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    太平猴魁茶栽培品種‘柿大茶’品系間代謝物及遺傳進(jìn)化分析

    2023-08-05 09:04:54周漢琛劉亞芹楊霽虹徐玉婕雷攀登
    食品科學(xué) 2023年14期
    關(guān)鍵詞:芳樟醇兒茶素品系

    周漢琛,劉亞芹,王 輝,楊霽虹,徐玉婕,雷攀登

    (安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所,安徽 黃山 245000)

    ‘柿大茶’是我國著名的有性系茶樹品種,由其嫩梢加工的太平猴魁綠茶花香明顯,且滋味醇厚鮮爽,品質(zhì)優(yōu)異。揮發(fā)性物質(zhì)分析顯示醇類化合物在太平猴魁綠茶中的含量較高(相對(duì)含量可達(dá)到36%~62%),比如芳樟醇、芳樟醇氧化物、香葉醇及2-乙基-1-己醇等[1]。研究顯示,蘭花香的重要貢獻(xiàn)者茉莉酮酸甲酯及其異構(gòu)體在太平猴魁綠茶中含量豐富,對(duì)太平猴魁綠茶的花香貢獻(xiàn)較大[2]。新近研究顯示,‘柿大茶’品種加工的太平猴魁綠茶,與非‘柿大茶’茶樹品種加工的綠茶在香氣品質(zhì)、揮發(fā)物含量上均有較大差異[3],即‘柿大茶’品種加工的太平猴魁綠茶的香氣品質(zhì)更優(yōu)異。此外,研究還表明不同‘柿大茶’品系加工的綠茶,在香氣品質(zhì)上也存在明顯差異[3],推測(cè)‘柿大茶’不同品系間存在遺傳多樣性,使得次級(jí)代謝產(chǎn)物積累有差異。前期研究即表明,‘柿大茶6號(hào)’、23號(hào)綠茶香氣、滋味品質(zhì)顯著優(yōu)于‘柿大茶7號(hào)’品系綠茶[4]。不同產(chǎn)地的‘太平猴魁’綠茶在表兒茶素(epicatechin,EC)、沒食子兒茶素(gallocatechin,GC)、咖啡堿、表沒食子兒茶素(epigallocatechin,EGC)含量分布上也存在差異[5]。簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat,SSR)分析表明,‘柿大茶’群體種中具有相對(duì)較高的遺傳多樣性[6]。

    茶葉品質(zhì)與茶樹品種、栽培管理及加工工藝密切相關(guān)[7-10]。優(yōu)良茶樹品種的選育對(duì)茶葉品質(zhì)的提升至關(guān)重要。‘柿大茶’茶樹品種嫩梢持嫩性較強(qiáng),由其加工的太平猴魁綠茶,外形蒼綠、壯實(shí);香氣、滋味品質(zhì)俱佳(圖1)。為獲得較為優(yōu)異的‘柿大茶’品種,當(dāng)?shù)貙?duì)加工成品茶品質(zhì)較為優(yōu)異的‘柿大茶’單株進(jìn)行了扦插與培育。目前較優(yōu)異的‘柿大茶’品系有‘高家早’(gaojiazao,GJZ)、‘黃種’(huangzhong,HZ)、‘柿大茶2號(hào)’(shidacha No.2,SDC2)、‘柿大茶6號(hào)’(shidacha No.6,SDC6)、‘廣陽早’(guangyangzao,GYZ)等(圖1)。‘鳧早2號(hào)’(fuzao No.2,F(xiàn)Z2)為無性系茶樹品種,從祁門楊樹林群體種中選育而來;‘舒茶早’(shuchazao,SCZ)茶樹品種選育于安徽舒城群體種。目前這兩個(gè)無性系品種在黃山茶區(qū)栽種較為廣泛,在黃山市黃山區(qū)(太平猴魁綠茶主產(chǎn)區(qū))也有一定栽種面積。已有研究表明不同‘柿大茶’品系加工綠茶存在差異,使得太平猴魁綠茶品質(zhì)不穩(wěn)定。本研究擬基于揮發(fā)性與非揮發(fā)性代謝物分析,結(jié)合RNA-seq測(cè)序分析技術(shù),研究不同‘柿大茶’品系間、‘柿大茶’與非‘柿大茶’品種間的物質(zhì)基礎(chǔ)及遺傳背景差異,旨在為后續(xù)‘柿大茶’優(yōu)異品種選育提供理論參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    ‘柿大茶’品系來源于黃山市猴坑村品種園,包含GJZ、HZ、SDC2、SDC6及GYZ;非‘柿大茶’茶樹品種FZ2和SCZ來源于安徽省農(nóng)科院茶葉研究所商山基地。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析時(shí),采取4月份一芽二葉嫩梢并立即置于干冰中,后貯存在-80 ℃冰箱,用于后續(xù)分析。

    正構(gòu)烷烴(C5~C20)美國Sigma 公司;試劑A(Buffer A-1,0.12 mol/L,pH 2.9)、試劑B(Buffer B-1,0.3 mol/L,pH 4.2)、試劑C(Buffer C-4,0.3 mol/L,pH 8.0)、試劑D(500 mmol/L NaOH,0.68 mmol/L EDTA)德國賽卡姆公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    57348-U 50/30 μm DVB/CAR/PDMS纖維頭 德國默克公司;7697A-7890A氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)聯(lián)用儀、DB-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)、液相色譜柱InfintyLab Proshell 120 SB-C18(150 mm×4.6 mm,2.7 μm)美國Agilent公司;LC-2010高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)儀 日本島津公司;433D氨基酸分析儀 德國賽卡姆公司。

    1.3 方法

    1.3.1 綠茶樣品前處理

    綠茶加工中的鮮葉原料來源于黃山市黃山區(qū)(太平猴魁綠茶主產(chǎn)區(qū));7 個(gè)茶樹品種(品系)栽種地理位置相對(duì)一致。依據(jù)太平猴魁綠茶加工標(biāo)準(zhǔn)(DB 34/T 258—2012《太平猴魁茶工藝規(guī)程》)將7 個(gè)品種嫩梢制成綠茶樣,主要步驟如下:摘取一芽二三葉嫩梢于室內(nèi)攤放4~6 h;深鍋殺青3~4 min后手工捏尖、理?xiàng)l、壓制;毛火100 ℃、9~10 min;足火70 ℃、30 min;三烘85 ℃、20 min。綠茶樣貯藏于-20 ℃冰箱,用于后續(xù)代謝物分析。

    1.3.2 感官審評(píng)

    由6 位審評(píng)專家依據(jù)國家茶葉審評(píng)標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 23776—2018《茶葉感官審評(píng)方法》)中的綠茶審評(píng)辦法對(duì)7 個(gè)綠茶樣的香氣、滋味品質(zhì)進(jìn)行描述與評(píng)分。具體步驟如下:準(zhǔn)確稱取3.0 g茶樣,于150 mL 98 ℃水中沖泡4 min后,倒出茶湯,其中葉底用于香氣品質(zhì)審評(píng),茶湯用于滋味審評(píng)。香氣、滋味品質(zhì)審評(píng)采用百分制:綠茶具有鮮醇、醇厚鮮爽、濃醇鮮爽等滋味品質(zhì)特征,得分范圍為90~99;尚醇厚、清爽品質(zhì)特征得分范圍為80~89;濃澀、青澀、欠醇品質(zhì)特征得分范圍為70~79。香氣評(píng)價(jià)中,具有嫩香、花香等品質(zhì)特征得分范圍為90~99;清香、尚高爽品質(zhì)特征得分范圍為80~89,而具有尚純、熟悶等香氣品質(zhì)特征的綠茶得分范圍為70~79。

    1.3.3 揮發(fā)性化合物測(cè)定

    采用頂空固相微萃?。╤eadspace-solid phase microextraction,HS-SPME)對(duì)7 個(gè)綠茶樣中的香氣進(jìn)行吸附[3,11]。同時(shí)為探究茶湯中花香類化合物含量差異,參照Flaig等[12]研究方法,以1∶50(茶水比)配制茶湯,冷卻至室溫后取10 mL茶湯利用50/30 μm DVB/CAR/PDMS纖維頭于40 ℃水浴吸附40 min。每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

    G C-M S 檢測(cè)條件:D B-5 M S 色譜柱(30 m× 0.25 mm,0.25 μm);進(jìn)樣口溫度260 ℃;不分流。SPME纖維頭吸附結(jié)束后立即于進(jìn)樣口解吸附5 min,升溫程序如下:初始溫度為40 ℃并保留5 min,后以 4 ℃/min速率升到200 ℃并保留2 min,再以10 ℃/min速率升到280 ℃并保留5 min。載氣為高純氦氣(>99.99%),載氣流速為1 mL/min。離子源溫度為為230 ℃;四極桿溫度為150 ℃;電子能量為70 eV;質(zhì)量掃描范圍為30~600 u。

    化合物鑒定采用保留指數(shù)法,即利用正構(gòu)烷烴計(jì)算化合物保留指數(shù),并與NIST數(shù)據(jù)庫(https://webbook.nist.gov/chemistry/)進(jìn)行比對(duì),定性化合物?;衔锒坎捎脴悠分谢衔锓迕娣e與標(biāo)準(zhǔn)品峰面積之比計(jì)算含量(μg/kg或μg/L)。

    1.3.4 兒茶素、咖啡堿含量分析

    準(zhǔn)確稱取0.25 g綠茶樣,加入8 mL沸水;90 ℃水浴7 min后收集茶湯。此步驟重復(fù)提取3 次后混合茶湯提取液,并利用超純水稀釋4 倍。采用0.22 μm水系膜過濾茶湯后,用于HPLC。每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

    HPLC條件:InfintyLab Proshell 120 SB-C18(150 mm× 4.6 mm,2.7 μm);流動(dòng)相A為0.04%磷酸溶液;流動(dòng)相B為乙腈;流動(dòng)相C為甲醇;流速為1.0 mL/min;檢測(cè)波長為280 nm;柱溫箱溫度為40 ℃。洗脫條件:0~1 min,90% A,7.5% B,2.5% C;1~23 min,85% A,11.2% B,3.8% C;23~23.1 min,15% A,85% B;23~35 min,15% A,85% B;35~50 min,90% A,7.5% B,2.5% C;50~60 min,90% A,7.5% B,2.5% C。

    兒茶素類物質(zhì)和咖啡堿定性鑒定依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間;化合物定量(mg/g)依據(jù)已繪制的兒茶素物質(zhì)、咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。

    1.3.5 游離氨基酸含量測(cè)定

    參考文獻(xiàn)[4,13]方法,采用氨基酸分析儀測(cè)定茶湯樣品中游離氨基酸。樣品配制與兒茶素分析中的提取、稀釋方法一致。每個(gè)樣品重復(fù)3 次。色譜柱為LCA K07/Li(150 mm×4.6 mm);流動(dòng)相和衍生相流速分別為0.45 mL/min和0.25 mL/min。試劑A、試劑B、試劑C和試劑D用于流動(dòng)相分析。茚三酮緩沖液(1 L:20 g茚三酮,600 mL甲醇,400 mL鉀鈉緩沖液)。流動(dòng)相梯度:0~1 min,80% A,20% B;1~3 min,79% A,21% B;3~8 min,61% A,39% B;8~20 min,43% A,57% B;20~24 min,43% A,57% B;24~36 min,100% B;36~42 min,100% C;42~47 min,76% C,24% D;47~61 min,76% C,24% D;61~61.1 min,100% D;61.1~68 min,100% D;68~68.1 min,100% A;68.1~84 min,100% A。檢測(cè)波長分別為570 nm和440 nm。

    游離氨基酸定性以標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間為基準(zhǔn);化合物定量(mg/g)以樣品中的峰面積與標(biāo)準(zhǔn)品峰面積之比計(jì)算含量。

    1.3.6 茶樹嫩梢轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析

    7 個(gè)茶樹品種(品系)嫩梢(一芽二葉)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及遺傳進(jìn)化樹分析由廣州基迪奧生物公司完成。主要步驟如下:提取茶樹嫩梢的RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA用于文庫構(gòu)建。測(cè)序平臺(tái)為Illumina Novaseq6000(廣州基迪奧公司)。測(cè)序完成后,通過軟件過濾低質(zhì)量數(shù)據(jù)、去除接頭序列等,以獲得高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。以舒茶早基因組序列(http://tpdb.shengxin.ren/)為參考基因組,利用MUSCLE(http://www.drive5.com/muscle/)分析不同茶樹品種(品系)中基因家族進(jìn)化關(guān)系,構(gòu)建進(jìn)化樹;利用Stringtie重構(gòu)轉(zhuǎn)錄本,并利用RSEM計(jì)算樣本中基因轉(zhuǎn)錄水平。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    利用SPSS 19.0軟件中的Duncan計(jì)算法分析樣品中代謝物積累的差異(P<0.05);利用SIMCA 14.0軟件對(duì)不同茶樹品種(品系)中的代謝物、基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行主成分分析(principal component analysis,PCA)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 感官審評(píng)結(jié)果

    本研究依據(jù)太平猴魁綠茶加工工藝:攤放、殺青、捏尖、壓制、干燥,將以上7 個(gè)茶樹品種(品系)嫩梢加工成綠茶。滋味審評(píng)結(jié)果顯示,‘柿大茶’品系綠茶GJZ、GYZ及非‘柿大茶’品種綠茶FZ2具有鮮醇品質(zhì)特征,滋味感官審評(píng)得分較高;HZ、SDC2、SDC6綠茶滋味鮮爽度不足,得分相對(duì)較低;SCZ綠茶滋味醇厚度、鮮爽度均不足,得分最低。香氣評(píng)審結(jié)果顯示,GJZ、HZ綠茶具有花香品質(zhì)特征,得分較高,其次為SDC2綠茶;FZ2和SCZ品種鮮葉加工的太平猴魁綠茶香氣品質(zhì)有差異,前者香氣品質(zhì)較佳(表1)。

    表1 ‘柿大茶’和非‘柿大茶’茶樹品種綠茶及感官審評(píng)Table 1 Sensory evaluation results of ‘Shidacha’ and non-‘Shidacha’ green tea

    2.2 代謝物分析

    利用HPLC和氨基酸分析儀分析7 種綠茶茶湯中的兒茶素類、咖啡堿及游離氨基酸等主要的非揮發(fā)性組分。結(jié)果表明,酯型兒茶素表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate,ECG)和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)在‘柿大茶’品種綠茶中的含量較高;簡單型兒茶素表兒茶素(epicatechin,EC)、兒茶素(catechin,C)和EGC在‘柿大茶’與非‘柿大茶’綠茶中的差異不明顯;咖啡堿含量在各綠茶中差異較大,其中在SDC2綠茶中含量最高,在GYZ綠茶中含量最低(表2)。除HZ綠茶中的兒茶素類物質(zhì)總量明顯高于其他品種綠茶外,在同一工藝下,各綠茶中兒茶素總量差異較小,比如在GJZ、SDC2、SDC6、GYZ、FZ2綠茶間均未達(dá)到顯著差異(P>0.05)(圖2)。游離氨基酸分析顯示,游離氨基酸總量在‘柿大茶’綠茶HZ中最高,達(dá)到62.47 mg/g,其次為FZ2綠茶(59.02 mg/g);除SCZ綠茶(29.88 mg/g)的氨基酸總量較低外,其他4 個(gè)綠茶(GJZ、SDC2、SDC6、GYZ)中的游離氨基酸總量無顯著差異,分布范圍為42.02~49.97 mg/g。茶氨酸含量在各綠茶中的差異較大,在‘柿大茶’綠茶HZ中含量最高,達(dá)到干質(zhì)量的5%(表2)。

    表2 綠茶中主要滋味成分含量Table 2 Contents of major taste compounds in green tea samplesmg/g

    圖2 花香類化合物在7 個(gè)綠茶茶湯中的含量Fig.2 Contents of floral aroma volatiles in seven tea infusion samples

    分析7 種綠茶中的揮發(fā)性代謝物?;谇捌诘难芯拷Y(jié)果[3],表明‘柿大茶’綠茶中的糖苷類化合物及與逆境脅迫相關(guān)的化合物含量較高,比如香葉醇、芳樟醇、橙花叔醇、吲哚、茉莉酮等。圖2表明,GJZ、HZ、SDC6綠茶中的揮發(fā)性物質(zhì)總量明顯高于其他品種綠茶;FZ2綠茶揮發(fā)性物質(zhì)總量與SDC6綠茶無顯著性差異;SDC2、GYZ、SCZ綠茶中的揮發(fā)性物質(zhì)總量相近,無顯著差異。利用HS-SPME-GC-MS分析綠茶茶湯中花香類的化合物,結(jié)果顯示,糖苷類化合物(芳樟醇氧化物和芳樟醇、香葉醇)在各綠茶茶湯中差異較大,以芳樟醇及其氧化物為例,除GYZ綠茶外,其在‘柿大茶’綠茶茶湯中的含量均較高。與逆境脅迫相關(guān)的花香類化合物分析顯示,吲哚、茉莉酮、橙花叔醇等在香氣得分較高的茶湯中的含量均較高。在感官審評(píng)中SDC2香氣品質(zhì)要優(yōu)于SCZ、GYZ綠茶,而3 個(gè)綠茶中的香氣物質(zhì)總量無顯著性差異。花香類物質(zhì)分析顯示,芳樟醇氧化物、芳樟醇、香葉醇、茉莉酮以及橙花叔醇等在SDC2茶湯中的含量顯著高于GYZ和SCZ。

    2.3 遺傳進(jìn)化分析

    為探究‘柿大茶’品系間、‘柿大茶’與非‘柿大茶’茶樹品種間在遺傳背景上的差異,以7 個(gè)茶樹品種嫩梢為研究對(duì)象,通過RNA-seq技術(shù)分析7 個(gè)茶樹品種鮮葉中的全基因組轉(zhuǎn)錄水平變化。結(jié)果顯示,以全基因組轉(zhuǎn)錄水平為變量進(jìn)行PCA,SCZ、FZ2和GYZ相距較近(以不同象限為準(zhǔn)),為第1組;SDC2和SDC6為第2組,而GJZ和HZ分別單獨(dú)一組(圖3A)。‘柿大茶’品系SDC2和SDC6間的全基因組轉(zhuǎn)錄水平相似度非常高,差異表達(dá)基因較少(差異倍數(shù)大于2,假陽性率<0.05),這表明SDC2和SDC6品系可能來源于相同的‘柿大茶’單株。利用Diamond和OrthoMCL軟件鑒定同源基因以確定基因家族分布情況,結(jié)果顯示,‘柿大茶’茶樹品種基因家族數(shù)量高于非‘柿大茶’茶樹品種?;诤Y選的單拷貝直系同源基因家族構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(圖3B),結(jié)果顯示SDC2和SDC6在同一分枝上,這與全基因組轉(zhuǎn)錄水平分析相一致;GJZ單獨(dú)在一亞分枝上;FZ2和SCZ在同一小亞分枝上;‘柿大茶’品系GYZ和HZ與非‘柿大茶’茶樹品種FZ2和SCZ聚在一個(gè)大亞分枝上。

    圖3 全基因組轉(zhuǎn)錄水平PCA(A)及遺傳進(jìn)化樹構(gòu)建(B)Fig.3 PCA plot (A) and phylogenic tree (B) of seven tea varieties

    2.4 萜類代謝途徑關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)錄水平差異分析

    萜類物質(zhì)是茶樹中重要的一類化合物,尤其是單萜類、倍半萜類化合物,具有較強(qiáng)的揮發(fā)性,對(duì)茶樹響應(yīng)逆境脅迫及成品茶風(fēng)味的形成均具有重要作用,比如芳樟醇、芳樟醇氧化物、香葉醇及橙花叔醇等[14-17]。單萜類物質(zhì)一般是通過質(zhì)體中的2-C-甲基-赤蘚糖醇-4-磷酸(methylerythritol-phosphate,MEP)途徑生成前體物質(zhì)牻牛兒基焦磷酸(geranyl diphosphate,GPP),后續(xù)再由萜類合成酶催化生成;倍半萜類物質(zhì)則是通過細(xì)胞質(zhì)中的甲羥戊酸(mevalonate,MVA)途徑生成前體物質(zhì)法尼烯焦磷酸(farnesyl diphosphate,F(xiàn)PP)[18-19]。通過感官審評(píng)及代謝物分析顯示,‘柿大茶’與非‘柿大茶’茶樹品種綠茶在香氣品質(zhì)上差異明顯,且在揮發(fā)性萜類物質(zhì)積累上存在顯著差異。本研究重點(diǎn)分析了MEP和MVA途徑中的關(guān)鍵酶基因在7 個(gè)茶樹品種中的轉(zhuǎn)錄水平變化,結(jié)果顯示,在MVA途徑中(圖4),AACT基因在茶樹中存在3 個(gè)同源基因(CSS0031828.1、CSS0022458.1、CSS0000979.1),其中AACT1的轉(zhuǎn)錄水平在SCZ、FZ2中較低(FPKM值約為1),在‘柿大茶’品種中的FPKM值約為6~7;AACT3在各個(gè)茶樹品種中的表達(dá)量均較低,且在HZ、GYZ中FPKM值為0;HMGS(CSS0012119.1)、HMGR(CSS0020332.1、CSS0027456.1、CSS0044307.1、CSS0045944.1)、MVK(CSS0041428.1)、PMK(CSS0034538.1、CSS0011945.1)、PMD(CSS0049709.1)等關(guān)鍵酶基因在不同茶樹品種中的轉(zhuǎn)錄水平差異不明顯,其中MVK基因在GJZ、SDC2、SDC6、FZ2品種中的轉(zhuǎn)錄水平較高;基因IDI2(CSS0014154.1)在非‘柿大茶’品種FZ2和SCZ中的表達(dá)量(FPKM值約為23~32)顯著高于‘柿大茶’品種(FPKM值約為1~3)。

    圖4 MVA和MEP途徑中關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)錄水平分析Fig.4 Transcription analysis of key enzyme genes involved in MVA and MEP pathways

    在MEP 途徑中,DXS(CSS 0018056.1)、DXR(CSS0045852.1)、MCS(CSS0021900.1)基因轉(zhuǎn)錄水平在各茶樹品種中的差異不大;CMS(CSS 0021874.1)、CMK(CSS 0004136.1、CSS0031944.1)基因在SCZ、FZ2中的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于‘柿大茶’品系(圖4)。

    2.5 與花香類化合物生物合成相關(guān)的關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)錄水平分析

    通過MVA和MEP途徑中關(guān)鍵酶基因的分析,顯示這兩條通路上的基因轉(zhuǎn)錄水平在‘柿大茶’與非‘柿大茶’品種間的差異不明顯?!链蟛琛贩N綠茶中含有較高含量的花香類化合物,比如香葉醇、芳樟醇、芳樟醇氧化物、橙花叔醇、吲哚、苯乙醇及茉莉內(nèi)酯等。這些花香類化合物的生成與茶樹內(nèi)源次級(jí)代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因表達(dá)密切相關(guān)[20-22]。因此,本研究著重分析了香葉醇、芳樟醇、橙花叔醇、苯乙醇、吲哚及茉莉內(nèi)酯生物合成相關(guān)的關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)錄水平變化。結(jié)果顯示香葉醇合成酶基因CsGES(CsTPS10、CSS0027229.1)在‘柿大茶’品系中的轉(zhuǎn)錄水平(FPKM值約為2~3)顯著低于非‘柿大茶’茶樹品種(FPKM值約為10~11);(R)-芳樟醇合成酶CsRLIS(MT178265)在SDC6中的轉(zhuǎn)錄水平最高,在非‘柿大茶’茶樹品種中的轉(zhuǎn)錄水平均較低,而(S)-芳樟醇合成酶CsSLIS(KF006849.1)在GYZ、FZ2品種中的轉(zhuǎn)錄水平較高,其次為HZ和SCZ。CsTSA(KX022968)和CsTSB2(KX022970)協(xié)同催化底物IGP生成吲哚[21]。轉(zhuǎn)錄水平分析顯示CsTSA在非‘柿大茶’品種中表達(dá)量更高,在‘柿大茶’品系中的表達(dá)量較為一致;CsTSB2在不同茶樹品種中的轉(zhuǎn)錄水平差異較大,在SDC2和SDC6中的轉(zhuǎn)錄水平最高(FPKM值為6),其次為HZ(FPKM值為2),而在非‘柿大茶’品種中該基因的FPKM值較低,約為0.2。CsPAR(MF977691)為苯乙醇生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因,其在非‘柿大茶’茶樹品種FZ2和SCZ中的表達(dá)量較高。茉莉內(nèi)酯生物合成相關(guān)的關(guān)鍵酶基因CsLOX1(EU195885)在各茶樹品種中的表達(dá)量變化較為一致;橙花叔醇合成酶基因CsNES(KY033151)在‘柿大茶’品系中的轉(zhuǎn)錄水平(FPKM值約為18-27)顯著高于FZ2(FPKM值約為12)和SCZ(FPKM值約為8)。

    圖5 與花香類化合物合成相關(guān)的關(guān)鍵酶基因在不同茶樹 品種中的轉(zhuǎn)錄分析Fig.5 Transcription analysis of key enzyme genes involved in the biosynthesis of floral aroma volatiles

    3 討論與結(jié)論

    本研究通過相同工藝將5 個(gè)‘柿大茶’品系及2 個(gè)非‘柿大茶’茶樹品種加工成綠茶,分析揮發(fā)性及非揮發(fā)性代謝物含量變化,同時(shí)基于RNA-seq技術(shù)分析7 個(gè)茶樹品種鮮葉中的全基因組轉(zhuǎn)錄水平。揮發(fā)性代謝物分析顯示,花香類化合物在‘柿大茶’品種綠茶茶湯中含量較高,比如香葉醇、芳樟醇、吲哚、茉莉酮及橙花叔醇等。香葉醇和芳樟醇是茶樹中重要的單萜類化合物,前者具有玫瑰香型,后者具有花香特征,對(duì)綠茶、紅茶的香氣品質(zhì)形成具有重要貢獻(xiàn)[8,23]。香葉醇和芳樟醇都屬于單萜類化合物,由萜類合成酶催化前體物質(zhì)GPP生成。本研究中顯示合成GPP的MEP途徑中的關(guān)鍵酶基因在‘柿大茶’和非‘柿大茶’品種中的轉(zhuǎn)錄水平均較高,且CMK、CMS兩個(gè)關(guān)鍵酶基因在FZ2和SCZ中的轉(zhuǎn)錄水平反而高于‘柿大茶’茶樹品種。后續(xù)通過分析香葉醇合成酶基因CsGES及芳樟醇合成酶基因CsRLS和CsSLS的轉(zhuǎn)錄表達(dá),顯示CsGES在非‘柿大茶’FZ2和SCZ中的轉(zhuǎn)錄水平更高,而芳樟醇合成酶CsRLS在‘柿大茶’品系中的轉(zhuǎn)錄水平普遍更高。CsRLS是負(fù)責(zé)茶樹中(R)-型芳樟醇生物合成的重要功能酶基因[24],且(R)-型芳樟醇香氣閾值較低(約為0.8 μg/L),相比(S)-型芳樟醇(閾值約為7.4 μg/L)更易被人嗅覺感知[25-26]。因此,推測(cè)(R)-型芳樟醇可能是‘柿大茶’品系綠茶花香更顯的重要因素。吲哚、橙花叔醇均具有花香特性,是烏龍茶中重要的呈香化合物[27-28]。本研究結(jié)果顯示合成吲哚的關(guān)鍵酶基因CsTSB2在非‘柿大茶’茶樹品種的中轉(zhuǎn)錄水平極低,推測(cè)是FZ2和SCZ綠茶中吲哚含量較低的原因。

    感官審評(píng)與滋味成分分析表明‘柿大茶’與非‘柿大茶’在滋味品質(zhì)上的差異不突出,比如非‘柿大茶’FZ2綠茶滋味鮮醇,審評(píng)得分顯著高于‘柿大茶’綠茶HZ、SDC2和SDC6。此外,對(duì)兒茶素合成途徑中關(guān)鍵酶基因的分析也表明(結(jié)果未列出),這些通路上的關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)錄水平在7 個(gè)茶樹品種中的差異不顯著。Xia Enhua等[29-30]研究表明,‘中國種’茶樹(Camellia sinensisvar.sinensis)在人工選育干擾下,與揮發(fā)性化合物代謝相關(guān)的基因變異較多,且存在基因復(fù)制事件。本研究中的遺傳進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示,‘柿大茶’品系與非‘柿大茶’品種FZ2和SCZ遺傳背景確實(shí)存在差異。因此,推測(cè)‘柿大茶’茶樹品種在人工選育影響下,某些揮發(fā)性代謝物合成通路的進(jìn)化對(duì)其成品茶香氣品質(zhì)形成較為有利。

    綜上所述,本研究著重分析了‘柿大茶’與非‘柿大茶’茶樹品種遺傳背景的差異和其加工綠茶品質(zhì)及代謝物差異,結(jié)果表明‘柿大茶’在遺傳背景上有別于非‘柿大茶’茶樹品種FZ2和SCZ?!链蟛琛贩N加工的綠茶在香氣品質(zhì)上較為優(yōu)異,與其花香類化合物代謝途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量較高相關(guān)。本研究結(jié)果對(duì)后續(xù)選育優(yōu)異的‘柿大茶’品種有重要指導(dǎo)作用,同時(shí)對(duì)高香類茶樹品種選育提供了理論參考。

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