桃紅四物湯抗纖維化作用及機制的研究進展

喻玉林，文 尚，張敏軼，張 璋，謝 輝*，郭錦材*

1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.長沙市口腔醫(yī)院，湖南 長沙 410006

纖維化是以細胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）過度沉積為特征的慢性病理性過程，可發(fā)生在各種器官和組織中，以肝、腎、肺、心肌、黏膜最為常見[1]。 纖維化的持續(xù)發(fā)展可致器官功能障礙甚至衰竭，嚴重危及人類生命健康，而其發(fā)病機制復雜，且目前無特異性治療藥物[2]。 因此，尋找高效、不良反應小的藥物治療纖維化疾病成為研究的熱點。

桃紅四物湯(Taohong Siwu Decoction, THSWD)是由桃仁、紅花、當歸、川芎、熟地黃、白芍組成的中藥復方，現(xiàn)代藥理學研究顯示THSWD 具有抗炎、抗氧化等作用[3]。 近年，從臨床回顧、體內(nèi)和體外實驗等多方面展開了對THSWD 的研究，發(fā)現(xiàn)其具有抗心肌纖維化、抗肝纖維化、抗肺纖維化、抗口腔黏膜下纖維化的作用[4-6]。本文就THSWD 抗纖維化作用及機制進行綜述，為臨床纖維化疾病治療提供新思路。

1 THSWD 抗纖維化作用的臨床研究

臨床研究發(fā)現(xiàn)，由慢性疾病引發(fā)器官（組織）纖維化的患者經(jīng)THSWD 治療后，可改善纖維化指標及器官（組織）功能。 王舜[7]以干擾素注射為對照組，在對照組的基礎(chǔ)上聯(lián)合THSWD 治療慢性乙型肝炎肝纖維化患者，連續(xù)治療6 個月后，檢測兩組治療的臨床療效、肝纖維化指標和肝功能指標，發(fā)現(xiàn)THSWD組臨床總有效率達94.64%，明顯高于對照組的66.07%，同時THSWD 組肝纖維化指標透明質(zhì)酸（hyaluronic acid,HA）、Ⅲ型前膠原蛋白（procollagen type Ⅲprotein, PC-Ⅲ）、層粘連蛋白（laminin, LN）及Ⅳ型膠原蛋白（ⅣCollagen, Col-Ⅳ）水平降低，肝功能指標谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶水平，較干擾素治療組明顯下調(diào)。說明THSWD 能提高肝纖維化臨床療效，降低肝纖維化指標，改善肝纖維化程度。

孫燕[8]在收治的102 例口腔黏膜下纖維化患者中發(fā)現(xiàn)，常規(guī)用西藥醋酸潑尼松龍和利多卡因混懸液注射治療，患者發(fā)生毒副反應大，易出現(xiàn)一系列不良反應。而在西藥組基礎(chǔ)上用THSWD 對癥治療，毒副反應發(fā)生率僅為1.09%，明顯低于西藥組的15.67%。同時THSWD 組患者張口度、口腔黏膜質(zhì)地及顏色均得到改善，臨床總有效率達82.35%，明顯高于西藥組的45.10%。

纖維化是各種器官慢性疾病的結(jié)局，因此，通過抑制慢性疾病進展，可能逆轉(zhuǎn)纖維化。而THSWD 被證實可延緩慢性心力衰竭及慢性腎臟疾病進展[9-10]。王銀莊等[11]在THSWD 化裁治療慢性心力衰竭臨床研究中發(fā)現(xiàn)，常規(guī)強心、利尿基礎(chǔ)治療，僅改善心衰臨床癥狀，對患者的疾病形成基礎(chǔ)尚無顯著療效。而采用THSWD 聯(lián)合基礎(chǔ)治療，患者心功能指標、血清學指標改善；同時，患者血清中促纖維化因子基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix met-alloproteinase-9, MMP-9）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）水平降低，具有良好的臨床療效。楊俊等[12]采用氫氯噻嗪聯(lián)合THSWD、五苓散加減治療慢性腎衰竭，兩個療程后，患者腎功能改善，炎癥因子水平減少，且未出現(xiàn)嚴重的不良反應。

綜上表明，THSWD 治療纖維化疾病能提高臨床療效，減少不良反應發(fā)生，改善相關(guān)纖維化指標及臟器功能指標，具有較好的抗纖維化作用，并能延緩疾病進程，抑制或逆轉(zhuǎn)纖維化。

2 THSWD 抗纖維化作用的實驗研究

2.1 THSWD 在肝纖維化模型中的作用

肝纖維化是慢性或反復性肝損傷演變的病理結(jié)果，最終可導致肝硬化，甚至肝細胞癌[13]。THSWD 對肝纖維化小鼠模型具有治療作用，劉旭凌等[14]發(fā)現(xiàn)CCl4誘導的肝纖維化小鼠經(jīng)THSWD 治療后，肝纖維化小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶水平降低，肝組織中炎癥面積減少，α-平滑肌肌動蛋白 （αsmooth muscle actin, α-SMA）、Ⅰ型膠原蛋白及相關(guān)基因表達下調(diào)。表明THSWD 能改善肝功能、減少肝組織中膠原水平，減緩肝纖化。 另外，邱勇[15]和王桐生等[16]研究發(fā)現(xiàn)THSWD 能降低CCl4誘導的肝纖維化鼠血清中的HA、LN、Col-Ⅳ水平，還能減少肝組織中羥脯氨酸含量以及減輕肝小葉結(jié)構(gòu)破壞程度。 表明THSWD 能改善肝纖維化指標，維護肝臟正常結(jié)構(gòu)，發(fā)揮抗肝纖維化作用。

2.2 THSWD 在肺纖維化模型中的作用

肺纖維化是慢性肺病發(fā)展到晚期的常見病理表現(xiàn)，肺組織瘢痕形成、膠原沉積是其主要病理特征，最終可引發(fā)呼吸衰竭致死[17]。 于小寒[18]研究表明THSWD 可改善肺纖維化大鼠的生存狀態(tài)，減輕肺纖維化程度。 其用博來霉素誘導建立肺纖維化大鼠模型，THSWD 進行干預后，發(fā)現(xiàn)THSWD 組大鼠肺組織病理切片中無明顯炎癥浸潤，肺泡和肺泡壁形態(tài)未見病理性改變，Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白表達下調(diào)。表明THSWD 能抑制炎癥浸潤，減輕肺組織損傷，改善肺纖維化。

2.3 THSWD 在腎纖維化模型中的作用

腎纖維化是慢性腎病發(fā)展到終末期的病理表現(xiàn)，最終可致腎衰竭[19]。 吳雪兵等[20]觀察THSWD 對牛血清白蛋白誘導的腎纖維化大鼠模型的作用，用管飼養(yǎng)法輸送THSWD 干預腎纖維化大鼠，4 周后取大鼠血清，采用酶聯(lián)免疫吸附測定血肌酐、血尿素氮水平，透射電鏡觀察腎小球系膜區(qū)增生情況，免疫熒光染色檢測Col-Ⅳ表達。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)THSWD 組大鼠血清中血肌酐、尿素氮水平降低，腎組織系膜區(qū)ECM 沉積減少，Col-Ⅳ熒光呈下調(diào)趨勢。 表明THSWD 能改善腎功能及腎纖維化指標，發(fā)揮抗腎纖維化作用。

2.4 THSWD 在心肌纖維化模型中的作用

心肌纖維化是心肌梗死等慢性心血管疾病的中心環(huán)節(jié)，心肌組織內(nèi)ECM 堆積是其主要特征，最后可致心臟功能衰竭[21]。李杏等[22]探究THSWD 對心肌梗死誘發(fā)心肌纖維化大鼠的影響，采用多普勒超聲心動圖檢測大鼠心功能、Masson 染色檢測大鼠的心肌組織改變，發(fā)現(xiàn)THSWD 處理組中，大鼠心臟射血分數(shù)上調(diào)，心肌間質(zhì)纖維化程度減輕，另外還采用免疫組織化學法檢測大鼠心肌組織中Ⅰ型膠原蛋白與Ⅲ膠原蛋白比值表達，發(fā)現(xiàn)THSWD 組大鼠心肌組織中Ⅰ型膠原蛋白與Ⅲ膠原蛋白比值表達下調(diào)。 表明THSWD 能下調(diào)心肌組織中的膠原蛋白表達，改善心功能，減輕心肌纖維化程度。

以上實驗表明THSWD 能減少各器官組織內(nèi)膠原以及ECM 沉積，改善肝、肺、腎、心肌功能，抑制纖維化發(fā)展，減輕纖維化程度。

3 THSWD 抗纖維化的作用機制

目前關(guān)于THSWD 抗纖維化作用機制尚未明確，但近年學者們進行了大量探究，具體如下。

3.1 調(diào)控TGF-β/smads 信號通路

纖維化發(fā)病機制復雜，其發(fā)生發(fā)展受多種信號通路及細胞因子調(diào)控，其中TGF-β/smads 信號通路已被證實在纖維化疾病中發(fā)揮重要的作用[23]。 TGFβ 是目前公認的參與纖維化發(fā)生及發(fā)展的重要調(diào)控因子[23]。Smads 蛋白是TGF-β 下游的信號蛋白，其分為受體激活型、 共同介質(zhì)型、 抑制型3 種， 其中smad2、smad3 屬于受體激活型，具有促纖維化作用[24]。TGF-β 激活后與受體（TGF-βRⅡ、TGF-βRⅠ）結(jié)合，形成的受體復合物使受體激活型的smad 蛋白磷酸化，磷酸化后的smad 蛋白能夠?qū)GF-β 信號從細胞外傳遞至細胞核，形成經(jīng)典的TGF-β/smads 信號通路，調(diào)控成纖維細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，誘導膠原合成，促使ECM 過度沉積，推進纖維化進程[25]。此外，TGF-β 受體還能直接激活其他細胞內(nèi)信號通路，形成非經(jīng)典的TGF-β 信號通路，如ERK、PI3K/AKT 通路，促進纖維化發(fā)生[26]。

肺組織損傷以及修復過程中釋放的中性粒細胞、巨噬細胞等均能分泌、激活TGF-β1，使TGF-β1表達上調(diào)，進而刺激下游蛋白smad2/3 與smad4 結(jié)合，調(diào)節(jié)促纖維化介質(zhì)靶基因轉(zhuǎn)錄，推進肺纖維化發(fā)生發(fā)展[27]。 在肺纖維化中，TGF-β1/smads 信號通路激活主要作用有：（1）使成纖維細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞；（2）使肺泡上皮/內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)化成間充質(zhì)細胞；（3）下調(diào)ECM 降解酶表達，使ECM 異常沉積。此外，在探究心肌纖維化靶點基因及信號通路的研究中，發(fā)現(xiàn)TGF-β 過表達，可促進心肌成纖維細胞增生，使Ⅰ型膠原蛋白與Ⅲ型膠原蛋白mRNA 和蛋白表達上調(diào)，推進心肌纖維化進展[28]。 說明抑制TGF-β活性，阻斷TGF-β/smads 信號通路，是延緩肺纖維化和心肌纖維化發(fā)展的有效靶點，而研究表明THSWD能調(diào)控TGF-β 相關(guān)靶點。

于小寒[18]用THSWD 干預博來霉素注射液誘導的肺纖維化大鼠后，采用RT-PCR 檢測大鼠肺組織中TGF-β1、smad3 mRNA、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白表達，另外采用Western blot 檢測p-smad3 蛋白表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與模型組相比，THSWD 組TGFβ1、smad3 mRNA、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白、psmad3 蛋白表達均呈下調(diào)趨勢，說明THSWD 能降低TGF-β1 及其下游smad3 蛋白活性。 提示THSWD可能是通過下調(diào)smad3 表達，阻斷TGF-β1 傳導，進而抑制TGF-β/smad3 信號通路激活，減少肺組織中膠原合成，達到抗肺纖維化目的。此外，THSWD 在抗心肌纖維化中也有相關(guān)作用。TAN 等[29]研究THSWD對心肌纖維化的干預作用機制，采用轉(zhuǎn)錄組學方法檢測到THSWD 組大鼠心肌組織中TGF-β 受體TGFβRⅠ及下游smad2/3 蛋白表達下調(diào)，說明THSWD能抑制TGF-βRⅠ及下游smad2/3 蛋白表達，提示THSWD抗心肌纖維化的機制可能是通過抑制TGF-β 受體過表達，進而阻斷下游smads 信號通路激活，發(fā)揮抗心肌纖維化作用。

3.2 調(diào)控ERK 信號通路

ERK 信號通路是MAPK 家族中的重要成員之一，其參與細胞增殖、周期調(diào)控、分化、凋亡等，ERK1/2是目前研究最多的信號通路[30]，ERK 能被多種細胞因子刺激，如TGF-β、血管緊張素，隨后經(jīng)Ras/Raf/MEK/ERK 途徑，進而激活，發(fā)揮調(diào)控細胞增殖、凋亡作用。 KIM 等[31]研究表明，激活的ERK 信號通路是引發(fā)成纖維細胞增殖活化，誘導ECM 沉積，促進纖維化的重要因素。 且近年有研究發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病引發(fā)的腎纖維化大鼠，纖維化程度隨ERK 蛋白表達升高而逐漸加重[32]。此外，在單側(cè)輸尿管梗阻的大鼠腎纖維化模型中，抑制ERK 激活，能減少α-SMA、Ⅲ型膠原蛋白表達[33]，提示ERK 信號通路與腎纖維化密切相關(guān)。

馬進等[34]研究發(fā)現(xiàn)，THSWD 干預腎成纖維細胞BALB/c3T3，采用CCK-8 法檢測細胞增殖、活性，發(fā)現(xiàn)THSWD 組BALB/c3T3 細胞生長速度及活性均較空白組降低，Western blot 檢測到THSWD 組ERK1/2、p-ERK 蛋白表達較空白組明顯下調(diào)。 表明THSWD 能抑制ERK、p-ERK 蛋白，提示THSWD 可能通過抑制ERK 信號通路激活，從而抑制腎成纖維細胞增殖、活化，改善腎纖維化程度。 這一結(jié)果也在體內(nèi)實驗THSWD 可抑制腎纖維化大鼠中得到印證，THSWD 降低腎纖維化大鼠腎組織中ERK1/2 蛋白表達，抑制腎纖維化發(fā)展[20]。

近年，相關(guān)研究表明，ERK 信號通路與肝星狀細胞增殖也有密切關(guān)聯(lián)。 磷酸化的ERK1/2 進入細胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子及細胞周期蛋白D/E 表達，促進肝星狀細胞有絲分裂及增殖活化，推動肝纖維化發(fā)生發(fā)展[35]。蔡銳等[36]發(fā)現(xiàn)THSWD 加味方能調(diào)控人肝星狀細胞增殖和凋亡，抑制肝纖維化進程。 由此推測THSWD 加味方降低肝星狀細胞增殖，抑制肝纖維化進程可能與調(diào)控ERK 信號通路有關(guān)，但其作用機制有待進一步探究。

3.3 調(diào)控PI3K/AKT 信號通路

PI3K 是胞內(nèi)的磷脂酰肌醇激酶，PI3K 激活后與其下游蛋白AKT 結(jié)合，形成PI3K/AKT 信號通路，發(fā)揮抗細胞凋亡等重要作用[37]。 細胞凋亡是一種發(fā)生在生物體內(nèi)受多種基因調(diào)控的細胞程序性死亡，細胞凋亡與肺纖維化[38]、腎纖維化[39]以及口腔黏膜下纖維化[40]有著密切關(guān)聯(lián)。 而近期ZHANG 等[28]研究表明，心肌細胞的凋亡、壞死可加快心肌成纖維細胞分化及膠原沉積，推進心肌纖維化進程。 因此，調(diào)控PI3K/AKT 信號通路，是抗纖維化的一種重要途徑。

LUO 等[41]研究表明，THSWD 能降低心肌梗死大鼠模型心肌細胞凋亡，上調(diào)心肌組織中的AKT、PAKT 蛋白表達，并能增加類胰島素性生長因子（insulin-like growth factor-1, IGF-1）和堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）的表達。 說明THSWD 能激活AKT、P-AKT 蛋白，增加心肌細胞抗凋亡活性。而前期有研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1 可激活PI3K/AKT 信號通路，發(fā)揮抗心肌細胞凋亡作用[42]。在心肌纖維化中，THSWD 不僅可以下調(diào)心肌膠原蛋白生成，而且可以通過激活PI3K/AKT，調(diào)控心肌組織中微血管生成，減少心肌細胞凋亡。提示THSWD抗心肌纖維化機制可能是通過上調(diào)IGF-1，激活PI3K/AKT 信號通路，進而抑制心肌細胞凋亡，促進心肌組織血管生成，改善心肌微循環(huán)，達到抗心肌纖維化目的。

3.4 調(diào)控細胞因子及炎癥通路

炎癥因子是纖維化啟動及發(fā)展的重要因素[43]，其中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNFα）、白細胞介素-6（interleukin 6, IL-6）、白細胞介素-1（interleukin 1, IL-1）是促纖維化的重要炎癥細胞因子[44]。 研究發(fā)現(xiàn)，肺纖維化初期，巨噬細胞會釋放大量TNF-α、IL-6、IL-1，激活相關(guān)炎癥通路，如NF-κB，推動肺纖維化發(fā)展[45]。且相關(guān)研究表明IL-6、IL-1 在肺纖維化不同時段發(fā)揮重要作用，IL-1 出現(xiàn)于肺纖維化早期，刺激成纖維細胞轉(zhuǎn)化及膠原蛋白合成，而IL-6 表達隨著肺纖維化的嚴重程度上調(diào)，并與ECM 重要組成成分HA、LN 等呈正相關(guān)。 在口腔黏膜下纖維化中，炎癥因子也同樣參與全程病變[46]。因此，抵制炎癥因子及相關(guān)信號通路，是改善肺纖維化、口腔黏膜下纖維化的重要策略。

周勇等[47]研究發(fā)現(xiàn)，THSWD 能下調(diào)肺纖維化大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β 水平，降低肺組織內(nèi)炎癥浸潤，使肺纖維化病理改變得到改善。而通過網(wǎng)絡(luò)藥理學分析THSWD 抗口腔黏膜下纖維化的有效成分及機制中發(fā)現(xiàn)，THSWD 抑制口腔黏膜下纖維化的機制可能與下調(diào)IL-17、NF-κB 等炎信號通路相關(guān)[48]。 提示THSWD 抑制肺纖維化和口腔黏膜下纖維化作用機制可能與下調(diào)炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β 及相關(guān)信號通路NF-κB 有關(guān)。

3.5 調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）及其抑制劑

組織內(nèi)ECM 合成增多，降解減少，是引發(fā)ECM過度沉積，推進纖維化進程的重要原因[49]。 因此，增強ECM 降解也是抑制纖維化發(fā)展的一種重要途徑。而MMP 和金屬蛋白酶抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP）是調(diào)控ECM 生成與降解的關(guān)鍵酶[50]。MMP 降解ECM，TIMP 抑制MMP 活性，抑制其降解ECM 的能力[51]。 因此，調(diào)節(jié)這兩種關(guān)鍵酶是抗纖維化的理想策略，而近年研究發(fā)現(xiàn)THSWD 具有調(diào)控MMP、TIMP 活性的作用。

王桐生等[16]在研究THSWD 對肝纖維化模型影響時，發(fā)現(xiàn)THSWD 上調(diào)肝組織中MMP-1 表達，下調(diào)TIMP-1 表達，說明THSWD 能增強MMP 活性，加強ECM 降解，降低TIMP 活性。 提示THSWD 抗肝纖維化機制可能是通過調(diào)控MMP 和TIMP 活性，使MMP/TIMP 達到平衡，共同維護肝細胞微環(huán)境穩(wěn)態(tài)，進而抑制肝纖維化發(fā)展。

綜上所述，THSWD 可通過調(diào)控TGF-β/smads、ERK、PI3K/AKT、NF-κB 信號通路，炎癥因子IL-6、IL-1β 以及ECM 相關(guān)降解酶蛋白，抑制肺、腎、心、肝及口腔黏膜下纖維化發(fā)生發(fā)展。 詳見表1。

4 總結(jié)與展望

綜上所述，THSWD 能提高纖維化患者的臨床療效，并經(jīng)體內(nèi)體外實驗均證實其具有抗纖維化作用，而其作用機制可能通過調(diào)控TGF-β/smads、ERK、PI3K/AKT、NF-κB 信號通路，炎癥因子IL-6、IL-1β以及ECM 相關(guān)降解酶蛋白來實現(xiàn)的。炎癥反應是纖維化疾病的始動環(huán)節(jié)，其慢性持續(xù)性進行，可釋放促纖維化炎癥因子及TGF-β 等細胞因子，而TGF-β可激活相關(guān)的信號通路，是推動纖維化疾病發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 THSWD 可以調(diào)控炎癥因子、炎癥通路、TGF-β 及其信號通路。 提示在器官及組織纖維化早期，可利用THSWD 抑制纖維化進展，進而逆轉(zhuǎn)纖維化。 此外，網(wǎng)絡(luò)藥理學研究發(fā)現(xiàn)THSWD 還能調(diào)控Wnt 通路，而Wnt 信號通路是口腔黏膜下纖維化惡變的重要信號通路[48]，說明THSWD 治療口腔黏膜下纖維化的臨床應用前景可期。

在各纖維化模型中，THSWD 呈現(xiàn)了通過多途徑、多靶點發(fā)揮抗纖維化作用，但通過文獻總結(jié)及分析發(fā)現(xiàn)，THSWD 在抗纖維化研究中還存在一些問題有待解決。 第一，THSWD 抗纖維化的臨床研究報道較少，且報道時間相對久遠，樣本量少，且質(zhì)量不高；第二，研究范圍相對局限，主要集中于肝纖維化研究中，腎、肺、心肌以及口腔黏膜下纖維化相關(guān)研究偏少；第三，發(fā)現(xiàn)THSWD 抗各器官纖維化，甚至是同類型纖維化時，其單味中藥以及干預劑量均有差異，缺少相關(guān)的劑量標準以及藥效最優(yōu)配比研究。 因此，在未來研究中應注意：（1）擴大樣本量，加強其相關(guān)臨床研究，并與基礎(chǔ)研究相結(jié)合；（2）擴展THSWD 對不同類型纖維化疾病的影響，深入探討其防治各類纖維化疾病的機制；（3）針對THSWD 劑量和配比問題，可根據(jù)研究內(nèi)容采用均勻設(shè)計等方法，尋找到安全劑量以及最優(yōu)配比，為中藥復方配伍提供更充分、更科學的依據(jù)，進一步推進中醫(yī)藥在抗纖維化疾病中的研究。