柯薩奇病毒A組6型的研究進(jìn)展

郝曉甜，李克堅(jiān)綜述，周誠(chéng)，毛群穎審校

中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京100050

手足口病（hand-foot-mouth disease，HFMD）是一種由腸道病毒感染引起的常見傳染病，多發(fā)于5 歲以下嬰幼兒，以發(fā)熱和手、足、口腔等部位出現(xiàn)皰疹為主要臨床特征［1-2］。HFMD 通過消化道、呼吸道及直接或間接接觸等方式傳播，多數(shù)患者表現(xiàn)為自限性臨床癥狀，少數(shù)患者會(huì)繼發(fā)肺水腫、心肌炎、腦膜炎等并發(fā)癥，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡［3］。一般認(rèn)為，HFMD主要由腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71）和柯薩奇病毒A 組16 型（Coxsackievirus A16，CVA16）引起［4］。但近年，柯薩奇病毒A組6型（Coxsackievirus A6，CVA6）在全球范圍內(nèi)引起多次HFMD 暴發(fā)或流行，CVA6逐漸成為全球多個(gè)國(guó)家和地區(qū)引起HFMD 的優(yōu)勢(shì)病原體［5-6］。CVA6導(dǎo)致的HFMD常引發(fā)一系列非典型臨床表現(xiàn)，即非典型手足口?。╝typical HFMD，aHFMD），患者皮疹分布范圍更廣泛，如軀干、臀部等部位，且會(huì)出現(xiàn)脫皮、脫甲等癥狀。本文就CVA6 的病原學(xué)、流行病學(xué)、感染后臨床癥狀、實(shí)驗(yàn)室診斷及疫苗相關(guān)研究作一綜述，以期為CVA6 相關(guān)疾病的防控、診斷和治療提供依據(jù)。

1 病原學(xué)

CVA6 屬于小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）腸道病毒屬（Enterovirus），為單股正鏈RNA 病毒［7］。CVA6 基因組全長(zhǎng)約7 400 bp，包含1 個(gè)開放閱讀框（open reading frame，ORF）和2 個(gè)非編碼區(qū)（5'UTR 和3'UTR）。ORF 編碼1 個(gè)多聚前體蛋白，可進(jìn)一步水解為P1～P3 3 個(gè)前體蛋白。P1 編碼4 種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1～VP4），P2 和P3 編碼7 種非結(jié)構(gòu)蛋白（2A～2C和3A～3D）［8］。4 種結(jié)構(gòu)蛋白中，VP4 位于病毒粒子外殼的內(nèi)側(cè)與病毒核心緊密連接，VP1、VP2、VP3 分布在病毒顆粒表面，包含了主要的抗原決定簇，其中，VP1 是識(shí)別、鑒定病毒的重要區(qū)域，可作為不同血清型分類的依據(jù)［5］。

2 流行病學(xué)

2.1流行概況

CVA6 原型株為Gdula 株，于1949 年在美國(guó)首次分離。2008 年前，CVA6 感染主要引起皰疹性咽峽炎［9］。自2008 年芬蘭首次報(bào)道了CVA6 感染引發(fā)HFMD 以來［10］，歐洲、美洲、亞洲均出現(xiàn)多次由CVA6引起的HFMD暴發(fā)或流行。

2.1.1歐洲 2010—2012年，西班牙發(fā)生多起HFMD暴發(fā)及散發(fā)流行，80 份HFMD 或非典型皮疹患者的臨床樣本中，柯薩奇病毒（Coxsackievirus，CV）陽性樣本為53 份，CVA6 陽性樣本占60.0%［11］。2014 及2015 年，法國(guó)暴發(fā)大規(guī)模HFMD 疫情，CVA6 陽性樣本分別占CV 陽性樣本的28.4%和53.9%［12］。2014年，英國(guó)愛丁堡報(bào)告1 起與CVA6 相關(guān)的aHFMD，共16例感染者［13］。

2.1.2美洲 2011—2012年，美國(guó)發(fā)生大規(guī)模HFMD流行，34份CV陽性臨床樣本中，CVA6陽性率為73.5%［14］。2011—2013 年，古巴發(fā)現(xiàn)35 例HFMD 患者，收集獲得11 份CV 陽性標(biāo)本，其中9 份檢出CVA6，2 份檢出EVA71［15］。2015 年，阿根廷發(fā)現(xiàn)兩組由CVA6 感染引起的aHFMD病例（包括來自丘布特省的14例患者及來自圣路易斯省的12 例患者），這是阿根廷也是南美洲首次報(bào)告CVA6感染與aHFMD相關(guān)［16］。

2.1.3亞洲 2008 年，新加坡暴發(fā)了史上最大規(guī)模HFMD 疫情，共有29 686例感染者，收集的51份臨床標(biāo)本中，CVA6和CVA10感染者共占35.3%［17］。2012年，泰國(guó)暴發(fā)大范圍HFMD，CVA6 陽性患者占HFMD 患者的32.9%［18］。2011—2015 年，越南3 家醫(yī)院收治的HFMD 患者中，CVA6 檢出率占23.0%［19］。1 項(xiàng)對(duì)日本大阪市HFMD 病原分析發(fā)現(xiàn)，2011 年，CVA6 開始成為主要病原體，2011、2013、2015 年CVA6 陽性檢出率分別為57.1%、42.9%、64.0%［20］。

近年，中國(guó)發(fā)生多起CVA6引起的HFMD暴發(fā)或流行。2013年，吉林省長(zhǎng)春市暴發(fā)HFMD疫情，CVA6檢出率達(dá)66.9%［21］。2013—2017 年，天津市HFMD病例中，CVA6陽性率為29.6%，超過EVA71和CVA16，表明CVA6 已成為天津市HFMD 的優(yōu)勢(shì)病原體［22］。2011—2018年，上海市金山區(qū)采集HFMD 病例標(biāo)本顯示，自2014 年起，CVA6 逐漸成為優(yōu)勢(shì)病原，2018年占病原學(xué)構(gòu)成的85.4%［23］。2017—2019年，廣東省HFMD 普通病例中，CVA6 感染率分別為57.1%、23.0%、47.4%［24］。另外，浙江、云南、黑龍江、新疆、福建及澳門等地均出現(xiàn)與CVA6 感染相關(guān)的HFMD疫情［25-30］。

2.2分子流行病學(xué) 目前，國(guó)際上對(duì)CVA6 的分型尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，主要是利用VP1 區(qū)進(jìn)行分型。ANH等［19］根據(jù)VP1 序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，將CVA6 分為A ～F 6 個(gè)基因型。SONG 等［31］對(duì)CVA6 中國(guó)毒株（807株）和國(guó)際毒株（19株）VP1序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，CVA6 可分為A～D 4 個(gè)基因型，并可進(jìn)一步細(xì)分為B1～B2、C1～C2 和D1～D3 亞型，其中D3 亞型是近年來中國(guó)大陸流行的主要型別。2009 — 2015年，HE 等［29］對(duì)廈門CVA6 毒株及與國(guó)內(nèi)外其他地區(qū)參考毒株VP1 序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示，CVA6可分為4 種基因型（A～D），D型可分為D1～D5亞型，中國(guó)大陸以D5亞型為主。LIU等［32］通過對(duì)HFMD樣本獲得的101 個(gè)CVA6 VP1 全長(zhǎng)序列及從NCBI 中獲取的200 個(gè)CVA6 VP1 序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，結(jié)果顯示，CVA6 同樣可分為A～D 4 個(gè)基因型，B 型分為B1 和B2 亞型，D 型分為D1～D3 亞型，2008 年后，全球范圍流行株主要為D3亞型。

3 臨床癥狀

CVA6 感染兒童的臨床癥狀多表現(xiàn)皰疹性咽峽炎和HFMD。另外，CVA6 感染可引起濕疹惡化、水痘-帶狀皰疹、附睪炎等癥狀［33］。在某些情況下，CVA6 感染也可導(dǎo)致重癥腦膜炎和腦炎。與EVA71和CVA16 不同，CVA6 不僅容易感染兒童，免疫功能正常的成年人也有較高的感染率，且多表現(xiàn)為aHFMD［34］。以色列報(bào)道5 例感染CVA6 的成年病例均出現(xiàn)發(fā)熱和嚴(yán)重的血管炎樣皮疹等癥狀［35］。意大利10 例成年人因接觸患兒感染CVA6 導(dǎo)致HFMD，其中1 例患者出現(xiàn)脫甲癥和附睪炎［36］。另外，美國(guó)報(bào)道1例65歲成人感染CVA6引起急性心肌炎［37］。

4 實(shí)驗(yàn)室診斷

4.1診斷方法

4.1.1病毒分離培養(yǎng) 病毒分離培養(yǎng)是病毒感染性疾病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，通常采用傳統(tǒng)的細(xì)胞病變法進(jìn)行。2008 年，新加坡學(xué)者將HFMD 患者標(biāo)本接種至人橫紋肌肉瘤細(xì)胞，獲得了CVA6 陽性分離株［17］。但該方法費(fèi)時(shí)、耗力，且與EVA71和CVA16相比，CVA6在培養(yǎng)細(xì)胞中生長(zhǎng)較差，該方法較難分離出CVA6，不適合臨床的快速檢測(cè)［38］。

4.1.2血清學(xué)檢測(cè) 血清學(xué)檢測(cè)是CV 診斷的常規(guī)方法，主要包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和中和抗體試驗(yàn)。ELISA法主要用于檢測(cè)病毒的抗原和抗體，通常采用患者急性期和恢復(fù)期血清的滴度來判斷，抗體滴度升高大于4 倍時(shí)，證明病毒感染［39］。中和抗體試驗(yàn)是將健康人或患者血清與CV 標(biāo)準(zhǔn)株中和，測(cè)定抗體水平，但抗體中和時(shí)間較長(zhǎng)。有研究表明，假病毒中和抗體檢測(cè)方法具有安全、高效、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，適用于高通量的中和抗體檢測(cè)試驗(yàn)，可用于CVA6疫苗效價(jià)的評(píng)估和流行病學(xué)監(jiān)測(cè)［40-41］。

4.1.3分子生物學(xué)檢測(cè) 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）具有簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，已成為CV 診斷的重要手段。有研究建立了一種可同時(shí)檢測(cè)CVA6和CVA10兩種病原體的雙重RT-PCR 法，該方法具有簡(jiǎn)單、快速、高效的特點(diǎn)，有望應(yīng)用于常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室診斷［42］。另外，基因芯片技術(shù)和高通量測(cè)序技術(shù)作為新的病原學(xué)檢測(cè)手段，具有較高的靈敏度，也可用于CVA6診斷，但檢測(cè)成本較高［43-44］。

4.2診斷試劑 國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上CVA6 診斷試劑主要為核酸檢測(cè)試劑。目前，共有6 家CVA6 核酸檢測(cè)試劑生產(chǎn)企業(yè)已完成注冊(cè)，均為PCR-熒光探針法，其中1家生產(chǎn)CVA6核酸檢測(cè)試劑盒，4家生產(chǎn)CVA6／CVA10型核酸檢測(cè)試劑盒，另外1家生產(chǎn)CV通用型、EVA71和CVA16 型／10 型／6 型核酸檢測(cè)試劑盒［45］。另外，還有多家企業(yè)處于產(chǎn)品研發(fā)階段。由于尚無CVA6國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以上企業(yè)均采用企業(yè)參考品進(jìn)行性能驗(yàn)證。中國(guó)食品藥品檢定研究院先后研制了EVA71 和CVA16 核酸檢測(cè)試劑國(guó)家參考品，用于相關(guān)試劑的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)。因此，亟需研制CVA6 核酸檢測(cè)試劑國(guó)家參考品，用于CVA6、CVA6／CVA10 型及CV 通用型核酸檢測(cè)試劑盒中CVA6項(xiàng)目的檢驗(yàn)。

5 疫苗相關(guān)研究

疫苗是預(yù)防傳染病的最重要措施之一，目前尚無針對(duì)CVA6 引起HFMD 疫苗上市的報(bào)道［46］。因此，研發(fā)疫苗是預(yù)防和控制CVA6感染的重要途徑之一。

5.1動(dòng)物模型 動(dòng)物模型是疫苗有效性評(píng)價(jià)的重要工具，建立一個(gè)可穩(wěn)定呈現(xiàn)人類臨床癥狀甚至可導(dǎo)致死亡的動(dòng)物模型可極大促進(jìn)疫苗的研發(fā)及應(yīng)用［47］。目前，用于CV 疫苗評(píng)價(jià)的動(dòng)物模型大多采用小鼠模型。YANG 等［48］利用CVA6／141 毒株攻擊1 日齡BALB／c乳鼠，乳鼠出現(xiàn)了消瘦、后肢癱瘓甚至死亡等臨床癥狀，病理檢查顯示，CVA6 對(duì)骨骼肌和皮膚有特殊的趨向性，CVA6對(duì)皮膚的強(qiáng)烈趨向性與嬰兒的臨床特征相近。ZHANG等［49］用CVA6／WF057R毒株感染5 日齡ICR 乳鼠，乳鼠出現(xiàn)體重減輕、四肢癱瘓等癥狀。WU 等［50］選擇4 周齡BALB／c 小鼠建立了可視化假病毒感染模型，可直接通過活體成像觀察病毒的分布情況及評(píng)價(jià)疫苗免疫效果。綜上所述，動(dòng)物模型將為未來研究CVA6疫苗提供有利工具。

5.2疫苗研究 目前，針對(duì)CVA6 疫苗的研究主要包括滅活疫苗和病毒樣顆粒（virus-likeparticles，VLPs）疫苗。由于HFMD 主要致病血清型的不斷變化，對(duì)HFMD 疫苗提出新的需求，研制高效的多價(jià)HFMD疫苗受到廣泛關(guān)注［51］。

ZHANG等［52］研究證實(shí)，經(jīng)皮下注射CVA6／CVA10二價(jià)全病毒滅活疫苗可使新生小鼠出現(xiàn)抗原特異性的全身免疫反應(yīng)，從而誘導(dǎo)主動(dòng)免疫。LIM 等［53］使用不同滅活方法制備了CVA6／CVA10／CVA16 三價(jià)滅活疫苗，并進(jìn)行了免疫原性評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，CV多價(jià)疫苗可作為HFMD 候選疫苗。SHEN 等［54］利用共表達(dá)CVA6 P1和3CD 的桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞制備了CVA6 重組VLPs 疫苗，該疫苗免疫小鼠后能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生高效價(jià)抗體，可保護(hù)小鼠免受CVA6 的感染。在此基礎(chǔ)上，該團(tuán)隊(duì)還構(gòu)建了EV71／CVA16／CVA6／CVA10 四價(jià)VLPs 疫苗，該疫苗免疫小鼠后的免疫血清可對(duì)4 種病毒的單一或混合感染提供有效的保護(hù)作用，表明四價(jià)VLPs 疫苗是一種有前景的廣譜HFMD候選疫苗［55］。

6 小結(jié)與展望

CVA6已成為引發(fā)HFMD 的主要病原體之一，易導(dǎo)致嬰幼兒及成人HFMD 的流行，對(duì)HFMD 的防控提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。目前針對(duì)CVA6 感染的抗病毒藥物及疫苗的相關(guān)基礎(chǔ)研究較少［56］。因此，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)HFMD病原學(xué)監(jiān)測(cè)，關(guān)注CVA6致病性和流行病學(xué)特征，并盡快研制CVA6診斷試劑用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及開展CVA6 疫苗和藥物的研發(fā)，為CVA6 相關(guān)疾病的防控、診斷和治療提供保障。