土茯苓含量測定分離度和理論板數(shù)的調(diào)整

北京市東城區(qū)藥品檢驗所（100027）趙希賢 尤立華 楊秉呼 侯揚 葉萌 楊燕寧 聶然

在藥品檢驗含量測定時，高效液相色譜法是常用的方法，藥品標準在含量測定項下對理論板數(shù)有明確規(guī)定；《中國藥典》附錄高效液相色譜法中對分離度也有規(guī)定，“除另有規(guī)定外，待測組分與相鄰共存物之間的分離度應大于1.5?！边@些規(guī)定保證了待測成分測定結(jié)果的準確。但由于色譜柱的長期使用，柱效降低，或者樣品中成分復雜，某些成分變化，待測成分經(jīng)過色譜柱后與其他成分不能完全分離，導致理論板數(shù)或分離度不符合規(guī)定。筆者在測定土茯苓藥材落新婦苷的含量時，針對待測成分落新婦苷與其他成分不能完全分離、理論板數(shù)低的情況，按照《中國藥典》規(guī)定，對高效液相色譜的流速、柱溫、進樣量等進行調(diào)整，采用不同品牌的色譜柱進行比較，測定結(jié)果表明，色譜條件中如果選擇合適的流速、柱溫、進樣量，可改變待測成分的保留時間（tR），提高理論板數(shù)（N）、分離度（N）等，使之符合要求，保證了測定結(jié)果的準確可靠。

1 儀器與試藥

WATERS2695液相色譜儀；落新婦苷對照品（批號：111798-201102）；土茯苓對照藥材（批號：121439-200401，由中國藥品生物制品檢定所提供）；試劑為分析純，甲醇為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 土茯苓中落新婦苷的含量測定方法色譜條件、對照品溶液制備及供試品溶液制備采用《中國藥典》土茯苓[含量測定]項下方法。

附表1 不同品牌色譜柱對保留時間、分離度、理論板數(shù)的影響

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.1%冰醋酸溶液（39∶61）為流動相；檢測波長為291nm。理論板數(shù)按落新婦苷峰計算應不低于5000。

2.1.2 對照品溶液的制備 取落新婦苷對照品適量，精密稱定，加60%甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取本品粉末（過二號篩）約0.8g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入60%甲醇100ml，稱定重量，加熱回流1h，放冷，再稱定重量，用60%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 不同品牌色譜柱對保留特性的影響 采用不同品牌色譜柱進行測定，色譜柱分別為DiscoveryC18（150mm×4.6mm，5μm）和WondasilC18（150mm×4.6mm，5μm），進樣量為10μL，流速為0.7ml/min，柱溫為30℃，按照土茯苓中落新婦苷的含量測定方法，測定保留時間、分離度、理論板數(shù)，數(shù)據(jù)結(jié)果見附表1。

附表2 不同流速對保留時間、分離度、理論板數(shù)的影響

附表3 不同進樣量對分離度、理論板數(shù)的影響

附表4 不同柱溫對保留時間、分離度、理論板數(shù)的影響

不同品牌色譜柱在測定土茯苓中的落新婦苷時，保留時間、分離度、理論板數(shù)不相同，其中DiscoveryC18分離度較差，分析原因為此柱已使用較長時間，但理論板數(shù)均符合規(guī)定。

2.3 不同流速對保留特性的影響 采用DiscoveryC18色譜柱，進樣量為10μL，流速分別為0.3ml/min、0.5ml/min、0.7ml/min、1ml/min，柱溫為30℃，按照土茯苓中落新婦苷的含量測定方法，測定保留時間、分離度、理論板數(shù)，數(shù)據(jù)結(jié)果見附表2。

調(diào)整流速可改變測定成分的分離度，流速減少，可使保留時間增加，分離度提高，理論板數(shù)增加，可通過減少流速的辦法提高分離度和理論板數(shù)；但流速的增加與保留時間的減少呈倒數(shù)關(guān)系，流速減少多少倍，保留時間增加相同的倍數(shù)，即減少流速導致測定時間增加。

2.4 不同進樣量對保留特性的影響 采用WondasilC18色譜柱，進樣量分別為1μL、2μL、5μL、10μL、15μL，流速為0.7ml/min，柱溫為30℃，按照土茯苓中落新婦苷的含量測定方法，測定分離度、理論板數(shù)，數(shù)據(jù)結(jié)果見附表3。

進樣量減少，對提高分離度、理論板數(shù)效果不明顯，分離度、理論板數(shù)只是略微提高，分析原因發(fā)現(xiàn)WondasilC18色譜柱為新使用的色譜柱，當更換為使用過一段時間的色譜柱如DiscoveryC18色譜柱進行測定時，分離度改變較大。以流速為0.7ml/min，柱溫30℃，分別測定進樣量為5μL、10μL時的分離度，則進樣量5μL時，分離度達到1.54，符合藥典規(guī)定；而進樣量為10μL時，分離度只有1.47。因此減少進樣量可以提高分離度，尤其是對于使用過一段時間的色譜柱，進樣量的調(diào)節(jié)對分離度影響較明顯。

2.5 不同柱溫對保留特性的影響 采用WondasilC18色譜柱，進樣量為5μL，流速為0.7ml/min，柱溫分別為25℃、30℃、40℃、50℃、60℃，按照土茯苓中落新婦苷的含量測定方法，測定保留時間、分離度、理論板數(shù)，數(shù)據(jù)結(jié)果見附表4。

柱溫不同，可顯著改變待測成分的保留時間、分離度與理論板數(shù)。柱溫升高，保留時間減少，分離度降低，理論板數(shù)升高（柱溫60℃時待測成分因與別的峰合在一起，峰寬加大而致理論板數(shù)降低），因此，若欲提高分離度可采用降低柱溫的方法，而欲提高理論板數(shù)可采用升高柱溫的方法。

3 討論

測定土茯苓中落新婦苷的含量[1][2]，調(diào)整色譜條件，流速和柱溫對保留時間、分離度、理論板數(shù)影響較大，進樣量多少對于新使用的色譜柱的分離度影響較小，對使用過一段時間的色譜柱影響稍大。因此當測定土茯苓中落新婦苷的含量時，如果分離度低，不符合規(guī)定，可采用降低柱溫，降低流速，減少進樣量等方法，改善分離度；如果理論板數(shù)低，不符合規(guī)定，可采用升高柱溫，降低流速的方法，可顯著增加理論板數(shù)。

在實際檢驗時，更換色譜柱可解決分離度問題。但更換色譜柱缺點較多，不僅增加了換柱平衡所需的時間，且需多備色譜柱，增加檢驗成本，增加沖洗色譜柱的有機溶劑。所以多選擇調(diào)整柱溫、流速、進樣量的方法，使分離度、理論板數(shù)符合規(guī)定。

《中國藥典》附錄高效液相色譜法規(guī)定：正文中各品種項下規(guī)定的條件除固定相種類、流動相組成、檢測器類型不得任意改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長度、固定相牌號、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組成的比例、柱溫、進樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當改變，以適應具體的色譜系統(tǒng)并達到系統(tǒng)適用性試驗的要求。因此在實際檢驗工作中，可通過調(diào)整高效液相色譜條件，獲得滿意的保留時間、分離度和理論板數(shù)，更好地提高檢驗效率，保證檢驗結(jié)果的準確。