基于細胞外囊泡療法的非臨床評價策略

李嫚琪，魏麗萍，李英奇，陶巧玉，許瀚林，3，何偉偉，湯納平，汪溪潔 綜述，王慶利，常艷 審校

1.中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院上海益諾思生物技術(shù)股份有限公司，上海 201203；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥 230012；3.上海工程技術(shù)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，上海 201620；4.國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心，北京100022

細胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）指由細胞主動釋放到細胞外環(huán)境的，選擇性包裹蛋白質(zhì)、DNA片段、RNA、脂質(zhì)和代謝物等各種分子的脂質(zhì)雙層囊泡［1］。EV 不含功能核，不能增殖和分化［2］。根據(jù)其生物發(fā)生機制、大小和生物物理學(xué)特性的不同，EV可大致分為3 類：外泌體（exosomes）、微囊泡（microvesicles，MV）、凋亡小體（apoptotic bodies，AB），目前絕大多數(shù)研究為外泌體相關(guān)研究。EV 在生理和病理過程中的功能取決于其與受體細胞相互作用以傳遞其蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和RNA 等內(nèi)容物的能力［3］。EV 表面蛋白信號分子可識別并靶向受體細胞，一旦連接上靶細胞，可通過受體-配體相互作用誘導(dǎo)信號傳遞，或通過胞吞作用內(nèi)化，也可直接與靶細胞的膜融合，將其內(nèi)容物傳遞至靶細胞的胞漿中［4］。當(dāng)EV 內(nèi)容物進入細胞內(nèi)，即可通過信使RNA（messenger RNA，mRNA）的翻譯、微小RNA（microRNA，miRNA）的基因沉默及生物活性脂質(zhì)的作用引發(fā)蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)及表觀遺傳學(xué)的改變［5］，從而改變受體細胞的生理狀態(tài)。EV 最初僅被視為細胞向外分泌的廢棄物，但近年來，研究者發(fā)現(xiàn)，EV 作為細胞間重要的運載體，是細胞間通訊的重要方式［6］，可作為一種無細胞治療手段進行臨床治療，同時還具有作為天然藥物遞送載體的潛在能力。本文就基于EV 療法的研發(fā)概況、特點，監(jiān)管要求及非臨床評價策略作一綜述。

1 基于EV療法的研發(fā)概況

近10年來，EV相關(guān)的各項研究大量涌現(xiàn)。目前尚無獲得批準(zhǔn)的基于EV 治療的上市藥物，但已有較多產(chǎn)品進入臨床研究階段。截至2022 年3 月，clinicaltrials.gov 平臺中有34 項EV 作為治療藥物的臨床試驗，有10 項EV 作為載體的臨床試驗。截至2022年5 月，clinicaltrials.gov 平臺（https：／／clinicaltrials.gov）中EV 作為治療藥物的臨床試驗見表1，EV 作為載體的臨床試驗見表2。其中適應(yīng)證涉及炎癥、癌癥、眼部疾病和呼吸系統(tǒng)疾病等多個領(lǐng)域，EV 的來源多為間充質(zhì)干細胞，也有少數(shù)來源為腫瘤細胞，給藥方式多為局部用藥，系統(tǒng)用藥相對較少。

表1 EV作為治療藥物的臨床試驗Tab.1 Clinical trials of EV as therapeutic drugs

表2 EV作為載體的臨床試驗Tab.2 Clinical trials of EV as vectors

1.1EV 作為治療藥物 內(nèi)源性釋放的EV 可參與許多病理和生理學(xué)過程，在免疫調(diào)節(jié)和組織再生中具有重要作用［7］，其本身就具有治療潛力。其中應(yīng)用最廣泛是來自間充質(zhì)干細胞的EV，已有大量基礎(chǔ)實驗證明，EV 在軟骨、骨、皮膚、血管、味蕾、神經(jīng)組織、牙、骨骼肌、心肌、肝、腎和肺等組織再生方面具有巨大的應(yīng)用潛能。此外，免疫細胞分泌的EV 可通過促進調(diào)節(jié)反應(yīng)或調(diào)節(jié)周圍細胞，減少炎癥來直接控制外周免疫功能［8］。EV 還能抑制自身免疫。調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory cell，Treg）的主要功能是通過促進免疫系統(tǒng)的自我耐受來預(yù)防自身免疫，Treg 利用EV 抑制其他免疫細胞的活性。有研究表明，Treg 衍生的EV 包含多個miRNA 和miRNA 前體［9-11］，樹突狀細胞攝取含有miR-142-3p 和miR-150-5p 的EV 會導(dǎo)致促炎性細胞因子白細胞介素-6 表達降低，并導(dǎo)致免疫抑制性細胞因子白細胞介素-10 表達升高［9］。這些miRNA 干擾樹突狀細胞中的抗原加工和呈遞，從而抑制了免疫激活［8］。自COVID-19疫情暴發(fā)以來，EV也為治療COVID-19提供了新的思路。

1.2EV 作為藥物載體 EV 作為介導(dǎo)細胞間通訊的媒介，可被用作有效遞送載體，裝載基因類、蛋白類和小分子藥物等，已成為目前最為關(guān)注的EV 研究方向。目前研究多集中于EV 包載RNA 或小分子藥物的抗腫瘤研究。EV的生化特性可用于靶向遞送藥物至某些細胞群［12］，實現(xiàn)選擇性遞送，由于EV是由細胞產(chǎn)生的，具有跨膜蛋白和表面受體等特異性蛋白，可避免或促進靶細胞的識別和相互作用。EV的裝載方式分為主動裝載和被動裝載兩種。主動裝載包括：電穿孔、化學(xué)轉(zhuǎn)染（轉(zhuǎn)染EV 或轉(zhuǎn)染EV 親本細胞）、物理轉(zhuǎn)染（超聲法、擠出法、反復(fù)凍融法）、點擊化學(xué)；被動裝載指孵育（EV 或EV 的親本細胞與藥物孵育）。不同細胞來源的EV 成分不同，其潛在的生物功能也有較大差異：腫瘤細胞分泌的EV 作為藥物載體時，可較好地歸巢至腫瘤部位；巨噬細胞分泌的EV 具有良好的炎癥趨向作用，且可跨越血腦屏障用于腦部疾病的治療；樹突狀細胞分泌的EV 則具有良好的免疫效應(yīng)。此外，EV與核酸分子有更好的親和性，能顯著提高包封效率。EV 結(jié)構(gòu)具有可改造性，膜修飾方式多樣，如基因修飾EV 表面功能化蛋白，增強靶向性，提高EV遞送效率。EV還可與病毒載體結(jié)合使用，如外泌體與腺相關(guān)病毒（adeno-associa-ted virus，AAV）雜交可顯著降低免疫原性［12］。天然EV進行工程改造可提高質(zhì)粒的效率和容量，如外泌體與脂質(zhì)體雜交可包裹和遞送CRISPR-Cas9，并減輕脂質(zhì)體的毒性［13］。大多數(shù)注射的EV會優(yōu)先聚集在肝、腎和脾，被迅速清除，從而限制了外源性EV在靶組織中的濃度［14］。有研究通過基因修飾或結(jié)合靶向配體、抗體、刺激因子或免疫逃逸因子進行EV改造［15-16］，如在EV表面修飾能與腫瘤組織特異性結(jié)合的多肽，增加抗腫瘤藥物的運送效率和療效。同時，藥物在EV 內(nèi)的運輸可產(chǎn)生不同于游離藥物的藥理學(xué)特征，保護傳統(tǒng)藥物免受腫瘤微環(huán)境的影響，從而增強藥效和改變脫靶效應(yīng)。

2 基于EV療法的研發(fā)特點

2.1基于EV 療法的優(yōu)勢 EV 來源廣泛，無生命但具有生物活性，由于其生物相容性、穩(wěn)定性、靶向性、歸巢性和可擴展性［8］，并且可反映細胞起源，是藥物開發(fā)和遞送的理想候選者。

相比于傳統(tǒng)藥物治療和細胞治療，EV 作為一種無細胞療法具有獨特的優(yōu)勢。EV 富含黏附分子和信號分子，能夠識別靶細胞并刺激攝取，比游離型藥物具有更強的細胞靶向性和攝取性［17］。與更易被免疫清除的游離型藥物和細胞療法相比，跨膜CD47的存在允許EV 通過CD47-Sirpα 發(fā)出“不要吃我”的信號來避免免疫排斥反應(yīng)［18］，有助于延長EV在體內(nèi)的循環(huán)時間，延長半衰期［8］。EV的膜結(jié)構(gòu)可提供保護，防止其被分子組成中的酶和非酶物質(zhì)降解。此外，與細胞療法相比，EV 比親本細胞更小、更簡單、更穩(wěn)定，相對容易修改和制造，來源豐富且產(chǎn)量高，能夠適應(yīng)專業(yè)化和規(guī)模化生產(chǎn)，比細胞更適合長期儲存，功能損失較小。有研究表明，給因?qū)嶒炐孕呐K病發(fā)作而導(dǎo)致心肌受損的幼年豬注射人誘導(dǎo)性多能干細胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSC）產(chǎn)生的心臟細胞（hiPSC-CC）或hiPSC-CC 細胞來源的外泌體后，藥效學(xué)作用未見明顯差異，但外泌體治療并未增加心律失常的頻率，具有更好的安全性［19］。與傳統(tǒng)的細胞移植相比，EV 作為一種簡單的微小囊泡結(jié)構(gòu)，不含細胞核，不能異常增殖和分化［20］，致瘤性和免疫原性風(fēng)險較低，具有更高的治療安全性。

EV 作為載體，能夠保護包載的藥物在人體復(fù)雜的環(huán)境中不被降解，隨后通過膜融合將藥物直接運輸至細胞質(zhì)中，使藥物攝取量更大、循環(huán)時間更久、藥物釋放更加持續(xù)。相比于逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒、AAV 等病毒載體，EV 毒性低，無整合及致畸致瘤風(fēng)險。與合成納米載體相比，EV 輸送系統(tǒng)在靶向性和藥代動力學(xué)方面具有顯著優(yōu)勢。內(nèi)源性納米載體具有更好的體內(nèi)生物相容性，清除率低。納米尺度的EV 可通過包括血腦屏障在內(nèi)的絕大多數(shù)生物屏障系統(tǒng)，其表面存在一些特殊的蛋白，能避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的捕獲，逃脫單核吞噬細胞系統(tǒng)的快速清除，引起的有害免疫反應(yīng)極低，納米級分子的EV 可利用增強滲透滯留效應(yīng)滲入到腫瘤內(nèi)發(fā)揮作用。EV 也可遷移至無血液供應(yīng)的組織或區(qū)域，如致密的軟骨基質(zhì)［21］。此外，可通過改造EV的表面蛋白實現(xiàn)多種目的，例可將靶向細胞或組織的肽附加在EV 表面，以實現(xiàn)針對特定組織的選擇性靶向，避免在其他器官中不必要的積累，從而降低全身毒性［14］。

2.2基于EV 療法的存在的問題 EV 的臨床轉(zhuǎn)化受到大規(guī)模生產(chǎn)、純化、修飾和儲存的挑戰(zhàn)，且EV 亞群之間的異質(zhì)性對于生產(chǎn)制造和臨床轉(zhuǎn)化的質(zhì)量控制提出了要求。EV 作為載體也面臨著許多問題，如載藥效率較低、封裝率低；殘留的轉(zhuǎn)染試劑可能會影響封裝過程和改變EV 的細胞功能；電穿孔法易引起EV 聚集，對藥物和EV 的完整性會產(chǎn)生影響等。腫瘤細胞分泌的EV 存在促進腫瘤生長及免疫抑制的風(fēng)險，含有的腫瘤相關(guān)抗原和免疫抑制分子能夠下調(diào)免疫系統(tǒng)的應(yīng)答，還能傳遞某些抑制信號，在機體免疫應(yīng)答過程中起負性調(diào)節(jié)作用，誘導(dǎo)腫瘤細胞形成免疫耐受。促進腫瘤轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)和RNA 也可利用EV 作為逃逸載體而免受機體的免疫應(yīng)答作用。此外，基因修飾后的EV 是否會引起機體免疫反應(yīng)、是否保持原有功能尚不確定。目前，人們對EV 的了解尚不足，天然外泌體難以體內(nèi)示蹤，其在人和動物體內(nèi)的生物分布仍有待闡明。

3 EV的監(jiān)管

EV 領(lǐng)域相對較新，其來源廣、種類繁雜，難以統(tǒng)一歸類并研究，相關(guān)知識涉及多個領(lǐng)域和學(xué)科。目前的技術(shù)手段對于EV 這樣納米級的非細胞結(jié)構(gòu)的操作尚存在一定困難。不同的操作人員、儀器、實驗系統(tǒng)以及生物標(biāo)本來源均會引起實驗結(jié)果的差異［22］。明確分類、規(guī)范實驗方法、保證實驗的嚴謹性和可重復(fù)性成為行業(yè)內(nèi)亟需了解并亟待解決的問題。

2011年，國際細胞外囊泡協(xié)會（International Society for Extracellular Vesicles，ISEV）成立，并與歐盟歐洲科技合作組織（European Cooperation in Science and Technology，COST）組成了歐洲健康與疾病微囊和外泌體網(wǎng)絡(luò)（European Network on Microvesicles and Exosomes in Health and Disease，ME-HaD）［23］。ISEV 和ME-HaD的成立旨在規(guī)范EV領(lǐng)域的研究，促進學(xué)術(shù)、臨床轉(zhuǎn)化及工業(yè)化生產(chǎn)之間的交流，以加強對EV 的基本理解和臨床轉(zhuǎn)化潛力。ISEV 和ME-HaD 發(fā)表了多份立場聲明和文件，為EV 的基礎(chǔ)研究和臨床轉(zhuǎn)化提供了信息，并提出基本指導(dǎo)要求。美國FDA 明確將外泌體納入動物細胞、組織以及基于細胞和組織的產(chǎn)品（Animal Cells，Tissues，and Cell-and Tissue-Based Products，ACTPs）。

3.1ISEV和ME-HaD立場聲明及文件 為了提高實驗結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性，ISEV 于2014 年發(fā)表了一篇立場聲明MISEV2014［22］，內(nèi)容是“細胞外囊泡研究的最低實驗要求”，包括EV 的分離、鑒定和功能研究。2015 年，ME-HaD 與ISEV 聯(lián)合發(fā)表立場聲明［7］，重點介紹了EV 生產(chǎn)和臨床應(yīng)用必須考慮的安全和監(jiān)管要求。隨著研究者對EV 的研究不斷深入，EV領(lǐng)域的知識不斷演變，ISVE 在2017年［24］和2018年［2］分別對MISEV2014 中的內(nèi)容進行了更新和補充，MISEV2018 還增加了規(guī)范EV 命名的建議。MISEV作為業(yè)內(nèi)研究者的共識，是目前國際公認的EV 指導(dǎo)要求。

此外，ISEV在2013年發(fā)表立場文件［25］，指出了EV樣品采集、分離和分析方法標(biāo)準(zhǔn)化建議；2013年［26］和2017 年［27］發(fā)表的立場文件中概述了EV RNA 領(lǐng)域的知識現(xiàn)狀，討論了EV RNA 分析和生物信息學(xué)；2019年發(fā)表了關(guān)于EV生物膜的立場文件［28］，列舉了EV生物膜的生物發(fā)生、穩(wěn)定性、攝取、內(nèi)容物轉(zhuǎn)移、研究技術(shù)和功能分析；2021年5月，最新發(fā)表了關(guān)于尿液EV的立場文件［29］，介紹了EV的生物學(xué)信息以及當(dāng)前收集、分離、表征尿液EV 的技術(shù)手段，分析了基于尿液EV 臨床應(yīng)用分析中的發(fā)展趨勢和挑戰(zhàn)，并提出在尿液EV研究中標(biāo)準(zhǔn)化，提高嚴謹性和可重復(fù)性的建議。

3.2ISEV建議分類及基于EV療法的監(jiān)管建議 由于當(dāng)前對于EV的了解尚不夠深入，目前尚無專門針對基于EV 療法的相關(guān)政策和法規(guī)出臺。EV 可歸類為生物制品，基于EV 的療法受到歐盟、美國、澳大利亞、日本和中國有關(guān)生物制品的監(jiān)管。ISEV 建議對基于EV的療法進行分類［10］：①來自未經(jīng)基因修飾的細胞的天然EV；②來自基因修飾的細胞的非轉(zhuǎn)基因天然EV；③來自基因修飾的細胞的轉(zhuǎn)基因天然EV，分類屬于生物制品中的基因治療產(chǎn)品；④EV 作為化學(xué)藥物或其他分子成分的藥物遞送系統(tǒng)，屬于生物和化學(xué)聯(lián)合治療，歸類為生物藥物。必須確定EV 是否為有效成分，若不是有效成分，則被視為“賦形劑”。

由于EV 的特殊性，可能需要專門針對基于EV療法的指導(dǎo)原則［10］。EV 領(lǐng)域發(fā)展迅速，建議各國藥監(jiān)部門對EV 類產(chǎn)品引起重視、及時跟進，希望通過出臺技術(shù)指導(dǎo)文件來規(guī)范和指導(dǎo)EV 產(chǎn)品的研發(fā)上市，促進EV產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

4 EV的非臨床評價策略

隨著EV 臨床試驗的大量開展，基于EV 療法的安全性和有效性是關(guān)注重點。EV 多來源于細胞，在復(fù)雜性、組成和生物學(xué)作用方面可能與其來源材料有許多相似之處，基于EV 的治療藥物將與基于細胞治療產(chǎn)品密切相關(guān)。與細胞治療產(chǎn)品相同，傳統(tǒng)的非臨床評價方法及標(biāo)準(zhǔn)在EV 的評價上具有一定的局限性。因此，在EV 的非臨床研究中，研究者應(yīng)設(shè)計合理的試驗，證明其有效性并觀察潛在毒性，為臨床試驗提供更多參考依據(jù)。EV 的非臨床研究可能包括體內(nèi)外藥效研究、藥代動力學(xué)研究以及非臨床安全性研究。

4.1非臨床研究的一般原則 EV 非臨床研究尚無特定指導(dǎo)原則，臨床前評價經(jīng)驗較少，結(jié)合ME-HaD對基于EV 療法安全性研究的建議，應(yīng)按照“product by product”的原則進行試驗設(shè)計。需重視概念驗證（proof of concept，POC）試驗，并通過POC研究初步驗證藥效、作用機制及靶點，探索量效關(guān)系，優(yōu)化給藥途徑和方案，為臨床試驗提供可行性和有效性的非臨床證據(jù)。進行非臨床研究應(yīng)關(guān)注EV 是否修飾。受試物需盡量采用具有臨床代表性的產(chǎn)品進行非臨床研究。動物模型的選擇上應(yīng)明確疾病特異性和物種特異性，根據(jù)研究目的來選擇適當(dāng)?shù)膭游锓N屬［12］。所選擇的動物生物反應(yīng)與預(yù)期人體反應(yīng)相似，必要時可考慮選擇疾病模型動物進行安全性研究。在合適的情況下，其藥理學(xué)、藥代動力學(xué)、毒理學(xué)試驗可考慮聯(lián)合開展。給藥方式應(yīng)能最大程度模擬臨床擬用給藥方式。此外還應(yīng)關(guān)注系統(tǒng)給藥或局部給藥的毒性風(fēng)險，以及給藥方式的潛在風(fēng)險。應(yīng)用同種異體EV 時，必須考慮組織相容性的潛在影響［10］。此外，有研究結(jié)果顯示，脂肪組織來源和心臟來源的EV比骨髓來源的EV 顯示出更強的血管生成能力［30-31］。骨髓來源的EV 的產(chǎn)生能力和分泌譜高于脂肪來源的EV［32］，表明不同組織來源的EV 具有不同的活性。但目前尚未研究比較不同物種的EV。基于EV 療法的非臨床研究必須考慮到不同物種及不同來源（自體、同種異體、異體、異種）的EV的生物學(xué)差異。

4.2藥學(xué)研究 EV 的生產(chǎn)使用活細胞，制備過程中的微小變化可能會對EV 的產(chǎn)品特性產(chǎn)生深遠影響。在評估產(chǎn)品的整體風(fēng)險時，應(yīng)考慮各種因素對產(chǎn)品風(fēng)險的影響，如細胞的來源、操作程度、培養(yǎng)時間、存活情況和代次，EV 的儲存條件，物理性及化學(xué)性處理或基因修飾／改造對EV 特性的改變程度，使用方式以及預(yù)處理等多方面因素。

對于EV 的質(zhì)量控制，需定義關(guān)鍵質(zhì)量屬性。評估這些屬性的方法可包括評估親代細胞特性（如評估生存力和表面標(biāo)記表達以評估表型）、EV 特征（如評估數(shù)量、大小、表面標(biāo)記表達和內(nèi)容物）、微生物污染（如檢測內(nèi)毒素和支原體）和功能活性［33］。對于批間差異性的評估，可引入生物類似藥研究中的概念，即受試物的分析特性應(yīng)與參照藥高度相似［34］。

EV 的表征是安全性、有效性的先決條件。目前尚無特定的指導(dǎo)原則用于指導(dǎo)EV 制劑的表征，參考國家藥品監(jiān)督管理局2008 年頒布的《多組分生化藥注射劑基本技術(shù)要求（試行）》執(zhí)行，應(yīng)盡可能對所含組分進行特征性鑒別，如組成過于復(fù)雜，應(yīng)至少明確所含的起藥效的主要成分。MISEV2018 中指出了EV 表征的最低實驗要求和檢測技術(shù)，包括量化、整體和單個特征描述及拓撲結(jié)構(gòu)的表征要求（表3）［2］。MISEV2018 中雖未提及對EV 作為載體時的包封率要求，但EV作為藥品仍需關(guān)注包封率。

表3 MISEV2018中對EV表征的最低實驗要求Tab.3 Minimum experimental requirements for characterization of EV in MISEV 2018

4.3藥效學(xué)和藥代動力學(xué)研究 大多數(shù)EV 是在體外獲得，其在體內(nèi)的分泌、轉(zhuǎn)移和蓄積部位并不清楚［35］，EV 可在遞送部位和周圍被細胞相對較快地內(nèi)化，通常進入非特定的細胞類型和全身循環(huán)。結(jié)合生物分布實驗，可以研究EV 的半衰期和降解情況，監(jiān)測周期應(yīng)設(shè)合適的時間間隔，來顯示“EV 命運”。若EV 表面設(shè)計了靶向的工程改造，關(guān)注靶組織和非靶組織分布特點有利于進一步研究該產(chǎn)品的有效性和安全性。但EV 中生物活性成分的多樣性使得臨床前藥效和藥代動力學(xué)研究更為復(fù)雜。因此，需找出可量化的方式來進行EV 的生物分布研究，目前已研究通過采用放射性同位素標(biāo)記成像技術(shù)［36］、活體成像技術(shù)［37］、聚合酶鏈反應(yīng)分析［37-38］以及流式細胞術(shù)［39-40］等方式開展相關(guān)研究。若對EV 標(biāo)記進行體內(nèi)示蹤，則必須考慮染料等標(biāo)記方式對EV 組分功能的影響［7］，且需排除游離染料本身信號的風(fēng)險［37］，可綜合運用一種或多種合適的細胞追蹤方法，并進行必要的驗證。

當(dāng)采用EV 作為藥物載體時，參考國家藥品監(jiān)督管理局2021 年8 月頒布的《納米藥物非臨床藥代動力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》和2008 年頒布的《化學(xué)藥品注射劑基本技術(shù)要求（試行）》中特殊注射制劑（如脂質(zhì)體、微球、微乳等）的要求，盡量解析載藥粒子和裝載藥物等多種形態(tài)成分在體內(nèi)的相互關(guān)系。如為改良型生物制品，建議進行普通注射劑型和EV 載體藥物的比較藥代動力學(xué)研究，根據(jù)研究結(jié)果確定如何開展進一步的毒理研究。

4.4非臨床安全性研究 目前國內(nèi)尚無EV 相關(guān)產(chǎn)品的非臨床研究指導(dǎo)性文件，但因EV 主要來源于細胞，當(dāng)EV 作為治療藥物時，臨床前試驗設(shè)計需參考細胞治療產(chǎn)品相關(guān)指導(dǎo)原則要求［41-42］，若同時存在基因編輯操作，則兼具了基因治療產(chǎn)品特點，還需參考基因治療產(chǎn)品相關(guān)指導(dǎo)原則［43-45］進行臨床前研究設(shè)計。當(dāng)EV 作為藥物載體時，除EV 本身關(guān)注因素外，還需參考化學(xué)藥或生物制品相關(guān)指導(dǎo)原則，針對包載藥物本身的特點制定基于包載藥物的臨床前研究策略，可參考國家藥品監(jiān)督管理局2021 年8 月頒布的《納米藥物非臨床安全性研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》。

與細胞和基因治療產(chǎn)品相同，EV 的非臨床安全性研究同樣應(yīng)盡量遵從《藥物非臨床研究質(zhì)量管規(guī)范》（GLP）。對于某些在非GLP 狀況下開展的研究或檢測，應(yīng)予說明并評估非GLP 對試驗結(jié)果可靠性、完整性及對產(chǎn)品總體安全性評價的影響。

非臨床安全性研究主要包括一般毒性研究（以常規(guī)毒理學(xué)檢測終點為主要觀察指標(biāo)的單次給藥和／或多次給藥毒性研究），以心血管、呼吸和中樞神經(jīng)系統(tǒng)為主的安全藥理研究，制劑安全性研究，以及遺傳和生殖毒性研究等。

一般毒性研究選擇毒理學(xué)終點時，除應(yīng)包含常規(guī)毒理學(xué)評價終點外，還需關(guān)注免疫原性和免疫毒性風(fēng)險。雖然在EV 治療中尚未研究或觀察到潛在致命反應(yīng)細胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome，CRS），但在基于EV的癌癥免疫治療中，CRS應(yīng)被考慮在內(nèi)。EV 攜帶的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等組分也可能引入免疫原性和免疫毒性風(fēng)險，在臨床前研究階段同樣需適當(dāng)關(guān)注。建議在非臨床研究階段重點觀察相關(guān)的免疫指標(biāo)，包括血液學(xué)（含白細胞分類）、免疫細胞表型分型、血清球蛋白水平、詳細的免疫器官組織病理學(xué)檢查和淋巴器官稱重等。若上述研究發(fā)現(xiàn)明顯異常，還應(yīng)考慮進行進一步的免疫功能試驗以明確其作用的機理，為臨床研究方案的設(shè)計提供重要參考。此外，不同于親本細胞，EV 本身不能在體內(nèi)增殖分化，但可能攜帶了較為復(fù)雜的親本細胞的遺傳信息，可能具有潛在的致瘤風(fēng)險，除需關(guān)注親本細胞本身的成瘤／致瘤性風(fēng)險外，還需在EV 安全性評價中重點關(guān)注體內(nèi)試驗中異常／異位增生性病變（如增生、腫瘤）發(fā)生情況，初步評估其致瘤性風(fēng)險。如目前備受關(guān)注的環(huán)狀RNA（circRNA）已被證明廣泛存在于EV［46］，circRNA具有獨立于親本mRNA的生理和病理功能，其治療機制為體內(nèi)目標(biāo)circRNA分子的過表達或敲低［47］?；贓V 的治療需關(guān)注circRNA 過表達產(chǎn)生潛在的錯誤剪接副產(chǎn)物（包括同源線性RNA）的風(fēng)險，以及通過RNA 干擾（RNA interference，RNAi）方法敲除circRNA 對線性同源基因或其他基因的影響［47］。

5 小結(jié)與展望

EV 應(yīng)用前景十分廣闊，未來的發(fā)展應(yīng)集中在輔助現(xiàn)有治療方法上，完善現(xiàn)有療法的不足。最近，實時和高分辨率顯微鏡技術(shù)結(jié)合創(chuàng)新的EV 標(biāo)記策略和報告系統(tǒng)，為在體內(nèi)生理環(huán)境和單囊泡水平研究EV 提供了新工具［48］。目前基于EV 的治療作為藥物或醫(yī)療技術(shù)的研發(fā)進程尚處于起步階段，距離工業(yè)化生產(chǎn)并成功應(yīng)用于臨床尚有很長一段距離。開發(fā)和完善EV 的表征和表型檢測技術(shù)，研究外泌體結(jié)構(gòu)和組成，優(yōu)化生產(chǎn)工藝，減少組成的異質(zhì)性，將有利于其在疾病診斷和治療中的應(yīng)用?；谀壳凹夹g(shù)水平的限制及對EV 認識的不足，EV 在研究、監(jiān)管、生產(chǎn)、非臨床研究和臨床試驗等方面均還需標(biāo)準(zhǔn)化的規(guī)則。尤其是臨床前研究，尚需各項體內(nèi)和體外試驗來闡明EV 各種生物學(xué)功能的機制，加快推進EV的臨床轉(zhuǎn)化。相信隨著各項技術(shù)的快速發(fā)展，EV 作為無細胞治療方式和新型載藥系統(tǒng)，將具有更廣闊的應(yīng)用前景。