祛風(fēng)明目丸對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎大鼠NLRP3、ASC、IL-1β 表達(dá)的影響

劉溪源，喻京生*

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007

全球范圍內(nèi)常見(jiàn)的一類高致盲眼病——葡萄膜炎，發(fā)病率為17/10 萬(wàn)～52/10 萬(wàn)，致盲率較高，發(fā)病率逐年上升[1]。 常見(jiàn)病因包括感染與非感染因素，其中，非感染因素包括自身免疫反應(yīng)、創(chuàng)傷及理化、氧化損傷、炎癥因子釋放、遺傳因素等，臨床大多以自身免疫反應(yīng)多見(jiàn)[2-5]。 葡萄膜炎的治則主要為散大瞳孔防止粘連、抗炎及消除致病因素，目前，臨床常采用中西醫(yī)結(jié)合療法防治葡萄膜炎，具有較好療效。中醫(yī)藥雖有確切療效，但對(duì)具體的治療機(jī)制缺乏詳細(xì)闡述。 本研究團(tuán)隊(duì)的前期研究發(fā)現(xiàn)，祛風(fēng)明目丸能夠通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)機(jī)體自身免疫機(jī)制，減輕實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎（experimental autoimmune uveitis, EAU）大鼠的炎癥反應(yīng)[6-9]；有研究證實(shí)，祛風(fēng)明目丸治療EAU 大鼠是通過(guò)上調(diào)視網(wǎng)膜組織中Bcl-2 的表達(dá)，并抑制Bax、Caspase-3，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡途徑而發(fā)揮療效[10]。 本研究擬通過(guò)觀察EAU 動(dòng)物模型中房水及視網(wǎng)膜組織中NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3, NLRP3）、蛋白凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis related spot like protein, ASC）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）的動(dòng)態(tài)變化情況，從細(xì)胞凋亡途徑，深入研究祛風(fēng)明目丸治療EAU 的效果與機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 70 只純系健康雄性Lewis 大鼠（SPF 級(jí)），4～6 周齡，大鼠體質(zhì)量180～220 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2021-0006]。 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，對(duì)70只大鼠雙眼進(jìn)行常規(guī)檢查以排除眼部病變及全身疾病，剔除患鼠，后進(jìn)行為期1 周的喂養(yǎng)使其適應(yīng)環(huán)境。 實(shí)驗(yàn)室為SPF 級(jí)，實(shí)驗(yàn)室環(huán)境保障：維持室溫（24±2） ℃、相對(duì)濕度50%～60%、通風(fēng)情況良好。 所有大鼠均予以常規(guī)飼料及動(dòng)物飲用水喂養(yǎng)。 本實(shí)驗(yàn)研究方案及過(guò)程均嚴(yán)格遵守湖南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理辦法，并按相關(guān)倫理要求執(zhí)行（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批號(hào)：ZYFY20211104-05）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 祛風(fēng)明目丸由熟地黃、當(dāng)歸、川芎、柴胡、魚腥草、黃芩、菊花、防風(fēng)、車前子、白芍、丹參構(gòu)成，每瓶120 g，于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院（批號(hào)：20220304）購(gòu)進(jìn)。需要時(shí)用粉碎機(jī)將藥丸打粉，用蒸餾水溶散成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100 mg/mL 的懸濁液。

1.1.3 主要試劑 光感受器間維生素A 結(jié)合蛋白（interphotoreceptor retinoid-binding protein, IRBP 1177-1191)、結(jié)核菌素（tuberculin, TB）（上海生工生物工程股份有限公司，批號(hào)：P25801-22070401、24761）；完全弗氏佐劑（complete Freund's adjuvant, CFA）（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)：SLCJ4384）；PBS 緩沖液（普諾賽公司，批號(hào)：WH0021A061）；ASC 抗體、NLRP3 抗體、β-actin 抗體、羊抗兔IgG-HRP（Affinity 公司，批號(hào)：DF6034、DF7438、T0021、BL003A）；大鼠隱熱蛋白3（NLRP3）ELISA 檢測(cè)試劑盒、大鼠白細(xì)胞介素1β（IL-1β）ELISA 檢測(cè)試劑盒（廈門侖昌碩生物科技有限公司，批號(hào)：YD-34924、YD-30206）。

1.1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器 酶標(biāo)分析儀（美國(guó)Rayto 公司，型號(hào)：RaytoRT-6100）；電泳儀（北京百晶生物技術(shù)有限公司，型號(hào)：BG-subMIDI）；電熱恒溫水浴槽（上海一恒恒溫設(shè)備廠，型號(hào)：HWS-24）；PVDF 膜（美國(guó)Millipore 公司，型號(hào)：ISEQ00010）；低溫離心機(jī)（德國(guó)Sigma 公司，型號(hào)：3-30k）；脫色搖床（海門其林貝爾儀器制造公司，型號(hào)：TS-100）；凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)UVP 公司，型號(hào)：GelDoc-It310）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（中國(guó)CLINX 勤翔，型號(hào)：chemiScope6100）；全自動(dòng)洗板機(jī)（雷杜生命科技有限公司，型號(hào)：RT-3100C）；酶標(biāo)檢測(cè)儀（Bio TeK，型號(hào)：Epoch）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，型號(hào)：D3024R）。

1.2 造模方法

1.2.1 試劑準(zhǔn)備 根據(jù)造模需求，對(duì)IRBP1177-1191和TB 分別進(jìn)行精確稱量：100 μg/只；將CFA（150 μL/只）和PBS 緩沖液(150 μL/只）準(zhǔn)確地加入并充分混合到5 mL EP 管中，直至乳糜狀(滴入水中成團(tuán)狀不散開(kāi)）。

1.2.2 造模 根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法取19 只Lewis 大鼠為空白組，剩余51 只為造模組，參照文獻(xiàn)方法[11-13]：在造模組大鼠后腿內(nèi)兩足底皮下注射混合好的乳糜液，每只100 μL，建立大鼠EAU 模型；空白組大鼠注射等量不含IRBP 的乳糜液于相同部位。連續(xù)4 d每天重復(fù)以上操作1 次，共對(duì)51 只大鼠進(jìn)行動(dòng)物模型制作。

1.2.3 模型驗(yàn)證 每天同時(shí)段，使用便攜式手持裂隙燈，觀察各組大鼠眼部表現(xiàn)變化，當(dāng)Lewis 大鼠出現(xiàn)睫狀血管充血明顯，角結(jié)膜水腫，前房滲出，虹膜血管擴(kuò)張、紋理消失，對(duì)光反射遲鈍或消失、瞳孔粘連或膜閉等眼前節(jié)炎癥表現(xiàn)，則說(shuō)明EAU 模型成功建立。 參照表1 Caspi 0～4 分的標(biāo)準(zhǔn)[13]，對(duì)大鼠眼前節(jié)表現(xiàn)進(jìn)行炎癥評(píng)分。 造模后第7 天，從空白組和造模組大鼠中各隨機(jī)抽取3 只處死，取眼球組織制作病理切片，HE 染色后進(jìn)行組織病理學(xué)檢查并進(jìn)行炎癥評(píng)分。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)

HE 染色后，依照隨機(jī)數(shù)字表法，將造模成功的48 只大鼠分為3 組：模型組、祛風(fēng)明目丸正常劑量組（簡(jiǎn)稱正常劑量組）和祛風(fēng)明目丸低劑量組（簡(jiǎn)稱低劑量組），每組16 只，未注射IRBP乳糜液的16 只為空白組。

于造模后第7 天開(kāi)始灌胃。 將提純的藥物按照人-動(dòng)物體表面積等效劑量比值表[14]計(jì)算得出的結(jié)果給藥。根據(jù)計(jì)算得出正常劑量組及低劑量組分別予以祛風(fēng)明目丸藥液4、2 g/（kg·d）灌胃，使用大鼠專用灌胃針頭，連續(xù)14 d 灌胃給藥；另兩組均予以等容量蒸餾水，每天1 次灌胃處理。干預(yù)14 d 后，在顯微操作下取眼球、房水及視網(wǎng)膜組織，進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

1.4 觀察指標(biāo)和方法

1.4.1 EAU 大鼠眼前節(jié)改變觀察 自造模開(kāi)始后每天于同時(shí)段，采用Caspi 臨床分級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，使用便攜式手持裂隙燈顯微鏡觀察各組大鼠的眼前節(jié)體征變化，進(jìn)行評(píng)分并記錄。

1.4.2 組織病理學(xué)檢查 自造模后第7 天隨機(jī)抽取6 只大鼠處死（空白組和造模組大鼠中各3 只），腹腔注射麻醉后，靜待大鼠逃避等運(yùn)動(dòng)反射消失，將大鼠眼球摘除，放入1.5 mL 離心管中，浸泡于4%多聚甲醛中性緩沖液中固定24 h 后去除多余組織，脫水浸蠟，包埋，予以HE 染色。 顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照，對(duì)病理切片進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.4.3 ELISA 檢測(cè)房水中NLRP3、IL-1β 水平 給藥14 d 后，大鼠予以10%水合氯醛經(jīng)腹腔麻醉，在手術(shù)顯微鏡下將針頭輕輕刺入前房，房水自動(dòng)吸入毛細(xì)管中，收集房水于無(wú)菌EP 管中，立即轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱冷凍保存。 參照ELISA 試劑盒說(shuō)明書的要求，對(duì)獲得的房水標(biāo)本，進(jìn)行規(guī)范操作，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組大鼠房水中NLRP3、IL-1β 表達(dá)水平。

1.4.4 Western blot 檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中ASC、NLRP3蛋白水平 大鼠取出房水后，隨即充分暴露大鼠眼球，將周圍結(jié)締組織分離后剪斷視神經(jīng)，取出眼球。參考MCMENAMIN 的方法[15]，在顯微鏡下使用顯微剪沿角鞏膜緣剪開(kāi)，并仔細(xì)分離其他組織。 將剝離的視網(wǎng)膜組織小心地放入1.5 mL 離心管中，并立即存放至-80 ℃冰箱。 檢驗(yàn)時(shí)， 加入適量液氮與PBS后離心提取蛋白質(zhì)，制備BCA 工作液，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，加入相應(yīng)體積的總蛋白樣品與5×蛋白質(zhì)凝膠電泳上樣緩沖液混合， 進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，后在PVDF 膜上轉(zhuǎn)印；依次加入兔抗鼠NLRP3（1∶500）、ASC（1∶500）、β-actin（1∶1 000）一抗4 ℃反應(yīng)過(guò)夜孵育，洗膜后將羊抗兔IgG-HRP 二抗用1×TBST 稀釋1 500 倍，室溫、避光環(huán)境中緩慢搖動(dòng)60 min 后洗膜，按1∶1（V/V）混合ECL 試劑盒中兩種液體后，均勻鋪在PVDF 膜表面4 min，隨后抖除膜上液體，放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中成像，對(duì)蛋白條帶行灰度分析，蛋白相對(duì)表達(dá)量用目的蛋白與β-actin 灰度值比值表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 EAU 大鼠眼前節(jié)變化

造模后連續(xù)使用手持裂隙燈觀察大鼠眼前節(jié)變化，造模第1 天：大鼠眼前節(jié)無(wú)明顯炎癥反應(yīng)，眼部情況基本如圖1A；造模第3 天：觀察到炎癥反應(yīng)，睫狀充血，虹膜血管輕度擴(kuò)張，48 只大鼠如圖1B，2 只大鼠如圖1A，1 只出現(xiàn)圖1C；造模第5 天：觀察到葡萄膜炎反應(yīng)，多數(shù)大鼠睫狀充血明顯，虹膜血管中度擴(kuò)張、迂曲，部分出現(xiàn)前房輕度混濁，瞳孔欠圓，對(duì)光反射稍遲鈍，眼底紅光反射減弱，29 只大鼠如圖1C，22 只如圖1B；造模第7 天：多數(shù)體征同前，部分大鼠出現(xiàn)前房積膿、瞳孔膜閉，視網(wǎng)膜紅光反射減弱或消失，46 只大鼠如圖1C，4 只如圖1D。

圖1 造模后不同時(shí)間大鼠眼前節(jié)表現(xiàn)對(duì)比

自造模第3 天起，造模組評(píng)分均明顯高于空白組（P＜0.01），說(shuō)明EAU 大鼠模型制備成功。 詳見(jiàn)表2。

表2 造模后不同時(shí)間Caspi 臨床分級(jí)評(píng)分比較（±s，分）

表2 造模后不同時(shí)間Caspi 臨床分級(jí)評(píng)分比較（±s，分）

注：與空白組相比，*P＜0.01。

組別空白組造模組n 19 51第3 天0.01±0.11 0.74±0.34*第5 天0.05±0.16 1.54±0.71*第7 天0.10±0.20 2.71±0.64*

2.2 組織病理學(xué)檢查

造模后第7 天，空白組可見(jiàn)視網(wǎng)膜各層組織結(jié)構(gòu)清晰完整；造模組可見(jiàn)視網(wǎng)膜的視細(xì)胞層、雙極細(xì)胞層等有炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，血管擴(kuò)張，且組織結(jié)構(gòu)較空白組欠清晰。 詳見(jiàn)圖2。

造模第7 天，裂隙燈顯微鏡下觀察大鼠眼前節(jié)改變，可見(jiàn)大部分大鼠房水中度混濁，少數(shù)大鼠前房重度混濁，瞳孔膜閉，視網(wǎng)膜紅光反射消失。 炎癥評(píng)分為（2.71±0.64）分，HE 染色顯示，免疫后第7 天造模組大鼠視網(wǎng)膜多層出現(xiàn)不同程度的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。 以上表明，免疫后第7 天，EAU 大鼠模型建立成功。

2.3 祛風(fēng)明目丸對(duì)房水中NLRP3、IL-1β 水平的影響

與空白組對(duì)比，模型組房水中NLRP3 及IL-1β水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，給藥14 d后，正常劑量組及低劑量組房水中NLRP3 與IL-1β含量均降低（P＜0.05）；正常劑量組與低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 詳見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠給藥后14 d 房水中NLRP3、IL-1β水平比較（±s，ng/mL）

注：與空白組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05。

組別空白組模型組正常劑量組低劑量組n 16 16 16 16 NLRP3 10.34±1.51 17.86±2.30*14.13±2.07#13.93±1.38#IL-1β 13.31±3.12 27.66±3.56*20.90±3.48#22.28±3.60#

2.4 祛風(fēng)明目丸對(duì)視網(wǎng)膜組織中ASC、NLRP3 蛋白水平的影響

與空白組相比，模型組視網(wǎng)膜組織中ASC、NLRP3 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，給藥14 d 后，正常劑量組及低劑量組視網(wǎng)膜組織中ASC、NLRP3 蛋白表達(dá)含量均下降（P＜0.05）；與正常劑量組相比，低劑量組視網(wǎng)膜組織ASC、NLRP3蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。 見(jiàn)表4、圖3。

圖3 祛風(fēng)明目丸對(duì)視網(wǎng)膜中ASC、NLRP3 蛋白水平影響（±s，n=16）

表4 各組大鼠給藥后14 d 視網(wǎng)膜中ASC、NLRP3蛋白水平比較（±s）

表4 各組大鼠給藥后14 d 視網(wǎng)膜中ASC、NLRP3蛋白水平比較（±s）

注：與空白組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05；與正常劑量組相比，+P＜0.05

組別空白組模型組正常劑量組低劑量組n 16 16 16 16 ASC 0.32±0.02 0.68±0.02*0.53±0.01#0.61±0.01#+NLRP3 0.32±0.01 0.69±0.01*0.53±0.01#0.63±0.01#+

3 討論

葡萄膜炎在臨床上的治療較為棘手，近幾年針對(duì)葡萄膜炎的中西醫(yī)結(jié)合治療手段較多。 臨床研究表明，配合中醫(yī)治療能減輕治療藥物帶來(lái)的毒副作用，臨床療效良好，運(yùn)用中醫(yī)藥辨證施治及多靶點(diǎn)整體調(diào)節(jié)的特點(diǎn)既能保證療效，又能降低疾病復(fù)發(fā)率[16-18]，但是具體的治療機(jī)制缺乏詳細(xì)闡述。 葡萄膜炎屬于中醫(yī)學(xué)“瞳神緊小”范疇，歷代醫(yī)家多將其發(fā)病歸于肝膽的風(fēng)熱、濕熱[19]。祛風(fēng)明目丸是喻京生教授根據(jù)“除風(fēng)益損湯”加減所制的中成藥，臨床中多因風(fēng)熱上擾，氣血受損導(dǎo)致本病，治以祛風(fēng)清熱、養(yǎng)血活血，常用熟地黃、當(dāng)歸、柴胡、菊花、防風(fēng)、魚腥草等中藥。 葉天士言：“目盲無(wú)所見(jiàn)，在肝經(jīng)之風(fēng)也?！辈窈?、當(dāng)歸、菊花等藥物均入肝經(jīng)，上連目系，肝氣通于目，柴胡退六經(jīng)邪熱往來(lái)，與黃芩一升一降，防風(fēng)治風(fēng)通用、除上焦風(fēng)邪，入肝，甘溫發(fā)散；配合菊花、魚腥草祛風(fēng)清熱。 瞳神之處脈絡(luò)較多，虛火上炎損傷脈絡(luò)，故配伍熟地黃、當(dāng)歸、白芍等藥養(yǎng)血活血。現(xiàn)代藥理研究表明，柴胡、菊花、黃芩具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌作用，熟地黃、川芎、魚腥草此類中藥還具有雙向免疫調(diào)節(jié)功效[20-21]。

大部分EAU 與自身免疫性應(yīng)答關(guān)系密切[22-23]，其發(fā)病與體內(nèi)免疫系統(tǒng)的激活及多種細(xì)胞因子及信號(hào)通路的異常表達(dá)致細(xì)胞凋亡關(guān)系密切[24-26]。 活性氧（reactive oxygen species, ROS）的產(chǎn)生與清除平衡維持著機(jī)體正常的生理功能，且作為信號(hào)分子參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路和免疫應(yīng)答[27]。 ROSNLRP3 通路作為誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的一條重要通路，當(dāng)ROS 水平升高時(shí)，與硫氧還蛋白互作蛋白（thioredoxin interacting protein, TXNIP）發(fā)生反應(yīng)，NLRP3炎癥小體被激活[28]。 在ROS 的誘導(dǎo)下，TXNIP 與核心蛋白NLRP3 結(jié)合，結(jié)合后可引起內(nèi)皮細(xì)胞炎癥小體受激活化，再激活Toll 樣受體通道，引起一系列炎癥反應(yīng)發(fā)生。

NLRP3 炎癥小體是一種多蛋白復(fù)合體，具有高度保守性，包括核心蛋白NLRP3、效應(yīng)蛋白pro-Caspase-1 以及接頭蛋白ASC，是固有免疫系統(tǒng)的一大重要組成部分，屬于模式識(shí)別受體，IL-1β、IL-18 為其下游炎癥小體[29-30]。 核心蛋白NLRP3 響應(yīng)微生物感染和細(xì)胞損傷后，介導(dǎo)Caspase-1 的激活及促炎因子IL-1β、IL-18 的分泌。有研究表明，免疫性葡萄膜炎（autoimmune uveith, AU）的發(fā)生發(fā)展與NL RP3 炎癥小體密不可分，部分AU 患者的外周靜脈血有NLRP3 的表達(dá)[31]。 另外，研究發(fā)現(xiàn)使小鼠體內(nèi)的NLRP3 基因突變后，小鼠自身炎癥反應(yīng)明顯減弱[32]。上述研究均證實(shí)，ROS-NLRP3 通路可引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)。

目前，公認(rèn)的研究人類AU 發(fā)病機(jī)制及藥物治療的動(dòng)物模型為使用視網(wǎng)膜蛋白IRBP 誘導(dǎo)Lewis大鼠EAU 模型[33]。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建EAU 大鼠模型發(fā)現(xiàn)，造模第7 天，結(jié)合裂隙燈觀察到的大鼠眼部體征與眼球HE 染色結(jié)果，提示造模成功。模型組大鼠房水中IL-1β 與NLRP3、視網(wǎng)膜組織中NLRP3與ASC 的表達(dá)均較空白組大鼠增加，經(jīng)祛風(fēng)明目丸治療后，通過(guò)手持裂隙燈觀察大鼠眼前節(jié)炎癥變化，以及檢測(cè)房水和視網(wǎng)膜中ROS 通路相關(guān)蛋白的表達(dá)量，均證實(shí)祛風(fēng)明目丸的治療發(fā)揮了一定療效。 本病的消退與IL-1β 及NLRP3 兩者的表達(dá)相關(guān)，通過(guò)影響IL-1β 及NLRP3 的平衡，使促炎因子與抑炎因子兩者之間的平衡失調(diào)。 與空白組相比，模型組NLRP3、ASC、IL-1β 表達(dá)增加（P＜0.05），正常劑量組與低劑量組同模型組相比，表達(dá)均減少（P＜0.05）。正常劑量組及低劑量組均可有效減輕EAU 大鼠葡萄膜炎的炎癥表現(xiàn)。

綜上，本研究結(jié)果顯示，祛風(fēng)明目丸可通過(guò)多種途徑在EAU 的治療中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。經(jīng)祛風(fēng)明目丸干預(yù)后，EAU 大鼠房水中NLRP3、IL-1β 水平及視網(wǎng)膜組織中ASC、NLRP3 蛋白水平降低，這表明祛風(fēng)明目丸可能是通過(guò)下調(diào)ROS、ASC 的表達(dá)，抑制NLRP3 炎性小體的激活，然后抑制炎癥因子如IL-1β 的分泌，進(jìn)而發(fā)揮治療葡萄膜炎的作用。但是本研究?jī)H證實(shí)祛風(fēng)明目丸對(duì)EAU 大鼠ROS 信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響，但ROS 信號(hào)通路相關(guān)蛋白復(fù)雜多樣，且實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中未加入任何一種蛋白的有關(guān)抑制劑或激動(dòng)劑，不能完全證實(shí)祛風(fēng)明目丸是完全針對(duì)ROS 信號(hào)通路而發(fā)揮具體的作用，且ROS/NLRP3通路還涉及如細(xì)胞焦亡、線粒體自噬等多個(gè)機(jī)制，還需進(jìn)行更深層次的研究，為本項(xiàng)目組開(kāi)展進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)提供思路。