液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜法測(cè)定牛奶中22種真菌毒素

童蘭艷, 許博舟, 聶雪梅, 王秀娟, 馬佳慧 國(guó) 偉, 李根容, 龔迎昆, 許秀麗*

(1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院,北京 100176; 2.國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(食品質(zhì)量與安全),國(guó)家乳業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心,北京 100176; 3.重慶市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院,國(guó)家農(nóng)副加工產(chǎn)品及調(diào)味品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心,重慶 401123)

自“三聚氰胺”事件發(fā)生以來(lái),乳品的安全問(wèn)題引起了廣大消費(fèi)者及相關(guān)監(jiān)管部門的關(guān)注[1,2]。近年來(lái),關(guān)于乳及乳制品中檢測(cè)出真菌毒素類物質(zhì)的事件時(shí)有報(bào)道[3-5]。真菌毒素是真菌在糧食和飼料中所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物,毒素通過(guò)食物鏈從牛、羊等轉(zhuǎn)移至乳及乳制品中,受污染的乳及乳制品即使經(jīng)過(guò)高溫、殺菌過(guò)程,真菌毒素也不會(huì)被破壞[6]。真菌毒素是由鐮刀菌屬、青霉屬、曲霉屬等真菌在適宜的溫、濕度條件下產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物[7]。大多數(shù)真菌毒素可通過(guò)抑制動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)和相關(guān)酶的合成破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu),導(dǎo)致動(dòng)物體肝臟[8]、腎臟[9]、神經(jīng)[10]、造血[11]等組織器官損害,具有致癌、致畸、致突變、神經(jīng)毒性以及免疫毒性等作用,嚴(yán)重威脅人類身體健康。隨著對(duì)真菌毒素研究的深入,一些新型的真菌毒素不斷被發(fā)現(xiàn),如單端孢霉烯族毒素、恩鐮孢菌毒素、白僵菌素和細(xì)胞松弛素等[12]。這些真菌毒素尚未得到監(jiān)管,沒(méi)有被標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法覆蓋,且毒理研究和污染數(shù)據(jù)有限,還能與其他真菌毒素協(xié)同作用產(chǎn)生更強(qiáng)毒性,因此被稱為“新興”真菌毒素。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于乳中黃曲霉毒素M1(AFM1)的限量標(biāo)準(zhǔn)為0.5 μg/kg,其他真菌毒素均未單獨(dú)制定殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。且現(xiàn)行GB 5009.22-2016[13]僅適用于乳中黃曲霉毒素M1和M2(AFM2)的測(cè)定。因此,針對(duì)尚未制定國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)限量或者研究較少的真菌毒素亟待開(kāi)展相關(guān)研究。

文獻(xiàn)報(bào)道的真菌毒素檢測(cè)方法主要有免疫分析法[14,15]、色譜法[16,17]和質(zhì)譜法[18,19]。質(zhì)譜法簡(jiǎn)化了前處理步驟,提高了準(zhǔn)確性和靈敏度,目前廣泛應(yīng)用于真菌毒素的檢測(cè)。三重四極桿質(zhì)譜定量準(zhǔn)確,但是分辨率不足。液態(tài)乳中脂肪含量高,基質(zhì)復(fù)雜,且真菌毒素含量較低,實(shí)現(xiàn)多種真菌毒素的高通量篩查及同時(shí)檢測(cè)存在極大挑戰(zhàn)。液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜法具有質(zhì)量分辨率高和提供準(zhǔn)確相對(duì)分子質(zhì)量的優(yōu)勢(shì),無(wú)需逐個(gè)優(yōu)化目標(biāo)化合物的質(zhì)譜參數(shù),不受傳統(tǒng)三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)化合物數(shù)量的限制,可通過(guò)提供母離子和碎片離子的精確質(zhì)量數(shù),實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)中目標(biāo)物的準(zhǔn)確定性[20,21]。因此本研究根據(jù)液態(tài)牛奶的基質(zhì)特點(diǎn),采用液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜分析系統(tǒng),建立了牛奶中22種真菌毒素同時(shí)測(cè)定的分析方法,通過(guò)一級(jí)全掃描獲得目標(biāo)物的精確質(zhì)量數(shù),同時(shí)結(jié)合數(shù)據(jù)依賴型二級(jí)掃描(dd-MS2)模式獲得目標(biāo)物的二級(jí)特征質(zhì)譜圖,快速、準(zhǔn)確、高效地完成了牛奶中22種真菌毒素的快速篩查和確證,以期為真菌毒素污染風(fēng)險(xiǎn)全面評(píng)估及防控技術(shù)研發(fā)提供思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Dionex Ultimate 3000超高效液相色譜儀(美國(guó)Dionex公司); Thermo Q-Exactive Orbitrap四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Fisher公司);電子天平XP 105DR(瑞士Mettler Toledo公司);移液器(德國(guó)Eppendorf公司); Vortex-Genie2多功能旋渦混合器(美國(guó)Scientific Industries公司); KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司); Allegra X-22R離心機(jī)(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司); MFV-24智能氮吹儀(得泰儀器科技有限公司)。

22種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品:恩鐮孢菌素A(ENA,CAS號(hào):2503-13-1,純度≥99.0%)、恩鐮孢菌素A1(ENA1,CAS號(hào):4530-21-6,純度≥99.9%)、恩鐮孢菌素B(ENB,CAS號(hào):917-13-5,純度≥99.0%)、恩鐮孢菌素B1(ENB1,CAS號(hào):19914-20-6,純度≥99.5%)、白僵菌素(BEA,CAS號(hào):26048-05-5,純度≥99.2%)、細(xì)胞松弛素B(CB,CAS號(hào):14930-96-2,純度≥99.0%)、細(xì)胞松弛素C(CC,CAS號(hào):22144-76-9,純度≥99.2%)、細(xì)胞松弛素D(CD,CAS號(hào):22144-77-0,純度≥98.5%)、細(xì)胞松弛素E(CE,CAS號(hào):36011-19-5,純度≥99.2%)、細(xì)胞松弛素H(CH,CAS號(hào):53760-19-3,純度≥99.2%)、細(xì)胞松弛素J(CJ,CAS號(hào):53760-20-6,純度≥99.5%)、二乙酰鐮刀菌烯醇(CAS號(hào):2270-40-8,DAS,純度≥99.0%)、新茄病鐮刀菌烯醇(NEO,CAS號(hào):36519-25-2,純度≥99.3%)、T-2毒素(T-2,CAS號(hào):21259-20-1,純度≥98.2%)、HT-2毒素(HT-2,CAS號(hào):26934-87-2,純度≥99.0%)、黃曲霉毒素B1(AFB1,CAS號(hào):1162-65-8,純度≥99.0%)、黃曲霉毒素B2(AFB2,CAS號(hào):7220-81-7,純度≥99.9%)、黃曲霉毒素M1(CAS號(hào):6795-23-9,純度≥99.9%)、黃曲霉毒素M2(CAS號(hào):6885-57-0,純度≥99.2%)、赭曲霉毒素A(OTA,CAS號(hào):303-47-9,純度≥99.0%)、赭曲霉毒素B(OTB,CAS號(hào):4825-86-9,純度≥99.0%)、赭曲霉毒素C(OTC,CAS號(hào):4865-85-4,純度≥99.0%)購(gòu)自澳大利亞Romer公司,純度均在97%以上。3種同位素內(nèi)標(biāo):13C17-黃曲霉毒素B1(13C17-AFB1,CAS號(hào):1217449-45-0,純度≥99.5%)、13C20-赭曲霉毒素A(13C20-OTA,CAS號(hào):911392-42-2,純度≥99.5%)、13C15-瓜萎鐮菌醇(13C15-NIV,CAS號(hào):911392-40-0,純度≥99.5%),購(gòu)于美國(guó)Romer Labs公司。

甲醇、乙腈、甲酸、乙酸(色譜純,美國(guó)Thermo Fisher公司);乙酸銨(色譜純,德國(guó)西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司);超純水(由Milli-Q超純水機(jī)制備(英國(guó)ELGA公司));氯化鈉(分析純,美國(guó)Agilent公司);尼龍濾膜(0.22 μm,美國(guó)Waters公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:向真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品中加入適量甲醇,充分溶解得到真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于-20 ℃冰箱避光封口保存,12個(gè)月內(nèi)用完。標(biāo)準(zhǔn)工作液:分別精密移取適量22種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋定容,配制成質(zhì)量濃度為1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,渦旋混勻后置于棕色試劑瓶?jī)?nèi),于-20 ℃冰箱避光封口保存。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要,用甲醇配制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液:向同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品中加入適量甲醇,充分溶解得到內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液,于-20 ℃冰箱避光封口保存,12個(gè)月內(nèi)用完。內(nèi)標(biāo)使用液:分別精密移取適量3種同位素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液于容量瓶中,用甲醇稀釋定容至刻度,配成質(zhì)量濃度為200 μg/L的同位素內(nèi)標(biāo)使用液,于-20 ℃冰箱避光封口保存,3個(gè)月內(nèi)用完。

1.3 樣品前處理

稱取均勻試樣2.0 g,置于15 mL離心管中,加入10 μL內(nèi)標(biāo)使用液和4 mL 0.5%甲酸乙腈溶液,渦旋1 min,超聲提取10 min,加入1 g氯化鈉,渦旋2 min,在4 ℃條件下10 000 r/min離心10 min,準(zhǔn)確移取2 mL上清液于氮吹管中,于40 ℃水浴中氮吹至干,加入1 mL 50%甲醇水溶液復(fù)溶,渦旋1 min,過(guò)0.22 μm濾膜,供液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜系統(tǒng)分析。

1.4 分析條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm,美國(guó)Agilent公司);柱溫:35 ℃;流動(dòng)相A為含10 mmol/L乙酸銨的0.1%乙酸水溶液,流動(dòng)相B為0.1%乙酸甲醇溶液;流速0.30 mL/min;進(jìn)樣量5.0 μL。梯度洗脫條件如表1。

表1 梯度洗脫程序

1.4.2質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI),正離子模式;離子源溫度320 ℃;鞘氣流速40 arb;輔助氣流速10 arb;噴霧電壓3.2 kV,毛細(xì)管溫度320 ℃。掃描模式為數(shù)據(jù)依賴型二級(jí)掃描模式。全掃描模式的分辨率為70 000半峰全寬(FWHM),掃描范圍為m/z100～1 000,C-trap的自動(dòng)增益控制(AGC)目標(biāo)為1×106,最大注射時(shí)間(IT)為100 ms。dd-MS2的分辨率為17 500 FWHM,AGC目標(biāo)1×105,最大IT 50 ms,TopN 5,隔離窗口m/z4。22種真菌毒素及3種同位素內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜信息見(jiàn)表2。

表2 22種真菌毒素及3種同位素內(nèi)標(biāo)的化合物信息及質(zhì)譜參數(shù)

1.5 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)分別采用SPSS 22.0和Origin 2018軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

質(zhì)譜條件是影響真菌毒素前體離子和碎片離子響應(yīng)強(qiáng)度的關(guān)鍵因素。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了電離模式和歸一化碰撞能。利用液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜對(duì)22種真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行正負(fù)離子掃描,得到一級(jí)全掃描質(zhì)譜圖,發(fā)現(xiàn)部分真菌毒素在負(fù)離子模式下無(wú)響應(yīng),22種真菌毒素在正離子模式下響應(yīng)值均高于負(fù)離子模式,最終確定掃描模式為正離子模式。為了獲得最大響應(yīng)和穩(wěn)定的碎片離子,比較了真菌毒素在不同碰撞能量下的碎片離子強(qiáng)度。22種真菌毒素和3種內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間和質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1色譜柱的選擇

色譜柱的類型、填料和長(zhǎng)度是影響目標(biāo)化合物分離的重要因素之一。選擇合適的色譜柱,目標(biāo)物可以得到更好的分離,也可以提高方法的靈敏度和穩(wěn)定性。本文比較了ZORBAX Eclipse Plus C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)、Waters BEH HILIC (100 mm×2.1 mm,1.7 μm)和SUPELCO Ascentis C8(100 mm×4.6 mm,1.7 μm)3種色譜柱的分離效果。結(jié)果顯示,Waters BEH HILIC和SUPELCO Ascentis C8色譜柱無(wú)法對(duì)細(xì)胞松弛素C和細(xì)胞松弛素D這對(duì)同分異構(gòu)體進(jìn)行有效分離,而ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱則可以對(duì)這對(duì)同分異構(gòu)體進(jìn)行分離,因此采用該色譜柱分析牛奶中的22種真菌毒素。

2.2.2流動(dòng)相的選擇

流動(dòng)相、pH值、流速等都會(huì)影響目標(biāo)化合物的出峰時(shí)間和響應(yīng)強(qiáng)度。本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇和乙腈作為強(qiáng)洗脫流動(dòng)相的洗脫效果。結(jié)果表明,甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí),化合物具有更好的響應(yīng)。這有可能是因?yàn)榧状季哂匈|(zhì)子供體特性,有利于真菌毒素形成帶正電荷的分子離子加合物。乙腈的介電常數(shù)低于甲醇,因此甲醇的電荷轉(zhuǎn)移高于乙腈,電離效率更高。

由于酸性環(huán)境有利于[M+H]+的形成,有利于提高離子化效率[22,23],實(shí)驗(yàn)在流動(dòng)相中加入0.1%乙酸,發(fā)現(xiàn)使用0.1%乙酸水和0.1%乙酸甲醇進(jìn)行梯度洗脫時(shí),黃曲霉毒素類化合物有拖尾現(xiàn)象,而在水相中加入少量乙酸銨能消除這種拖尾現(xiàn)象。為了增大目標(biāo)化合物的響應(yīng)值并改善峰形,實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了不同濃度乙酸銨對(duì)目標(biāo)化合物離子化效率的影響。結(jié)果表明,10 mmol/L的乙酸銨能夠最大限度地增加目標(biāo)化合物的響應(yīng)值并改善峰形,而過(guò)高濃度的乙酸銨反而會(huì)降低目標(biāo)化合物的離子化效率[24]。所以實(shí)驗(yàn)最終選擇含10 mmol/L乙酸銨的0.1%乙酸水溶液和0.1%乙酸甲醇溶液作為流動(dòng)相。22種真菌毒素和3種同位素內(nèi)標(biāo)在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下的色譜圖如圖1所示。

2.3 前處理方法的優(yōu)化

2.3.1提取溶劑的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)[21,25]得知,提取真菌毒素常用的提取溶劑為甲醇、乙腈、甲醇-水和乙腈-水。由于牛奶中有較高含量的蛋白質(zhì)和脂肪等,在真菌毒素的提取過(guò)程中容易團(tuán)聚和乳化而影響提取效果,因此需要對(duì)牛奶進(jìn)行去除蛋白質(zhì)和脂肪的操作,以提高提取效率。本實(shí)驗(yàn)比較了甲醇、乙腈、甲醇-乙腈(1∶1,v/v)對(duì)真菌毒素提取效果的影響。結(jié)果顯示,乙腈具有更好的提取效果,因?yàn)橐译嬗泻芎玫某恋淼鞍踪|(zhì)的作用。在提取溶劑中加入一定量的酸性物質(zhì)可以改善真菌毒素的提取效率,本實(shí)驗(yàn)比較了不同體積分?jǐn)?shù)(0、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%和6.0%)的甲酸乙腈溶液的提取效率,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。在加入酸性物質(zhì)后,真菌毒素的提取效果得到改善,但是過(guò)高的酸性比例會(huì)降低提取效率,綜合考慮確定0.5%甲酸乙腈作為提取溶劑。

2.3.2提取溶劑體積的選擇

本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了提取溶劑體積為2、4、8 mL時(shí)22種真菌毒素的回收率情況(見(jiàn)圖3)。大部分真菌毒素回收率隨著提取溶劑體積的增加而提高,但回收率不會(huì)隨著提取溶劑用量增加持續(xù)提高。部分目標(biāo)物如ENB、OTA、OTB、OTC隨著提取溶劑體積的增加回收率呈先增加后減小的趨勢(shì),這可能由于提取溶劑體積增加,提取到的雜質(zhì)也隨之增加,干擾目標(biāo)物檢測(cè)。而且實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步提高溶劑使用量,氯化鈉鹽析和高速離心無(wú)法實(shí)現(xiàn)水相和有機(jī)相分層,不利于目標(biāo)化合物的析出。因此,最終提取溶劑體積選擇4 mL。

圖3 不同提取溶劑體積下22種真菌毒素的回收率(n=6)

2.3.3提取鹽的選擇

牛奶中真菌毒素的提取屬于液液萃取,加入一定量的鹽對(duì)于真菌毒素提取有十分重要的作用。本文考察了氯化鈉和無(wú)水硫酸鎂對(duì)回收率的影響,由圖4可知,在牛奶提取過(guò)程中加入氯化鈉,22種真菌毒素的回收率較好。氯化鈉在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的鹽析作用有利于真菌毒素從牛奶中析出,離心過(guò)后有機(jī)相和水相分層,目標(biāo)化合物進(jìn)入有機(jī)相,故加入氯化鈉有利于提高回收率。在含水的牛奶樣品中加入無(wú)水硫酸鎂,無(wú)水硫酸鎂吸水后放熱,牛奶蛋白質(zhì)變質(zhì)結(jié)塊,吸附部分目標(biāo)化合物,導(dǎo)致部分目標(biāo)化合物回收率降低。故本實(shí)驗(yàn)選擇加入氯化鈉。

圖4 采用不同提取鹽時(shí)22種真菌毒素的回收率(n=6)

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

樣品提取凈化后,可能會(huì)有一些共同提取物對(duì)真菌毒素的離子化效率產(chǎn)生影響,造成目標(biāo)物的信號(hào)響應(yīng)增強(qiáng)或抑制的現(xiàn)象稱為基質(zhì)效應(yīng)(ME)?；|(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)或基質(zhì)抑制效應(yīng)可能會(huì)造成假陽(yáng)性或者假陰性的結(jié)果,因此本文對(duì)方法的基質(zhì)效應(yīng)做了初步考察。實(shí)驗(yàn)選取陰性樣品,按照1.3節(jié)進(jìn)行提取凈化,獲得空白基質(zhì)提取液。用空白基質(zhì)提取液和甲醇分別配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,得到基質(zhì)匹配校準(zhǔn)溶液和溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液,同法分析。根據(jù)ME=(基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線斜率-溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率)/(溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率)×100%計(jì)算。當(dāng)ME為-20%～20%時(shí)為弱基質(zhì)效應(yīng),ME為-50%～-20%或20%～50%時(shí)為中等基質(zhì)效應(yīng),當(dāng)ME≤-50%或≥50%時(shí)為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)[26]。結(jié)果表明,在實(shí)驗(yàn)條件下空白基質(zhì)中22種真菌毒素的基質(zhì)效應(yīng)絕對(duì)值<20%(見(jiàn)圖5),說(shuō)明牛奶中22種真菌毒素在本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中基質(zhì)效應(yīng)較弱。因此本方法采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性回歸擬合。

2.5 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.5.1線性范圍與檢出限

對(duì)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析,以化合物的峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度之比為橫坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸擬合,得到線性方程和相關(guān)系數(shù)(R2)。結(jié)果表明,22種真菌毒素在0.5～100.0 μg/L范圍內(nèi)線性良好,相關(guān)系數(shù)均大于0.999。在空白牛奶樣品中添加適量標(biāo)準(zhǔn)品,以樣品中目標(biāo)化合物信噪比為3和10時(shí)的含量分別為22種真菌毒素的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),分別為0.3～0.5 μg/kg和1.0～1.5 μg/kg(見(jiàn)表3),低于GB 2761-2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》[27]中規(guī)定的指標(biāo),說(shuō)明該方法可滿足牛奶中真菌毒素的檢測(cè)要求。

表3 22種真菌毒素的線性范圍、檢出限、定量限及3個(gè)加標(biāo)水平下的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.5.2回收率與精密度

在空白牛奶樣品中添加低、中、高3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,添加量分別為1.5、5.0和15 μg/kg,每個(gè)水平做6個(gè)平行樣。按照優(yōu)化的前處理?xiàng)l件進(jìn)行真菌毒素的提取和凈化。根據(jù)加標(biāo)濃度和實(shí)際測(cè)得濃度計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果如表3所示,22種真菌毒素的加標(biāo)回收率為84.7%～100.8%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%～9.9%,說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和穩(wěn)定性好,符合要求。

2.6 實(shí)際樣品的檢測(cè)

購(gòu)買來(lái)自不同國(guó)家和地區(qū)的市售牛奶25份,用本實(shí)驗(yàn)建立的方法檢測(cè),實(shí)驗(yàn)采用已確證的陰性樣品加標(biāo),同步進(jìn)行前處理和分析,作為實(shí)驗(yàn)過(guò)程的質(zhì)量控制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,實(shí)際樣品中均未檢出22種真菌毒素。

3 結(jié)論

本研究建立了牛奶中22種真菌毒素的液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜快速篩查方法及精準(zhǔn)定量檢測(cè)方法。目標(biāo)物經(jīng)酸化乙腈提取后,通過(guò)簡(jiǎn)單的低溫高速離心達(dá)到凈化目的。利用一級(jí)全掃描和dd-MS2質(zhì)譜掃描模式,對(duì)22種真菌毒素進(jìn)行了定性定量分析。該方法為開(kāi)展新興毒素毒性評(píng)價(jià)、檢測(cè)技術(shù)研發(fā)和污染水平調(diào)查提供技術(shù)支持,并為提出符合國(guó)情的真菌毒素污染控制措施以及食品中新污染物的防控提供依據(jù)。