重組人生長(zhǎng)激素-Fc免疫融合蛋白多聚體含量尺寸排阻高效液相色譜檢測(cè)方法的優(yōu)化及驗(yàn)證

馬陌，孫瑞欣，王江林，劉冰瑩，劉景會(huì)

長(zhǎng)春生物制品研究所有限責(zé)任公司重組蛋白研究室，吉林長(zhǎng)春130012

生長(zhǎng)激素（growth hormone，GH）由垂體前葉的嗜體細(xì)胞產(chǎn)生，在下丘腦GH 釋放激素（growth hormone releasing hormone，GHRH）的正向控制和體生長(zhǎng)抑素的負(fù)向控制下以脈沖方式分泌。對(duì)GHRH 的反應(yīng)是通過GHRH 受體（GHRHR）介導(dǎo)的，GHRHR 是一種G 蛋白偶聯(lián)受體（G-protein coupled receptor，GPCR），專門在體液營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)。其他因素，如胰島素樣生長(zhǎng)因子1（insulin-like growth factor 1，IGF1）、神經(jīng)肽Y 和高血糖會(huì)抑制GH 的分泌，而低血糖、甲狀腺素、胃泌素和糖皮質(zhì)激素會(huì)刺激GH 的分泌［1-2］，其中IGF1 對(duì)支持生長(zhǎng)和調(diào)節(jié)新陳代謝非常重要［3］，目前已有多項(xiàng)文獻(xiàn)報(bào)道了GH與IGF1的關(guān)系［4-6］。

20世紀(jì)上半葉，臨床觀察、解剖學(xué)和生物化學(xué)研究為人們了解GH 的結(jié)構(gòu)及其在動(dòng)物體內(nèi)的各種代謝作用奠定了基礎(chǔ)［7］。在成人中，GH 缺乏癥與內(nèi)臟脂肪增加、瘦體質(zhì)量、骨密度和運(yùn)動(dòng)能力下降、血脂異常、胰島素抵抗、心臟代謝和骨折風(fēng)險(xiǎn)增加以及生活質(zhì)量降低有關(guān)［8］。近年來也有報(bào)道GH 還影響許多導(dǎo)致纖維化的因素，包括與纖維化有關(guān)的多種蛋白和通路，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）通路，一般來說，纖維化也往往與炎癥密切相關(guān)［9-10］。除了上述疾病外，對(duì)于心血管疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化，用GH進(jìn)行治療有助于使身體成分正?；?，降低舒張壓、總膽固醇和低密度脂蛋白［11-12］。

1985 年，美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)將GH作為生長(zhǎng)激素缺乏癥（growth hormone deficiency，GHD）的特效療法［13］。重組人生長(zhǎng)激素（recombinant human growth hormone，rhGH）主要用于治療兒童及成人身材矮小，發(fā)育遲緩等病癥。目前，大多數(shù)rhGH 制劑均通過每日皮下注射給藥，停止治療的比例很高。治療依從性差與治療反應(yīng)不理想、線性生長(zhǎng)降低和無法達(dá)到遺傳身高潛能值有關(guān)［14］。不依從性會(huì)隨著時(shí)間的推移而增加，是長(zhǎng)期治療的一個(gè)重要問題［15-16］?？紤]到患者對(duì)每日GH治療的抗拒，長(zhǎng)效療法成為較有效的解決方法［17-18］。最近進(jìn)行的一項(xiàng)離散選擇實(shí)驗(yàn)表明，患者更愿意選擇注射次數(shù)較少的方案來治療GHD［19］。此外，其他適應(yīng)證的數(shù)據(jù)也表明，患者更青睞長(zhǎng)效療法，如治療血友病的長(zhǎng)效療法［20-21］。

rhGH-Fc 免疫融合蛋白是將rhGH基因與特異位點(diǎn)突變后的人抗體IgG4 Fc 段用柔性linker 連接，利用CHO-k1 細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。CHO 細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物糖基化程度高，在細(xì)胞培養(yǎng)和純化工藝流程中易于聚集產(chǎn)生多聚體。多聚體具備免疫原性，可能會(huì)導(dǎo)致過敏反應(yīng)如頭痛、發(fā)熱、發(fā)冷等，因此，抗體蛋白質(zhì)中多聚體的檢測(cè)十分重要。尺寸排阻色譜（size exclusion chromatography，SEC）是目前較為常用的單克隆抗體類生物治療藥物純度檢測(cè)方法，其原理是根據(jù)蛋白分子尺寸差異進(jìn)行分離。理想條件下蛋白分子不與惰性填料發(fā)生作用，但由于實(shí)驗(yàn)條件的客觀因素會(huì)導(dǎo)致蛋白與色譜柱填料之間產(chǎn)生非特異性結(jié)合，因此需對(duì)檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)旨在優(yōu)化SECHPLC 法檢測(cè)rhGH-Fc 免疫融合蛋白多聚體含量的條件，并對(duì)優(yōu)化的方法進(jìn)行驗(yàn)證，以期為rhGH-Fc 免疫融合蛋白后續(xù)臨床研究等的安全性、有效性和質(zhì)量可控性提供可靠的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1標(biāo)準(zhǔn)品及供試品 rhGH-Fc 免疫融合蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：SCJFCGH202102）和原液（批號(hào)：S20210408）由本公司重組蛋白研究室提供；GH 國家標(biāo)準(zhǔn)品（編號(hào)：140635）和蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品購自中國食品藥品檢定研究院；rhGH-Fc免疫融合蛋白對(duì)照品由本公司重組蛋白研究室留樣保存。

1.2主要試劑及儀器 磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉（均為分析純）購自湖南九典制藥有限公司；氯化鈉（分析純）購自江西勤奮藥業(yè)有限公司；HPLC 系統(tǒng)PerkinElmer Flexar 型高效液相色譜儀購自美國PerkinElmer 公司（包括UV／VIS 檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、往復(fù)式柱塞泵、TCNav 色譜工作站、柱溫箱）；色譜柱TSKgel G3000SWxl（10μm，7.8 mm×300 mm）和TSKgel G2000SWxl（5μm，7.8 mm×300 mm）購自日本TOSOH公司。

1.3標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 取GH 標(biāo)準(zhǔn)品1 支（蛋白含量為1 mg），精密加入注射用水1 mL 溶解，制成濃度為1.0 mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.4檢測(cè)條件的優(yōu)化

1.4.1鹽離子強(qiáng)度 選擇NaCl濃度分別為0.1、0.2、0.3 mol／L的3種流動(dòng)相，按如下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)：50 mmol／L磷酸鹽緩沖液（pH 7.20），檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，進(jìn)樣量100μL，流速1.0 mL／min，柱溫室溫。比較流動(dòng)相的鹽離子強(qiáng)度對(duì)樣品中聚合物分離效果的影響。

1.4.2pH 選擇pH分別為6.6、6.8、7.0的3種流動(dòng)相，按如下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)：50 mmol／L 磷酸鹽緩沖液，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，進(jìn)樣量100μL，流速1.0 mL／min，柱溫室溫。比較流動(dòng)相的pH 對(duì)樣品中聚合物分離效果的影響。

1.4.3柱溫分別設(shè)定柱溫在室溫（25）、35 與45 ℃條件下，按如下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)：50 mmol／L磷酸鹽緩沖液（pH 7.20），檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，進(jìn)樣量100μL，流速1.0 mL／min。比較柱溫對(duì)樣品中聚合物分離度效果的影響。

1.4.4流速 分別設(shè)定流速為1.0、0.8、0.6 mL／min，按如下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)：50 mmol／L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.20），檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，進(jìn)樣量100μL，柱溫室溫。比較流速對(duì)樣品中聚合物分離度的影響。

1.4.5色譜柱 根據(jù)rhGH-Fc 免疫融合蛋白相對(duì)分子質(zhì)量（97 370），選擇適宜排阻界限的TSKgel G3000SWxl和TSKgel G2000SWxl兩種色譜柱，按如下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)：50 mmol／L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.20），檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，進(jìn)樣量100 μL，流速1.0 mL／min，柱溫室溫。比較兩種色譜柱的理論塔板數(shù)。

1.5方法的驗(yàn)證

1.5.1系統(tǒng)適應(yīng)性 取rhGH-Fc 免疫融合蛋白對(duì)照品進(jìn)樣檢測(cè)。流動(dòng)相為50 mmol／L 磷酸鹽緩沖溶液-0.3 mol／L NaCl（pH 6.8），分別以原色譜條件（檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，上樣量100 μL，柱溫室溫，流速1.0 mL／min，色譜柱TSKgel G3000SWxl）與優(yōu)化后色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，各重復(fù)進(jìn)樣3次。

1.5.2專屬性 取rhGH-Fc 免疫融合蛋白對(duì)照品、GH國家標(biāo)準(zhǔn)品、rhGH-Fc免疫融合蛋白樣品及蛋白緩沖液（50 mmol／L 磷酸鹽緩沖溶液）各100μL，按照優(yōu)化的色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄出峰時(shí)間及峰面積。

1.5.3線性與范圍 取rhGH-Fc免疫融合蛋白樣品，經(jīng)Lowry 法測(cè)定蛋白濃度約為3.07 mg／mL，用注射用水稀釋，配制成以下6個(gè)濃度：0.307、0.614、0.860、1.228、1.596、1.842 mg／mL，精密量取100 μL，按照優(yōu)化的色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。以供試品溶液濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制曲線，得到回歸方程并計(jì)算絕對(duì)系數(shù)（R2）。

1.5.4重復(fù)性 取6 份濃度為1.0 mg／mL 的rhGHFc 免疫融合蛋白樣品，精密量取100 μL，按照優(yōu)化的色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。計(jì)算6 次檢測(cè)樣品峰面積的平均值及RSD。

1.5.5中間精密性 取rhGH-Fc 免疫融合蛋白樣品（1.0 mg／mL），由兩名操作人員（A 與B）分別于3 個(gè)不同日期及2 臺(tái)不同HPLC 儀器，按照優(yōu)化的色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。計(jì)算峰面積的平均值及RSD。

1.5.6準(zhǔn)確性 取9份rhGH-Fc免疫融合蛋白溶液，分別與GH標(biāo)準(zhǔn)品溶液按體積比1∶0.8、1∶1.0、1∶1.2混合，制成高、中、低3種濃度待測(cè)溶液各3份，按照優(yōu)化的色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，并計(jì)算回收率及RSD。取GH標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 份，按照優(yōu)化的色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，利用外標(biāo)法計(jì)算GH標(biāo)準(zhǔn)品加入量實(shí)測(cè)值。

1.5.7定量限 取rhGH-Fc 免疫融合蛋白對(duì)照品溶液，加注射用水稀釋成0.05 mg／mL，按照優(yōu)化的色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果逐步調(diào)整溶液濃度，直至信噪比S／N為1∶10時(shí)，測(cè)得定量限。

1.6數(shù)據(jù)采集及分析 所有圖譜均由Total Chrom（6.3.20676）工作站處理所得。

2 結(jié)果

2.1檢測(cè)條件的優(yōu)化

2.1.1鹽離子強(qiáng)度對(duì)聚合物分離效果的影響 隨著NaCl濃度的升高，理論塔板數(shù)與分離度隨之升高，見表1。因此選擇0.3 mol／L為最佳鹽濃度。

表1 不同鹽離子強(qiáng)度下聚合物的分離效果Tab.1 Separation effect of polymer under different salt ion strength

2.1.2pH對(duì)聚合物分離效果的影響 3種pH值流動(dòng)相對(duì)分離度與拖尾因子無明顯影響，隨著pH 的升高，保留時(shí)間略降低；在pH 為6.8 條件下，理論塔板數(shù)高于pH 6.6 和7.0。見圖1 和表2。綜合考慮選擇6.8為流動(dòng)相最佳pH。

圖1 流動(dòng)相pH對(duì)聚合物分離效果的影響Fig.1 Effect of mobile phase pH on polymer separation effect

表2 不同流動(dòng)相pH下聚合物的分離效果Tab.2 Separation effect of polymer under different mobile phase pH

2.1.3柱溫對(duì)聚合物分離效果的影響 升高柱溫會(huì)使理論塔板數(shù)與分離度增高，見表3。因此選擇45 ℃為最佳柱溫。

表3 不同柱溫下聚合物的分離效果Tab.3 Separation effect of polymer under different column temperature

2.1.4流速對(duì)聚合物分離效果的影響 降低流速會(huì)使理論塔板數(shù)與分離度增高，見表4。因此選擇0.6 mL／min為最佳流速。

表4 不同流速下聚合物的分離效果Tab.4 Separation effect of polymer under different flow rate

2.1.5色譜柱對(duì)理論塔板數(shù)的影響 TSKgel G2000-SWxl比TSKgel G3000SWxl保留時(shí)間更短，柱效更高，且填料孔徑更小，分離效果優(yōu)于TSKgel G3000SWxl色譜柱。見表5。

表5 不同色譜柱分離聚合物的效果Tab.5 Separation effect of polymer using different columns

最終確定檢測(cè)方法為采用TSK-gel G2000SWxl色譜柱（5 μm，7.8 mm × 300 mm）進(jìn)行測(cè)定，流動(dòng)相為50 mmol／L 磷酸鹽緩沖液（pH 6.80），檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，進(jìn)樣量為100 μL，流速為0.6 mL／min，柱溫為45 ℃。

2.2方法的驗(yàn)證

2.2.1系統(tǒng)適應(yīng)性 rhGH-Fc免疫融合蛋白與聚合物分離度、理論塔板數(shù)、拖尾因子均能滿足要求，見表6。

表6 系統(tǒng)適應(yīng)性驗(yàn)證結(jié)果Tab.6 System adaptation verification

2.2.2專屬性 rhGH-Fc 免疫融合蛋白樣品與對(duì)照品出峰時(shí)間一致，GH 國家標(biāo)準(zhǔn)品與對(duì)照品出峰時(shí)間不同，蛋白緩沖液不出峰，見圖2。表明該方法專屬性良好。

圖2 專屬性驗(yàn)證結(jié)果Fig.2 Verification for specificity

2.2.3線性與范圍 回歸方程為y=7 E+06x-98 891，R2為0.999 4，在可接受范圍之內(nèi)，表明蛋白濃度在0.307 ～1.842 mg／mL 范圍內(nèi)，主峰面積與上樣量之間呈良好的線性關(guān)系。見圖3。

圖3 線性測(cè)定結(jié)果Fig.3 Linearity measurement results

2.2.4重復(fù)性 6 次測(cè)得樣品峰面積的平均值為4 858 621.83，RSD為0.7%；純度平均值為89.74，RSD為0.1%。見表7。表明該方法重復(fù)性良好。

表7 重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果Tab.7 Verification for repeatability

2.2.5中間精密性 6 次進(jìn)樣峰面積的平均值為4 997 402.80，RSD為0.8%，見表8。表明該方法中間精密性良好。

表8 中間精密性驗(yàn)證結(jié)果Tab.8 Verification for intermediate precision

2.2.6準(zhǔn)確性 經(jīng)計(jì)算，GH標(biāo)準(zhǔn)品平均回收率為99.1%，RSD為1.9%，見表9。表明該方法準(zhǔn)確性較高。

表9 準(zhǔn)確性驗(yàn)證結(jié)果Tab.9 Verification for accuracy

2.2.7定量限 檢測(cè)結(jié)果顯示，該方法的定量限為6μg／mL。

3 討論

HPLC 方法的優(yōu)化是一個(gè)復(fù)雜的過程，需同時(shí)控制多個(gè)變量（流動(dòng)相pH 值、緩沖液濃度、流速、色譜柱溫度、檢測(cè)器波長(zhǎng)等）才能達(dá)到理想的分離效果［22-23］。SEC 法主要根據(jù)樣品組分分子大小進(jìn)行分離，但由于介質(zhì)的生產(chǎn)工藝制約，基質(zhì)不會(huì)完全表現(xiàn)為惰性。其表面存在少量的疏水性部位和帶負(fù)電荷的離子性部位，增加鹽離子強(qiáng)度可弱化其對(duì)分離效果的影響，但過高的鹽濃度會(huì)增強(qiáng)蛋白與基質(zhì)的疏水作用，也會(huì)對(duì)色譜系統(tǒng)產(chǎn)生腐蝕作用。rhGH-Fc免疫融合蛋白的等電點(diǎn)在5.2 ～5.3，流動(dòng)相pH升高使蛋白表面凈電荷增加，與填料表面所帶的少量負(fù)電荷離子部位發(fā)生排斥作用從而縮短保留時(shí)間。但可能由于流動(dòng)相中含有0.3 mol／L NaCl，削弱了排斥作用使得變化并不明顯。有報(bào)道也稱，在pH 7.4 的高溫磷酸鹽緩沖液中，蛋白容易脫酰胺化，在開發(fā)方法時(shí)對(duì)于pH 的摸索也需注意［24］。升高溫度可明顯提高分離效果，有資料分析原因可能為溫度升高，水的黏度與介電常數(shù)減小，極性隨之減小，改變了流動(dòng)相的極性，對(duì)弱極性物質(zhì)洗脫效果增強(qiáng)［25］。在經(jīng)典塔板理論假設(shè)中，忽略了流動(dòng)相流速對(duì)溶質(zhì)分配的影響；但在色譜滑移機(jī)理假設(shè)中，流體動(dòng)力學(xué)因素影響了溶質(zhì)馬丁-辛格分配，在一定范圍內(nèi)，理論塔板數(shù)隨流速的減小而增加。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也反映了這一理論。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，繼續(xù)減小流速，理論塔板數(shù)與分離度仍會(huì)繼續(xù)增加，但相應(yīng)的檢測(cè)時(shí)間也會(huì)延長(zhǎng)。綜合上述原因，最終選擇流動(dòng)相為50 mmol／L 磷酸鹽緩沖溶液-0.3 mol／L 氯化鈉（pH 6.8）；色譜條件為：柱溫45 ℃，流速0.6 mL／min，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，上樣量100 μL；色譜柱為TSKgel G2000SWxl為最終檢測(cè)條件。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)建立的方法進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明，該方法具有良好的穩(wěn)定性以及精密度。在準(zhǔn)確性驗(yàn)證中，用GH 國家標(biāo)準(zhǔn)品代替rhGH-Fc 免疫融合蛋白進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，雖然兩者相對(duì)分子質(zhì)量不同，但其本質(zhì)均為蛋白質(zhì)，色譜行為相似，且在280 nm 處均有吸收峰。該方法檢測(cè)的蛋白圖譜良好，主峰無雜質(zhì)峰干擾，各項(xiàng)指標(biāo)均符合要求，可滿足rhGH-Fc對(duì)檢測(cè)的需求。

綜上所述，利用SEC-HPLC 進(jìn)行蛋白含量檢測(cè)比Lowry法更加靈敏高效，可縮短檢測(cè)時(shí)間。本研究建立的rhGH-Fc免疫融合蛋白多聚體含量SEC-HPLC檢測(cè)方法系統(tǒng)適用性、專屬性、精密性良好，準(zhǔn)確性較高，有利于為純化工藝提供數(shù)據(jù)支持，以便摸索更為優(yōu)化的純化條件。