功能性老年乳粉中300種非法添加藥物及其類似物的液相色譜-高分辨質(zhì)譜分析

寧 霄, 金紹明, 李志遠(yuǎn), 楊崇俊, 貌 達(dá), 曹 進(jìn)*

(1.中國(guó)食品藥品檢定研究院,北京 100050; 2.SCIEX中國(guó),北京 100015; 3.濟(jì)寧市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所,山東 濟(jì)寧 272000; 4.中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院化學(xué)計(jì)量與分析科學(xué)研究所,北京 100029)

隨著我國(guó)老齡化進(jìn)程不斷加劇,保養(yǎng)保健觀念逐步普及,人們對(duì)功能性食品的需求也從保健食品延伸到了普通食品[1]。為了迎合老年群體個(gè)性化的需求,宣稱具有調(diào)節(jié)血糖、增強(qiáng)免疫力和改善睡眠等功能的老年乳粉不斷涌現(xiàn)[2],一些生產(chǎn)企業(yè)通過非法添加化學(xué)藥物來實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品聲稱的顯著功效,對(duì)老年人的健康構(gòu)成潛在威脅[3]。

非法添加的化學(xué)藥物種類繁多,添加劑量及種類不明確[4-6]?，F(xiàn)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法針對(duì)已知化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行靶向分析,需要按照功能聲稱分類別進(jìn)行檢測(cè),涉及方法種類繁多,且前處理及檢測(cè)技術(shù)不盡相同,既耗費(fèi)人力物力,又嚴(yán)重制約了監(jiān)管部門對(duì)未知風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)的偵查能力。因此,迫切需要開發(fā)一種簡(jiǎn)便、靈敏的不受類別限制的高通量分析方法,用于新興功能性老年乳粉中非法添加化學(xué)藥物的高效偵查。

高分辨質(zhì)譜可以提供更高的選擇性和質(zhì)量精度[7,8],結(jié)合色譜分離手段,可實(shí)現(xiàn)對(duì)異構(gòu)體或具有相似精確質(zhì)量數(shù)分子的準(zhǔn)確區(qū)分[9]。但現(xiàn)有研究多針對(duì)單一或幾個(gè)類別的已知藥物建立篩查數(shù)據(jù)庫(kù),同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中已知化合物定量分析和對(duì)未知結(jié)構(gòu)類似物預(yù)測(cè)確證的策略報(bào)道較少。順序窗口采集所有理論質(zhì)譜模式(sequential window acquisition of all theoretical mass spectra,SWATH)結(jié)合數(shù)據(jù)非依賴型采集(data-independent acquisition,DIA)技術(shù)克服了原有依賴型采集(data-dependent acquisition,DDA)模式的隨機(jī)性和局限性,具有快速的采集速度、高質(zhì)量的MS/MS數(shù)據(jù)和顯著提高二級(jí)碎片靈敏度等優(yōu)勢(shì)[10]。此外,對(duì)于未知物的鑒定,區(qū)別于傳統(tǒng)的碰撞活化解離(collision-activated dissociation,CAD)碎裂技術(shù),新型的電子激活解離(electron-activated dissociation,EAD)碎裂技術(shù)通過獨(dú)立捕獲前體離子和自由電子,實(shí)現(xiàn)有效的自由基斷裂,從而獲得更豐富的碎片信息,與CAD形成良好的互補(bǔ)性,有效提升定性和未知物解析的準(zhǔn)確度。上述技術(shù)賦予UHPLC-HRMS兼具小分子定性和定量分析的潛力,已逐步應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域,但在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用尚待開發(fā)。

在樣品前處理方面,已有研究使用有機(jī)溶劑稀釋提取后直接分析[11-13],然而,復(fù)雜食品基質(zhì)中多種化合物的分析很容易受到基質(zhì)干擾[14]。部分研究嘗試采用萃取技術(shù)改善基質(zhì)效應(yīng)[15-20],但操作耗時(shí),且缺乏基質(zhì)特異性驗(yàn)證的信息及探討[21-24]。

本研究針對(duì)老年人近年來關(guān)注的功能性乳粉,將QuEChERS與基于SWATH DIA的超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight-mass spectrometry,UHPLC-QTOF-MS)分析技術(shù)相結(jié)合,對(duì)我國(guó)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)涉及的檢測(cè)指標(biāo)補(bǔ)充完善,建立了300種非法添加藥物篩查數(shù)據(jù)庫(kù)及定量分析方法,檢測(cè)目標(biāo)物涉及降血壓、降血糖、減肥降脂、鎮(zhèn)定安眠及解熱鎮(zhèn)痛等藥物。該方法操作簡(jiǎn)便,單次進(jìn)樣,無需標(biāo)準(zhǔn)品,即可預(yù)判多類功效產(chǎn)品中已知藥物的非法添加情況,適用于大批量樣品的快速測(cè)定。此外,基于EAD碎裂技術(shù)獲得的豐富二級(jí)碎片質(zhì)譜裂解信息,本工作構(gòu)建了對(duì)樣品中未知非法添加藥物的識(shí)別鑒定策略。該研究成功應(yīng)用于市售功能性老年乳粉中非法添加物的偵查,識(shí)別出已知及未知風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)共3種。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Exion LC 2.0 超高效液相色譜-Zeno TOF 7600四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜,配備Zeno trap離子阱和EAD碰撞室(美國(guó)AB SCIEX公司);離心機(jī)CR22GⅢ(日本HITACHI公司);電子天平XP205(瑞士Mettler Toledo公司);純水儀Milli-Q (美國(guó)Millipore公司)。

所有化合物標(biāo)準(zhǔn)品均為標(biāo)準(zhǔn)溶液,質(zhì)量濃度為1 mg/mL,購(gòu)自天津阿爾塔科技有限公司。甲醇(MeOH)、乙腈(ACN)、甲酸銨(質(zhì)譜純,NH4HCO2)均購(gòu)于美國(guó)ThermoFisher公司;甲酸(質(zhì)譜純,FA)購(gòu)于美國(guó)Fluka公司;實(shí)驗(yàn)用水為超純水(符合GB/T 6682-2008一級(jí)水要求);硫酸鎂(MgSO4)、硫酸鈉(Na2SO4)、乙酸鈉(NaAc)、氯化鈉(NaCl)、檸檬酸(C6H8O7·H2O)、十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)均為分析純,購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;EMR-Lipid凈化材料購(gòu)于美國(guó)Agilent公司。

市售樣品(60個(gè))購(gòu)自北京、廣西、山東等地超市或農(nóng)貿(mào)市場(chǎng),根據(jù)不同樣品的市場(chǎng)占有率情況,本研究抽取樣品的數(shù)量如下:聲稱增強(qiáng)免疫力/緩解體力疲勞類乳粉共33份,聲稱輔助調(diào)節(jié)血糖/血壓/血脂類乳粉共15份,聲稱補(bǔ)腎壯陽(yáng)類乳粉共12份。購(gòu)買后置于陰涼處常溫保存。

1.2 溶液配制

Mcllvaine溶液:將1 000 mL 0.1 mol/L的檸檬酸溶液與625 mL 0.2 mol/L磷酸氫二鈉混合而得; 0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine溶液:稱取60.5 g乙二胺四乙酸二鈉于1 625 mL Mcllvaine溶液中,溶解并搖勻。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液配制:取適量標(biāo)準(zhǔn)溶液,用乙腈稀釋,配制成1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,于4 ℃保存。

空白基質(zhì)提取液:空白樣品按照1.3節(jié)條件進(jìn)行前處理,獲得空白基質(zhì)提取液。

基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:準(zhǔn)確吸取適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間液,用空白基質(zhì)提取液逐級(jí)稀釋成系列質(zhì)量濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品前處理方法

稱取2 g乳粉樣品于50 mL具塞離心管中,加入10 mL 40 ℃溫水,渦旋1 min,使成均勻乳液。加入10 mL 0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine溶液-乙腈(2∶8,v/v),隨后加入2 g Na2SO4和0.5 g NaCl進(jìn)行鹽析,漩渦30 s,超聲10 min,4 ℃下以10 000 r/min離心5 min。移取4 mL上清液置于含500 mg EMR-Lipid的離心管中,渦旋振蕩1 min,再離心5 min (10 000 r/min,4 ℃),取1 mL上清液加入l mL水,混勻后待測(cè)。

1.4 色譜條件

Kinetex F5色譜柱(100 mm×3.0 mm,2.6 μm);柱溫40 ℃;流速為0.5 mL/min;進(jìn)樣量為10 μL。正離子模式MS檢測(cè)時(shí),流動(dòng)相為(A) 5 mmol/L甲酸銨水溶液(含0.1%(v/v)甲酸)和(B)甲醇-乙腈(1∶1,v/v),梯度洗脫。梯度洗脫程序:0～1.0 min,5%B; 1.0～8.0 min,5%B～45%B; 8.0～17.0 min,45%B～60%B; 17.0～20.0 min,60%B～95%B; 20.0～22.0 min,95%B; 22.0～22.1 min,95%B～5%B; 22.1～25.0 min,5%B。負(fù)離子模式MS檢測(cè)時(shí),流動(dòng)相為(A)水和(B)甲醇-乙腈(1∶1,v/v),梯度洗脫。梯度洗脫程序:0～1.0 min,5%B; 1.0～8.0 min,5%B～45%B; 8.0～17.0 min,45%B～60%B; 17.0～20.0 min,60%B～95%B; 20.0～22.0 min,95%B; 22.0～22.1 min,95%B～5%B; 22.1～25.0 min,5%B。

1.5 質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧離子源,正/負(fù)離子模式。離子源溫度550 ℃,噴霧電壓(IS) 5 500 V,離子源氣體1 (GS1)壓力379.2 kPa(55 psi),離子源氣體2 (GS2)壓力379.2 kPa(55 psi),氣簾氣壓力241.3 kPa (35 psi)。掃描模式:Zeno SWATH DIA。一級(jí)質(zhì)譜參數(shù):去簇電壓(DP)50 V,質(zhì)量數(shù)掃描范圍20～1 200,累積時(shí)間0.1 s。二級(jí)質(zhì)譜參數(shù):質(zhì)量數(shù)掃描范圍20～1 200,根據(jù)m/z的實(shí)際分布,共拆分成12段可變窗口。使用SCIEX OS進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和處理。部分參數(shù)見表1。

表1 300種待測(cè)物的理化參數(shù)、質(zhì)譜參數(shù)及色譜保留時(shí)間

1.6 數(shù)據(jù)庫(kù)的建立及使用

將質(zhì)量濃度為100 μg/L的單一分析物標(biāo)準(zhǔn)溶液注入U(xiǎn)HPLC-QTOF-MS中,并進(jìn)行數(shù)據(jù)采集,以低、中、高碰撞能量(20、35、50 eV)的DIA掃描模式,利用動(dòng)態(tài)背景過濾(DBS)功能自動(dòng)扣除背景離子,建立了包含精確質(zhì)量數(shù)和片段離子的MS/MS譜庫(kù)。篩查確認(rèn)原則設(shè)置:精確質(zhì)量數(shù)偏差絕對(duì)值≤5×10-6(5 ppm),保留時(shí)間誤差≤0.2 min,差異同位素比≤10%,檢索匹配分值≥90。

1.7 未知結(jié)構(gòu)類似物的確證

取待測(cè)樣品,按照1.3節(jié)方法處理,采用優(yōu)化后的色譜條件進(jìn)行分離,確定保留時(shí)間后,按照優(yōu)化后的質(zhì)譜條件進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描,得到準(zhǔn)分子離子峰,經(jīng)擬合確定化合物的分子式;對(duì)母離子進(jìn)行子離子掃描,得到二級(jí)碎片質(zhì)譜圖,進(jìn)而推斷化合物母核及丟失碎片等基本結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1色譜柱的選擇

目標(biāo)分析物種類廣泛,理化性質(zhì)各異,涉及多組精確質(zhì)量數(shù)相似或同分異構(gòu)體化合物。為了最大限度地兼顧所有組分的分離度和響應(yīng)值,需要對(duì)色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行逐一優(yōu)化,從而實(shí)現(xiàn)300種化合物的同步UHPLC-Q-TOF/MS分析。一般來說,保留和分離的機(jī)制可能包括疏水相互作用、離子交換、離子對(duì)、表面局部化等。對(duì)于某些含有不飽和結(jié)構(gòu)或平面結(jié)構(gòu)的化合物,另一個(gè)重要的選擇性因素是π-π相互作用。本研究采用Kinetex五氟苯基柱實(shí)現(xiàn)了較好的分離效果。

2.1.2流動(dòng)相的選擇

在色譜條件的優(yōu)化過程中,考慮到非法添加化學(xué)藥物中有多組同分異構(gòu)體,如吡唑N-去甲基西地那非、N-去乙基伐地那非和N-去甲基西地那非3種化合物的質(zhì)荷比在正離子模式下均為461.196 6,即使高分辨質(zhì)譜也無法區(qū)分,有必要通過色譜條件的優(yōu)化實(shí)現(xiàn)有效分離。如圖1a～e所示,當(dāng)甲醇作為流動(dòng)相的有機(jī)相、并在水相中添加2.5、5.0、10.0 mmol/L甲酸銨時(shí),采用1.4節(jié)下梯度洗脫程序進(jìn)行分析,這3種化合物的色譜保留均較強(qiáng),色譜分離度相對(duì)較好,但色譜峰形較差,特別是N-去甲基西地那非,色譜峰出現(xiàn)不同程度的分叉;當(dāng)有機(jī)相更換為乙腈時(shí),3種化合物均得到了比較好的色譜峰形,但分離度和色譜保留效果不及甲醇,故最終采用甲醇-乙腈(1∶1,v/v)作為流動(dòng)相的有機(jī)相,實(shí)現(xiàn)了色譜峰形、分離度和保留行為的同時(shí)兼顧。在優(yōu)化的色譜條件下,上述3種同分異構(gòu)體得到了良好的分離。

圖1 兩組同分異構(gòu)體的分離色譜圖

在此基礎(chǔ)上,繼續(xù)考察流動(dòng)相pH值對(duì)化合物色譜行為的影響,以同分異構(gòu)體硫代豪莫西地那非、硫代艾地那非和丙氧苯基硫代西地那非為例:3種化合物的質(zhì)荷比在正離子模式下均為505.205 0,嘗試添加不同體積分?jǐn)?shù)的甲酸(包括添加0、0.01%、0.1%甲酸)改善同分異構(gòu)體的分離。結(jié)果表明,隨著甲酸體積分?jǐn)?shù)的上升,3種化合物在更短的分析時(shí)間內(nèi)獲得了更好的分離效果,最終確定甲酸添加體積分?jǐn)?shù)為0.1%,從而滿足多組分高分辨質(zhì)譜定量的需求,相關(guān)譜圖見圖1f～h。

研究表明,在上述流動(dòng)相條件下,正、負(fù)離子掃描模式下各組分均獲得有效分離,峰形良好,故確定為最終流動(dòng)相。

2.2 前處理?xiàng)l件的選擇

2.2.1提取溶劑的選擇

首先從分配系數(shù)(oil-water partition coefficient,lgP)角度了解目標(biāo)藥物的溶解性,所有藥物的lgP值為-8.564 5～6.881 9,其中98%的待測(cè)組分lgP<5,另外6種的lgP值為-5.128 1～6.881 9,均不屬于強(qiáng)疏水性藥物。同時(shí),考慮到該值體現(xiàn)了液液萃取時(shí)的油水分配系數(shù),而本研究需要從固體乳粉中直接將待測(cè)組分提取至混溶劑中,提取原理不盡相同,因此,本文選擇對(duì)所有藥物均具有良好溶解性的甲醇、乙腈以及乙腈高占比的水-乙腈 (2∶8,v/v)混合溶液作為提取溶劑進(jìn)行實(shí)際考察,提取結(jié)果取決于是否能夠有效脫脂、脫蛋白質(zhì),從而獲得潔凈即低離子干擾的提取物。分別以添加水平為10 μg/kg的牛源性和羊源性老年乳粉為基質(zhì)(取試樣2 g,置于50 mL具塞離心管中,分別加入20 μL 1 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)中間液和10 mL 40 ℃溫水,渦旋1 min),比較了以下5種提取溶劑:乙腈、1%甲酸水溶液-乙腈(2∶8,v/v)、水-乙腈(2∶8,v/v)、0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液-乙腈(2∶8,v/v)和甲醇。不同提取溶劑的效果見圖2Ⅰ和2Ⅱ。

圖2 樣品預(yù)處理?xiàng)l件優(yōu)化(n=3)

當(dāng)使用甲醇提取時(shí),大部分目標(biāo)化合物的回收率低于60%,可能由于乳粉中氨基酸、糖等大分子極性雜質(zhì)易溶于甲醇,蛋白質(zhì)沉淀效果較弱。當(dāng)使用乙腈提取時(shí),整體提取效率明顯提高,可見乙腈的寬極性包容性為極性各異的多類化合物提供了較好的溶解度,而對(duì)蛋白質(zhì)、脂肪、糖等干擾物的提取率低,因此選擇乙腈作為提取溶劑的有機(jī)相。繼續(xù)考察水相與有機(jī)相混合提取的效果及不同改性劑對(duì)提取效率的影響。將水、0.1%甲酸水溶液和0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液分別與乙腈以2∶8的體積比混合作為提取溶液[25]。結(jié)果表明,與純水配比的混合溶劑提取效率優(yōu)于純乙腈,但在水相中加入0.1%甲酸后部分化合物回收率明顯降低,可能由于多數(shù)化合物在酸性條件下以離子形式存在,降低了其在有機(jī)溶劑中的溶解度。反之,與純水相比,0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液的加入,有效改善了沙星類等藥物的回收率,說明此類藥物可能與樣品中的金屬離子存在螯合作用,而Na2EDTA的加入有助于將藥物釋放?；谝陨辖Y(jié)果,確定0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液-乙腈(2∶8,v/v)為提取溶劑。此時(shí),共146種分析物在兩種樣品基質(zhì)中的回收率在80%～120%范圍內(nèi)?？梢?采用溶劑直接稀釋法提取時(shí),部分分析物的回收率仍不理想,有必要從基質(zhì)凈化角度進(jìn)一步提高回收率。

2.2.2鹽劑的優(yōu)化

為了使目標(biāo)化合物更完全地提取在乙腈層,本文按照1.3節(jié)下的處理流程操作,考察了4組鹽劑的鹽析效果,分別為0.5 g NaCl+2 g Na2SO4、0.5 g NaAc+2 g Na2SO4、0.5 g NaCl+2 g MgSO4和0.5 g NaAc+2 g MgSO4。結(jié)果表明,0.5 g NaCl+2 g Na2SO4的鹽析效果最佳,188種分析物在兩種樣品基質(zhì)中的回收率為80%～120%,全部300種分析物相應(yīng)的回收率為40.3%～160.8%。在萃取過程中加入MgSO4會(huì)釋放大量的熱量,影響化合物的提取效率,且MgSO4容易吸水結(jié)塊,影響樣品均質(zhì)效果。NaAc和MgSO4的加入降低了麻黃堿、沙丁胺醇等β-激動(dòng)劑的回收率。因此,選用0.5 g NaCl+2 g Na2SO4作為兩種樣品基質(zhì)的鹽劑。

2.2.3吸附劑的優(yōu)化

樣品在提取過程中經(jīng)過蛋白質(zhì)沉淀后,仍可能存在一些脂肪雜質(zhì),由于脂質(zhì)會(huì)引發(fā)質(zhì)譜分析中的基質(zhì)效應(yīng)而使方法性能下降且儀器壽命縮短。因此,有必要進(jìn)一步對(duì)提取液進(jìn)行凈化處理?？紤]到目標(biāo)組分的性質(zhì)多樣性,本研究選擇QuEChERS吸附法,按照1.3節(jié)下的處理流程操作,分別考察了300 mg十八烷基鍵合硅膠(C18,北京迪馬科技有限公司)、N-丙基乙二胺(PSA,北京迪馬科技有限公司)和EMR-Lipid dSPE吸附劑對(duì)藥物提取回收率的影響(如圖2Ⅲ和2Ⅳ所示)。吸附效果為EMR-Lipid>C18>PSA。C18雖然具有去除脂肪和脂類等非極性干擾物的潛力,但同時(shí)也因?yàn)榉沁x擇性吸附造成了阿司匹林、氟比洛芬和巴比妥類目標(biāo)物的損失。PSA通過陰離子交換吸附糖類和極性較高的酸性物質(zhì),對(duì)脂類物質(zhì)吸附能力較差,且會(huì)影響喹諾酮類、阿托品、布洛芬等酸性藥物的提取率。而增強(qiáng)型脂質(zhì)去除材料EMR-Lipid能夠選擇性去除基質(zhì)中的脂質(zhì)而將待測(cè)組分保留在提取液中。以300 mg EMR-Lipid為吸附劑時(shí),300種物質(zhì)中68.7%的藥物加標(biāo)回收率保持在80%～120%,平均加標(biāo)回收率為47.0%～159.1%,因此,最終選擇EMR-Lipid作為吸附劑。繼續(xù)對(duì)用量進(jìn)行了研究,分別考察了EMR-Lipid使用量為300、400、500和600 mg時(shí)的凈化效果。如圖2Ⅴ所示,牛源性樣品吸附劑用量與萃取效率差異的方差分析表明,使用400和500 mg EMR-Lipid時(shí),萃取效率較其他兩種用量顯著提升(P<0.05);如圖2Ⅵ所示,羊源性樣品中吸附劑EMR-Lipid的使用量增加至500 mg時(shí),提取效率顯著提升(P<0.05)。推測(cè)原因?yàn)榕Ｈ榉鄣闹竞柯愿哂谘蛉榉?因此,需要使用更多吸附劑去除脂類雜質(zhì)。而繼續(xù)增加吸附劑用量至600 mg,在兩種樣品基質(zhì)中的回收率整體水平均呈現(xiàn)下降,最終選擇EMR-Lipid吸附劑的使用量為500 mg。圖3為空白樣品經(jīng)優(yōu)化的QuEChERS方法處理前后的色譜圖。

圖3 經(jīng)優(yōu)化的QuEChERS方法凈化前后空白乳粉的色譜圖

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.3.1掃描方式的選擇

基于Zeno SWATH?DIA的UHPLC-Q-TOF/MS技術(shù),對(duì)常見老年乳粉中300種非法添加化學(xué)藥物進(jìn)行鑒定及定量分析。首先,在兩種電離模式下,比較了所有藥物前體/產(chǎn)物離子的靈敏度,確定了更加敏感的加合方式及相應(yīng)的正/負(fù)離子電離模式。大多數(shù)化合物的前體離子為質(zhì)子化[M+H]+或去質(zhì)子化[M-H]-分子離子,但達(dá)格列凈、卡格列凈選擇[M+NH4]+峰進(jìn)行分析能夠獲得更好的重復(fù)性結(jié)果,另外阿司匹林選擇源內(nèi)裂解峰作為母離子進(jìn)行高靈敏度定量分析。

2.3.2質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

本研究利用Zeno TOF 7600系統(tǒng)的Zeno trap阱富集功能與TOF加速器離子脈沖相匹配,解決了傳統(tǒng)Q-TOF系統(tǒng)低質(zhì)量端離子利用率低的問題,從而提高了定量分析時(shí)的靈敏度和重復(fù)性。以苯乙雙胍為例(見圖4),優(yōu)化后的定量峰面積增加了10倍以上,Zeno trap能夠顯著提升定量靈敏度。

圖4 Zeno功能開啟對(duì)苯乙雙胍響應(yīng)增加效果的色譜圖

2.3.3基于譜庫(kù)的定性篩查和確認(rèn)

為了考察所建立的篩查方法的可靠性,本實(shí)驗(yàn)采用已建立的一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫(kù)和二級(jí)譜圖庫(kù)對(duì)添加了300種化學(xué)藥物的乳粉樣品進(jìn)行自動(dòng)檢索。目標(biāo)化合物的綜合得分為91.9～99.8,所得結(jié)果均大于定性篩查的最低限(90分),篩查參數(shù)及結(jié)果分別見表1和附表1(www.chrom-China.com)。結(jié)果表明,本實(shí)驗(yàn)建立的篩查方法準(zhǔn)確可靠,能夠在無標(biāo)準(zhǔn)品的情況下完成所有目標(biāo)藥物的篩查與確證。

2.4 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.4.1選擇性

在適當(dāng)?shù)谋Ａ魰r(shí)間窗口(RTW)內(nèi)檢索目標(biāo)物,每個(gè)目標(biāo)物的RTW為3倍空白加標(biāo)樣品(加標(biāo)水平為10 μg/kg)保留時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)差[26,27]。結(jié)果表明,空白樣品在所有組分相應(yīng)的RTW內(nèi)均無干擾峰,檢索到的目標(biāo)分析物質(zhì)量數(shù)的精確偏差范圍≤5 ppm。

2.4.2基質(zhì)效應(yīng)(ME)

基質(zhì)效應(yīng)是基于電噴霧電離的質(zhì)譜方法中最具挑戰(zhàn)性的問題之一,通常通過比較標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在空白基質(zhì)提取液和純?nèi)軇┲械捻憫?yīng)來評(píng)估。根據(jù)公式(ME=ka/kb,ka和kb分別為目標(biāo)分析物在樣品基質(zhì)和溶劑中標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)計(jì)算。300種目標(biāo)物中N-苯丙烯基他達(dá)拉非、N-辛基去甲他達(dá)拉非、伐地那非乙?；愃莆锏饶欠穷愇镔|(zhì)以及培氟沙星、氟羅沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星等沙星類藥物的基質(zhì)效應(yīng)均大于1.5,可見基質(zhì)干擾對(duì)質(zhì)量精度和目標(biāo)分析物響應(yīng)的影響不能完全忽略。消除基質(zhì)效應(yīng)常用的方法有兩種:基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液法和同位素內(nèi)標(biāo)法。由于分析物種類繁多,性質(zhì)各異,同位素內(nèi)標(biāo)不能完全對(duì)應(yīng)。因此,本研究采用了基質(zhì)匹配校準(zhǔn)的方法來提高量化精度。

2.4.3線性范圍、檢出限和定量限

通過目標(biāo)分析物的標(biāo)準(zhǔn)曲線(6點(diǎn))考察方法的線性范圍。在2種基質(zhì)的相應(yīng)線性范圍內(nèi),所有組分均呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)均大于0.99。以添加回收樣品峰響應(yīng)值為3倍噪聲的添加水平為方法檢出限(LOD),以10倍噪聲的添加水平為方法定量限(LOQ)。羊乳粉和牛乳粉中所有分析組分的LOD分別為0.1～2.7 μg/kg和0.1～2.6 μg/kg。以兩種樣品基質(zhì)中相對(duì)較高的LOQ確定方法的LOQ,LOQ為0.2～8.0 μg/kg,均優(yōu)于我國(guó)現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)中的靈敏度,可滿足快速篩查及確證的需要。乳粉中300種化學(xué)藥物的檢出限、定量限、線性范圍、基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)見附表2。

2.4.4回收率與精密度

通過加標(biāo)回收率評(píng)價(jià)該方法的準(zhǔn)確性。在低、中、高3個(gè)水平(1倍、5倍、20倍LOQ)下測(cè)定了加標(biāo)樣品中分析物的回收率,平行操作6次。77%分析物的平均回收率為80%～120%,如附表3所示,所有目標(biāo)組分在乳粉中的回收率為73.1%～125.2%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)≤14.8%。結(jié)果表明,該方法具有良好的準(zhǔn)確性和精密度。

2.5 方法應(yīng)用

應(yīng)用本方法對(duì)60批樣品中非法添加化學(xué)藥物進(jìn)行了快速篩查。經(jīng)與數(shù)據(jù)庫(kù)匹配分析,共檢出2種非法添加物質(zhì):在1份聲稱調(diào)節(jié)血糖的老年乳粉中檢出苯乙雙胍,含量為1.4 mg/g。苯乙雙胍曾被廣泛用于臨床Ⅱ型糖尿病的治療(每日推薦劑量為25 mg)。但因該藥會(huì)導(dǎo)致致死性乳酸酸中毒,且病死率極高,于2016年被我國(guó)禁止使用。而按照該乳粉推薦的每天食用量37.6 g計(jì)算,每日攝入量為41.4 mg,超過臨床使用劑量的1.5倍;在1份添加人參等中藥提取物的聲稱增強(qiáng)免疫力的樣品中檢出磷酸二酯酶選擇性抑制劑西地那非,含量為3.9 mg/g。

相關(guān)譜圖見圖5。

圖5 2個(gè)真實(shí)樣品非法添加藥物的鑒定譜圖

此外,應(yīng)用未知物的鑒定策略,本研究在1份聲稱調(diào)節(jié)血脂的老年乳粉中檢出一種安非他明結(jié)構(gòu)類似物?？梢晌镔|(zhì)在1.4節(jié)色譜條件下的保留時(shí)間為5.37 min,采用1.5節(jié)質(zhì)譜條件進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描,得到m/z164.143 4的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+峰,經(jīng)擬合后確定化合物的分子式為C11H17N (質(zhì)量偏差0.0 ppm),進(jìn)一步以m/z164.143 4為母離子進(jìn)行子離子掃描,由二級(jí)碎片質(zhì)譜圖(圖6a)可知,該化合物具有明顯的與安非他明相同的特征子離子m/z65.038 6、91.054 4、119.085 5,說明其具有與安非他明相同的二級(jí)碎片結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上,未知物的分子式相比安非他明增加一個(gè)-C2H4,因此推測(cè)該化合物結(jié)構(gòu)可能是在安非他明的氨基上增加一個(gè)-C2H4,或者增加兩個(gè)-CH3。經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn),兩種疑似物結(jié)構(gòu)分別為乙非他明和二甲基苯丙胺,互為同分異構(gòu)體。通過進(jìn)一步的二級(jí)碎片離子比對(duì)發(fā)現(xiàn),在傳統(tǒng)的CAD裂解模式下,兩種化合物的二級(jí)碎片離子高度相似(圖6b),通過二級(jí)碎片匹配基本無法區(qū)分。因此嘗試采用EAD碎裂技術(shù),將二者的母離子m/z164.143 4進(jìn)行裂解,通過優(yōu)化電子動(dòng)能(10 eV)和電子流(9 000 nA)可以得到更為豐富的二級(jí)碎片離子,如圖6c所示,通過對(duì)比乙非他明和二甲基苯丙胺的二級(jí)碎片發(fā)現(xiàn),二甲基苯丙胺在EAD模式下更容易斷裂一個(gè)-CH3形成m/z148.112 7的碎片,而乙非他明在EAD模式下雖然可以斷裂一個(gè)-CH3形成m/z148.112 6的碎片,但響應(yīng)相對(duì)較低,其更容易斷裂-CH2-CH3形成m/z134.097 1的碎片,獲得在CAD模式下無法實(shí)現(xiàn)的兩個(gè)特征碎片,因此可以對(duì)兩種同分異構(gòu)體進(jìn)行快速區(qū)分。由此推測(cè)這份聲稱調(diào)節(jié)血脂的老年乳粉中檢出的可疑未知物質(zhì)為乙非他明,這種曾用于治療肥胖癥的藥物因伴隨厭食的嚴(yán)重副作用而撤出市場(chǎng),目前作為第二類精神藥品管理。經(jīng)過與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息進(jìn)行比對(duì),保留時(shí)間和多級(jí)碎片離子均吻合,最終確認(rèn)推測(cè)結(jié)果。

圖6 可疑樣品中未知物的鑒定色譜圖及質(zhì)譜圖

3 結(jié)論

本研究建立了一種基于QuEChERS提取結(jié)合SWATH模式的UHPLC-QTOF-MS分析方法,用于老年乳粉中300種非法添加化學(xué)藥物的快速測(cè)定。該方法通過優(yōu)化的QuEChERS提取凈化方法,實(shí)現(xiàn)了從復(fù)雜樣品基質(zhì)中同時(shí)提取具有不同理化性質(zhì)及療效的多類別藥物。優(yōu)化后的方法在兩種驗(yàn)證基質(zhì)中的選擇性、線性關(guān)系、靈敏度、基質(zhì)效應(yīng)、準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果令人滿意,所有組分的分離檢測(cè)在25 min內(nèi)完成。在此基礎(chǔ)上,采用EAD技術(shù)建立了一種未知物的非靶向篩查及鑒定策略。方法應(yīng)用于不同地區(qū)市售真實(shí)樣品的分析,在60份樣品中檢出苯乙雙胍和西地那非2種非法添加藥物,并鑒定出一種已撤出市場(chǎng)的減肥藥品乙非他明,陽(yáng)性樣品檢出率為5%。研究結(jié)果表明,新興功能性乳粉可能對(duì)老年人存在潛在的健康風(fēng)險(xiǎn),有必要進(jìn)一步加大專項(xiàng)整治力度,擴(kuò)大樣品采集規(guī)模,全面開展涉老產(chǎn)品隱患排查。本研究建立的方法適用于多類別功能聲稱乳粉中300種化合物的高通量分析,同時(shí)為相關(guān)結(jié)構(gòu)類似物的識(shí)別確證提供了一種有效的技術(shù)手段。