酵母在添加普魯蘭酶的液體培養(yǎng)基中細(xì)胞分化就很旺盛,酵母細(xì)胞濃度也就高,表明普魯蘭酶對啤酒酵母的生長有良好地促進(jìn)作用,確保后續(xù)能夠在發(fā)酵時(shí)添加普魯蘭酶的條件下進(jìn)行良好地生長代謝。

    3 結(jié)論

    本研究在麥芽汁培養(yǎng)基中添加(0~120 U/kg)普魯蘭酶,普魯蘭酶使麥芽汁中的使α-1,6糖苷鍵脫支,促進(jìn)糖化分解,經(jīng)過觀察啤酒酵母菌落形態(tài)和生長曲線,當(dāng)添加普魯蘭酶濃度為120 U/kg時(shí),酵母細(xì)胞濃度最高。這是由于普魯蘭酶本身無毒無害,啤酒酵母能充分利用培養(yǎng)基中的單糖以補(bǔ)充自身生長所需的碳源,充足的酵母膏為啤酒酵母提供生長所需的氮源,有利于其對糖類物質(zhì)的利用,促進(jìn)啤酒酵母產(chǎn)生更多的酒精和CO2。該結(jié)果不僅具有重要的理論意義,擴(kuò)寬普魯蘭酶的應(yīng)用領(lǐng)域,還能提高啤酒酵母的利用率,對強(qiáng)化食品發(fā)酵及風(fēng)味改善有積極作用。

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