啤酒酵母基因工程菌種的構(gòu)建方法研究現(xiàn)狀與應(yīng)用

于洪梅

摘 ?要：啤酒酵母的質(zhì)量控制決定了啤酒的質(zhì)量，基因工程育種技術(shù)具有定向性，可以對啤酒酵母進行育種、改良及風(fēng)味改進。利用基因工程技術(shù)，在不改變酵母原有特性的基礎(chǔ)上，能賦予酵母新的特性。可以有效利用麥芽汁中的營養(yǎng)物質(zhì)，降低不利的副產(chǎn)物生成量，改良發(fā)酵性能等。該文簡述基因工程育種的主要方法及在啤酒酵母育種中的應(yīng)用情況。

關(guān)鍵詞：啤酒酵母 ?基因工程 ?育種 ?菌種

中圖分類號：TS262 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標(biāo)識碼：A文章編號：1672-3791（2020）12（c）-0044-03

Research Status and Application of Genetically Engineered Strains of Beer Yeast

YU ?Hongmei

（Changchun Vocational Institute of Technology， Changchun， Jilin Province，130033 ?China）

Abstract： The genetic engineering breeding technology is directional and can be used to breed and improve the beer yeast and make the flavor of beer yeast better. Using genetic engineering technology， the yeast can be given new characteristics without changing the original characteristics of the yeast. This article briefly describes the main methods of genetic engineering breeding and its application in beer yeast breeding.

Key Words： Beer yeast; Genetic engineering; Breeding; Strain

酵母是一種單細(xì)胞真菌微生物，已知的種類約有56屬500多種[1]。啤酒酵母是啤酒釀造的靈魂，啤酒的風(fēng)味主要由啤酒酵母代謝產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)綜合形成，風(fēng)味穩(wěn)定性是啤酒最重要的質(zhì)量指標(biāo)之一[2]，啤酒酵母的質(zhì)量控制決定了啤酒的質(zhì)量[3]。因此，選育性能優(yōu)良的啤酒酵母，是啤酒生產(chǎn)企業(yè)長期而艱巨的任務(wù)。微生物育種的方法有很多，隨著DNA重組技術(shù)的發(fā)展，啤酒酵母的定向育種迅速發(fā)展起來?；蚬こ碳夹g(shù)包括雜交、細(xì)胞融合、稀有交配、轉(zhuǎn)化、突變、DNA重組技術(shù)等，近年來，多株Lager酵母菌株陸續(xù)完成了全基因組測序，為探索不同類型Lager酵母起源提供了基因組學(xué)基礎(chǔ)[4]。利用基因工程技術(shù)，可以對啤酒酵母進行育種、改良及風(fēng)味改進。該文主要介紹基因工程菌種的構(gòu)建方法及在啤酒酵母育種方面的應(yīng)用。

1 ?基因工程技術(shù)

基因工程技術(shù)也稱為DNA重組技術(shù)，是從生物體內(nèi)提取出一定的DNA或人工合成DNA，把它和作為載體的質(zhì)?；蚴删w在體外重組，再轉(zhuǎn)移到另一生物體內(nèi)，從而改變生物的遺傳性狀?；蚬こ碳夹g(shù)包括4個步驟：目的基因的獲取;載體與工具酶的選擇;DNA體外重組;外源基因的無性繁殖和表達?；蚯贸夹g(shù)又稱基因打靶技術(shù)，將構(gòu)建的打靶載體導(dǎo)入靶細(xì)胞后，通過載體DNA序列和靶細(xì)胞染色體的同源序列進行重組，將靶細(xì)胞基因組上的某一確定片段置換，使特定基因失活或缺失，從而改變細(xì)胞遺傳特性[5]。

2 ?基因工程技術(shù)在啤酒酵母育種的應(yīng)用

2.1 有效利用糊精

糖化過程中形成的高分子糊精不能被酵母利用，而葡萄糖苷酶能將其水解為葡萄糖，將葡萄糖苷酶的基因引入酵母中，可以有效利用麥芽汁中的糊精，改善啤酒的過濾性能，提高啤酒的發(fā)酵度。葡萄糖苷酶由同源基因STA1（DEX1）、STA2（DEX2）、STA3（DEX3）控制，能水解β-1，4糖苷鍵和β-1，6糖苷鍵，使糊精轉(zhuǎn)化為葡萄糖。有報道顯示克隆葡萄糖苷酶的酵母能水解麥芽汁中70%的糊精。

2.2 分解β-葡聚糖

β-葡聚糖的黏度很高，不利于麥芽汁和啤酒的過濾性能以及啤酒的風(fēng)味穩(wěn)定性。β-葡聚糖酶可以水解β-1，4和β-1，3葡萄糖苷鍵，將β-葡聚糖降解，從而降低醪液的黏度。含有細(xì)胞外β-葡聚糖基因的酵母能降解β-葡聚糖，改善啤酒的過濾性能。Meaden.P.G和PentJIia.M分別克隆了枯草芽孢桿菌和真菌的葡聚糖基因，并獲得了具有葡聚糖分解能力的酵母，從而解決葡聚糖引起的渾濁問題。

2.3 降低雙乙酰的生成量

雙乙酰是啤酒發(fā)酵的副產(chǎn)物，對啤酒風(fēng)味的影響很大，雙乙酰含量的高低作為衡量啤酒是否成熟的指標(biāo)（0.1 mg/L）。雙乙酰是由丙酮酸在生物合成纈氨酸或異亮氨酸時，中間代謝產(chǎn)物α-乙酰乳酸轉(zhuǎn)化得到的。雙乙酰在酵母體內(nèi)可被還原酶作用生成乙偶姻和2，3-丁二醇，或直接被α-乙酰乳酸脫羧酶作用快速生成乙偶姻。李艷等采用基因工程技術(shù)降低ILV2的活性，使α-乙酰乳酸生成量減少，缺失ILV2的酵母AHAS活性降低75%，雙乙酰含量降低30%，其他發(fā)酵性能均為正常。Mithieux S等將ILV5在啤酒酵母中表達，RI活力可大幅度提高，利用此酵母發(fā)酵的啤酒，雙乙酰含量降低50%，縮短了啤酒成熟的時間。Yamano S等將ALDC基因整合到釀酒酵母染色體上，用于啤酒的發(fā)酵可顯著降低雙乙酰的生成。用ILV5取代ILV2，降低AHAS的酶活力，減少α-乙酰乳酸生成量，并促進生成的α-乙酰乳酸轉(zhuǎn)變?yōu)槔i氨酸，從而降低雙乙酰的生成量。也可通過結(jié)構(gòu)類似物選育低α-乙酰乳酸合成酶活性或雙乙酰還原能力強的抗性突變株，達到降低雙乙酰的目的，但這種方法對降低雙乙酰的程度有限。石婷婷等人采用PCR技術(shù)構(gòu)建了BDH2基因整合過表達的重組酵母菌株B2Z，經(jīng)啤酒發(fā)酵，BDH2基因的過表達使雙乙酰的生成量降低，峰值和還原后的雙乙酰分別降低42.61%和32.73%，其他指標(biāo)基本符合啤酒發(fā)酵的要求[6]。

2.4 降低H2S的生成量

H2S是啤酒中主要的硫化物之一，影響啤酒的風(fēng)味。主要在發(fā)酵過程中形成，酵母對半胱氨酸及硫酸鹽和亞硫酸鹽的同化作用及酵母合成蛋氨酸受抑制時的中間產(chǎn)物。可通過克隆NHS5基因，或?qū)⒖寺ET25基因置于糖酵解啟動子控制下，并將其整合到酵母的rDNA中，均可降低H2S的生成量。

2.5 降低高級醇的生成量

高級醇是在主發(fā)酵期間形成的，是啤酒的主要香味和口味物質(zhì)之一，是3個碳以上的一元醇類物質(zhì)的總稱，包括正丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇等。適量的高級醇能使酒體豐富，口味協(xié)調(diào)，給人以醇厚的感覺，但如果含量過高，會導(dǎo)致飲后上頭并使啤酒有異味，應(yīng)嚴(yán)格控制。高級醇產(chǎn)生途徑，一方面來自于氨基酸轉(zhuǎn)氨途徑;另一方面來自于糖代謝途徑，α-酮酸由葡萄糖經(jīng)EMP途徑和TCA循環(huán)合成。A.Eden等人發(fā)現(xiàn)異戊醇、活性戊醇和異丁醇受ecaΔ39、ecaΔ40的影響顯著，BCAT可切斷或減弱氨基酸轉(zhuǎn)變成α-酮酸的能力，減少纈氨酸到異丁醇、亮氨酸到異戊醇的產(chǎn)生。Dickenson等人的研究顯示，從纈氨酸到異丁醇的代謝途徑中，丙酮酸脫羧酶是合成異丁醇的關(guān)鍵步驟，通過構(gòu)建丙酮酸脫羧酶活性降低的工程菌可降低異丁醇的生成量。正丙醇由α-酮丁酸進一步脫羧脫氫生產(chǎn)成，丙酮酸在合成纈氨酸的過程中會生產(chǎn)異丁醇的前體物質(zhì)α-酮異戊酸[7]，其能被異丙基蘋果酸合成酶催化生成異戊醇的前體物質(zhì)α-酮異己酸[8]。石鈺[9]等人通過構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC-LABK，獲得LA-KanMX-LB重組盒，并利用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法和同源重組技術(shù)，篩選出LEU1基因缺失的突變株A-L9，兩種發(fā)酵條件下，異戊醇的生成量分別降低了0.29倍和0.51倍。

2.6 解決醇高酯低的問題

啤酒發(fā)酵的副產(chǎn)物中，乙酸乙酯和高級醇是影響啤酒風(fēng)味的重要物質(zhì)，葛峻伶等人通過對BAT2基因和Lg-ATF1基因的研究[10]，解決啤酒釀造過程中醇類和酯類的生成量的問題。BAT2基因影響高級醇的生成量，Lg-ATF1基因影響乙酸乙酯的生成量，通過酶切連接法重組質(zhì)粒pUC-PLABBK，獲得重組菌株S5-Lg，過表達Lg-ATF1基因，并敲除BAT2基因，經(jīng)過發(fā)酵后，重組菌株S5-Lg的高級醇降低9.12%，乙酸乙酯升高26.81%。菌株S5-Lg與原菌株S5的生長性能和發(fā)酵性能基本保持一致。

2.7 發(fā)酵性能的改良

啤酒釀造過程中，酵母凝聚的好壞是至關(guān)重要的[11]。絮凝性是啤酒酵母的重要特性之一，良好的絮凝性能使酵母在啤酒發(fā)酵后快速沉淀到發(fā)酵罐底部，既能降低分離酵母所需的能源，也能避免酵母不及時沉淀，而懸浮在發(fā)酵液中造成的酵母自溶現(xiàn)象，并能使啤酒發(fā)酵順利進行。在啤酒發(fā)酵中使用高PYF活力水平的麥芽時，酵母便會提前絮凝，該現(xiàn)象對啤酒釀造產(chǎn)生不利影響，應(yīng)設(shè)法避免。絮凝是酵母自我保護的方式，在不利環(huán)境中，酵母的絮凝可使其避免受到各種因素的脅迫，絮凝基因的改變會影響酵母對抗逆境的能力。李靜怡等人利用PCR介導(dǎo)基因中斷技術(shù)，以pUG6為模板，設(shè)計含有與flo8基因兩側(cè)序列同源的引物，構(gòu)建帶有KanMX基因的中斷盒，醋酸鋰法轉(zhuǎn)化啤酒酵母G-03，轉(zhuǎn)化啤酒酵母，使基因片段同源重組，敲除FLO8基因，會有所削弱啤酒酵母的絮凝力，從而削弱提前絮凝因子對酵母的作用，在高PYF值麥芽汁中發(fā)酵能保持很好的發(fā)酵性能。

2.8 高溫高濃發(fā)酵菌種的構(gòu)建

啤酒釀造通常采用低溫發(fā)酵，而高溫高濃發(fā)酵將給啤酒生產(chǎn)企業(yè)帶來利益，但會存在酵母回收問題、副產(chǎn)物高級醇生成量過高問題等。孫中貫等人通過以BAT2基因為整合位點過表達FLO5基因構(gòu)建了酵母菌株[12]，啤酒酵母的凝聚性達到85.44%，與出發(fā)菌株相比，提高了63%，通過弱化線粒體支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶（BAT1）的表達，高級醇生成量為142.13 mg/L，降低了18.4%。BAT基因與FLO5基因在改造過程中，不存在互相干擾或協(xié)同的現(xiàn)象。通過對FLO5基因和BAT基因的遺傳改造，提高了啤酒酵母高溫高濃發(fā)酵的凝聚性能，并降低了高級醇的生成量，此研究對啤酒發(fā)酵后酵母的回收及啤酒風(fēng)味有重要意義。

2.9 抗自溶啤酒酵母菌種的選育

啤酒酵母的自溶會影響啤酒的品質(zhì)，王金晶等人在啤酒酵母自溶的研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞完整性途徑中，RLM1基因作為重要的轉(zhuǎn)錄因子，與酵母的自溶性有密切的關(guān)系[13]。將RLM1基因敲除后，啤酒酵母的抗自溶性會變差，并影響酵母的抗?jié)B透壓性能，使細(xì)胞壁損傷的耐受性、抗氮饑餓性能和溫度耐受性;而RLM1基因過表達則會有助于啤酒酵母的抗自溶。因此，基于同源重組的方法對RLM1基因進行敲除和過表達，獲得重組菌H-rlm1Δ和H-rlm1，啤酒酵母對細(xì)胞壁損傷、氮饑餓、滲透壓的耐受性以及溫度的敏感性都受到了影響。通過對RLM1基因的調(diào)控，對酵母的抗自溶能力產(chǎn)生影響，為啤酒酵母抗自溶能力菌株的選育提供依據(jù)。

3 ?結(jié)語

利用DNA重組技術(shù)進行啤酒酵母的育種是目前廣泛使用的方法，在基因工程菌種構(gòu)建的過程中，外源基因應(yīng)盡可能少，而且其表達一定不能影響到酵母的發(fā)酵性能;所用的目的基因需確認(rèn)是無毒的酵母菌株。利用DNA重組技術(shù)對啤酒酵母定向育種，將會獲得更優(yōu)質(zhì)的啤酒酵母，釀造出質(zhì)量更好、風(fēng)味更佳的啤酒。

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