基于金納米粒子的熒光適配體傳感器檢測食品中的17β-雌二醇

韋慶益，林軒然，張佩瑤，孫大文，蒲洪彬

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，現(xiàn)代食品工程研究中心，廣東省冷鏈?zhǔn)称分悄芨兄c過程控制工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006）

17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）是一種能夠促進(jìn)動(dòng)物生長、提高奶牛產(chǎn)奶量的甾體雌激素，20世紀(jì)80年代以來在畜牧業(yè)中得到了廣泛應(yīng)用，但在2003年被歐盟要求永久禁止在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中使用[1]。許多研究報(bào)道，E2是一種典型的環(huán)境內(nèi)分泌干擾化學(xué)物，存在于不同國家的地表水中，并且乳制品中也含有高量的內(nèi)源性E2[2]。毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，即使低濃度的E2殘留物通過食物鏈進(jìn)入生物體，也會(huì)干擾正常的內(nèi)分泌功能，造成有害影響，如不孕不育、血腦屏障損傷、乳腺癌和睪丸癌發(fā)病率的增加[3-4]。E2在畜牧業(yè)中的應(yīng)用在中國也被禁止，并且國際食品法典委員會(huì)和中國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)均規(guī)定動(dòng)物性食品中不得檢出E2[1]。美國國家環(huán)保局在2012年提出地表水中E2的最大殘留量為1.47 pmol/L，日本也在2015年實(shí)施了新的規(guī)定，將飲用水中的E2限制在0.294 nmol/L[5]。因此，發(fā)展有效的方法靈敏地檢測食品樣品和水環(huán)境中的E2具有重要意義。

迄今為止，基于高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）、氣相色譜、質(zhì)譜等的儀器分析方法已被廣泛應(yīng)用于E2的檢測，其結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確性和靈敏度，然而這些方法需要復(fù)雜的樣品預(yù)處理和專業(yè)的技術(shù)技能[6-8]。此外，基于抗體的免疫方法在E2檢測中具有較高的靈敏度和特異性，然而抗體的產(chǎn)生耗時(shí)，而且易受外界環(huán)境的影響[9]。適配體是一種單鏈DNA或RNA，能與靶標(biāo)進(jìn)行特異性結(jié)合，它作為E2識(shí)別元件的替代品已經(jīng)被開發(fā)的非常有前景[10-11]，其中與熒光方法相結(jié)合的適體傳感器因其靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)受到了研究者的廣泛關(guān)注。碳量子點(diǎn)（carbon quantum dots，CQDs）作為一種新興熒光碳納米材料，具有熒光性能穩(wěn)定、低毒、生物相容性好、易溶于水、易合成和生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于構(gòu)建熒光傳感器對(duì)環(huán)境和食品中的有害物質(zhì)進(jìn)行檢測[12-15]。熒光傳感器常利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）效應(yīng)改變探針的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)RET簡單來說就是當(dāng)熒光供體（此為CQDs）的發(fā)射光譜與猝滅劑的紫外-可見吸收光譜重疊，且CQDs與猝滅劑的距離在10 nm以內(nèi)，處于激發(fā)態(tài)的CQDs就會(huì)將能量轉(zhuǎn)移至處于基態(tài)的猝滅劑，表現(xiàn)出CQDs熒光的猝滅[16]。常見的熒光猝滅劑種類較多，其中金納米粒子（gold nanoparticles，AuNPs）憑借其易于控制的粒徑大小、良好的生物相容性和優(yōu)異的熒光猝滅能力而廣泛用于光學(xué)和生物傳感器之中[17]。

綜上考慮，本實(shí)驗(yàn)擬將CQDs與AuNPs結(jié)合，利用FRET效應(yīng)構(gòu)建一種熒光適體傳感器用于E2的檢測。首先通過酰胺反應(yīng)將E2的短鏈適配體P1連接在CQDs上，AuNPs加入后適配體會(huì)與AuNPs靠近，從而觸發(fā)CQDs與AuNPs間的FRET效應(yīng)，導(dǎo)致CQDs的熒光猝滅。當(dāng)加入目標(biāo)物E2后，適配體P1與E2間更強(qiáng)烈的親和力使P1從AuNPs表面脫離，CQDs的熒光得以恢復(fù)，并以此建立熒光恢復(fù)強(qiáng)度與E2濃度的線性關(guān)系，達(dá)到定量檢測E2的目的。此外該熒光短鏈適體傳感器對(duì)牛奶和環(huán)境水樣中的E2進(jìn)行檢測，其結(jié)果與HPLC方法結(jié)果一致，以證明該傳感器在實(shí)際應(yīng)用中的潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

檸檬酸（C6H8O7）、乙二胺（C2H8N2）、檸檬酸三鈉（trisodium citrate，Tc，C6H5Na3O7）、1-(3-二甲胺丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）上海麥克林生物化學(xué)有限公司；四氯金酸（chloroauric acid，HAuCl3·HCl·4H2O）、雙酚A（bisphenol A，BPA）、己烯雌酚（diethylstilbestrol，DES）、雌酮（estrone，E1）、三氟乙酸 上海阿拉丁試劑有限公司；E2、雌三醇（estriol，E3）上海源業(yè)生物科技有限公司；E2短鏈適配體[18]（P1，5′-NH2-(CH2)6-AAG GGA TGC CGT TTG GGC CCA AGT TCG GCA TAG TG-3′）生工 生物工程（上海）股份有限公司；磷酸緩沖液（phosphate buffer，PB，pH 7.2，10 mmol/L）用KH2PO4和Na2HPO4?12H2O制備。除注明外，所有試劑都是分析純，未進(jìn)行進(jìn)一步的純化。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程使用的是由Milli-Q水凈化系統(tǒng)凈化的超純水。DNA試劑均用超純水溶解配制后置于-20 ℃冰箱冷藏。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器公司；DKZ-2B 恒溫水浴搖床 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TW-3021HR 高速冷凍離心機(jī) 安徽嘉文儀器裝備公司；JUPITER-B高通量微波消解/萃取儀 上海新儀科技有限公司；RF-6000熒光分光光度計(jì)、UV-1800紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；Merlin FE-EM掃描電子顯微鏡 德國卡爾蔡司公司；JEM-1400 Plus透射電子顯微鏡 日本JEOL公司；Nicolet-iS50傅里葉紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR）儀 美國賽默飛科技公司；Acquity Are高效液相色譜儀 上海沃特世科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 CQDs的制備及表征

CQDs制備參照本團(tuán)隊(duì)之前的研究[19]，利用高通量封閉式微波消解/萃取儀快速完成。具體步驟是先將2 g檸檬酸和1.043 mL乙二胺分別作為碳源和氮源溶解在20 mL超純水中，溶解完全后將其放入微波消解儀中，儀器的加熱溫度和加熱功率分別設(shè)為200 ℃、600 W，加熱5 min即完成了CQDs的快速制備。獲得的溶液自然冷卻后首先用0.22 μm的微孔膜過濾，然后用截留分子質(zhì)量為1000 Da的透析袋透析36 h以獲得純化的CQDs溶液，將其貯存在4 ℃的冰箱中備用。CQDs的形貌大小通過透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察，其光學(xué)性質(zhì)通過紫外-可見（ultravioletvisible，UV-Vis）光譜和熒光光譜進(jìn)行研究，另外通過FTIR探究CQDs表面官能團(tuán)的種類。

1.3.2 CQDs-P1的制備及表征

E2短鏈適配體（P1）在CQDs上的標(biāo)記參考Cao Xiaodong等[20]的步驟，首先稱取40 mg EDC和20 mg NHS溶解在2 mL PB中，將上述純化后的2 mL CQDs溶液混合并持續(xù)振蕩1 h以活化CQDs上的羧基，隨后加入10 μL濃度為100 μmol/L的P1溶液并于37 ℃繼續(xù)振蕩1 h。將獲得的CQDs-P1溶液透析12 h以去除多余的P1和CQDs，然后將其儲(chǔ)存在4 ℃?zhèn)溆?。P1的連接通過UV-Vis光譜和瓊脂糖凝膠電泳表征。

1.3.3 AuNPs的制備與表征

AuNPs制備是以經(jīng)典的檸檬酸鹽還原法[21]為基礎(chǔ)，稍加調(diào)整合成，其所用的玻璃器皿在使用之前均用王水（HCl∶HNO3=3∶1）浸泡過夜然后用超純水沖洗。制備的具體步驟如下：首先量取60 mL超純水倒入150 mL錐形瓶中，隨即加入1 mL 5 g/L的四氯金酸溶液并將錐形瓶置于磁力加熱攪拌器上開始加熱，溶液沸騰2 min時(shí)開始磁力攪拌（1000 r/min）并加入700 μL檸檬酸三鈉溶液（1%），觀察溶液顏色變化，在其顏色穩(wěn)定后繼續(xù)加熱令其保持沸騰5 min，反應(yīng)結(jié)束后讓其自然冷卻至室溫，體積濃縮5 倍后4 ℃冷藏待用。后續(xù)實(shí)驗(yàn)可通過調(diào)整檸檬酸三鈉溶液的體積制備不同粒徑的AuNPs。AuNPs的大小形貌通過SEM圖像和UV-Vis光譜表征。

1.3.4 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

為獲得最佳的檢測性能，對(duì)猝滅劑AuNPs的參數(shù)（包括粒徑、添加體積）、熒光猝滅時(shí)間和E2與P1的孵育時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.4.1 AuNPs粒徑優(yōu)化

按照1.3.1節(jié)方法通過添加500、600、700、800 μL和900 μL檸檬酸三鈉溶液分別合成粒徑約為50、42、39、32 nm和15 nm的AuNPs，將其先作體積5 倍濃縮處理，然后移取100 μL濃縮后的AuNPs溶液加入到100 μL CQDs-P1溶液中，再加入300 μL PB使反應(yīng)總體積為500 μL，輕柔振蕩30 min，反應(yīng)結(jié)束后選用激發(fā)波長350 nm對(duì)混合溶液在370～600 nm范圍內(nèi)的熒光光譜進(jìn)行掃描測定，同時(shí)將100 μL CQDs-P1溶液加入到400 μL PB溶液中作為對(duì)照，觀察不同粒徑AuNPs對(duì)CQDs熒光的猝滅情況。

1.3.4.2 AuNPs添加體積優(yōu)化

在100 μL CQDs-P1溶液中分別加入100、150、200、250、300 μL濃縮后的39 nm的AuNPs溶液，之后加入PB使反應(yīng)總體積為500 μL，輕柔振蕩30 min，同樣地將100 μL CQDs-P1溶液加入到400 μL PB溶液中作為對(duì)照，反應(yīng)結(jié)束后對(duì)所制樣品進(jìn)行熒光測定，觀察添加不同體積的AuNPs對(duì)CQDs熒光的猝滅情況。

1.3.4.3 熒光猝滅時(shí)間優(yōu)化

在100 μL CQDs-P1溶液中先加入200 μL濃縮后的39 nm的AuNPs溶液，再加入200 μL PB，分別輕柔振蕩5、10、15、20、25、30 min，同樣地將100 μL CQDs-P1溶液加入到400 μL PB溶液中作為對(duì)照，反應(yīng)結(jié)束后對(duì)所制樣品進(jìn)行熒光測定，觀察AuNPs加入不同時(shí)間后對(duì)CQDs熒光的猝滅情況。

1.3.4.4 E2與P1孵育時(shí)間優(yōu)化

在100 μL CQDs-P1溶液中先加入200 μL濃縮后的39 nm的AuNPs溶液，再加入100 μL PB，輕柔振蕩20 min后加入100 μL濃度為10-6mol/L的E2標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別孵育15、30、45、60、75、90 min，反應(yīng)結(jié)束后測量其熒光強(qiáng)度（F），同時(shí)測量200 μL AuNPs和200 μL PB加入100 μL CQDs-P1中振蕩20 min后的熒光強(qiáng)度（F0），觀察E2與P1孵育不同時(shí)間后對(duì)CQDs熒光的恢復(fù)情況。

1.3.5 E2標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測

E2標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解成10-3mol/L的母液，然后用超純水稀釋成不同濃度待用。對(duì)于E2的檢測，在100 μL CQDs-P1溶液中先加入200 μL濃縮后的39 nm的AuNPs溶液，再加入100 μL PB，輕柔振蕩20 min后分別加入100 μL不同濃度的E2標(biāo)準(zhǔn)溶液（10-9～10-4mol/L），然后孵育60 min，反應(yīng)結(jié)束后測量其熒光強(qiáng)度（F），同時(shí)測量200 μL AuNPs和200 μL PB加入100 μL CQDs-P1中振蕩20 min后的熒光強(qiáng)度（F0），觀察不同濃度E2溶液加入后對(duì)CQDs熒光的恢復(fù)情況。

1.3.6 實(shí)際樣品加標(biāo)檢測

考慮到E2的實(shí)際存在情況，選用在廣東廣州超市購買的牛奶作為實(shí)際樣品進(jìn)行檢測，同時(shí)收取中心湖公園（廣東廣州）的湖水和實(shí)驗(yàn)室的自來水進(jìn)一步驗(yàn)證該熒光適體傳感器的實(shí)用性。牛奶的前處理過程如下：將5 mL牛奶加入到20%三氟乙酸溶液中，調(diào)節(jié)pH 4.6，然后將該混合物置于45 ℃水浴10 min使牛奶中的蛋白質(zhì)沉淀，隨即在10 ℃、10000 r/min離心15 min，收集上清液并用0.22 μm微孔濾膜過濾2 次，然后將其與 500 μg/mL的E2儲(chǔ)備溶液混合，制備E2質(zhì)量濃度為5、12.5 μg/mL和25 μg/mL的實(shí)際樣品加標(biāo)溶液。水樣的前處理過程如下：自來水簡單地用0.22 μm微孔濾膜過濾兩次，湖水在室溫25 ℃沉淀一夜，然后上清液經(jīng)濾膜過濾兩次，其加標(biāo)溶液的制備與牛奶樣品加標(biāo)溶液的處理過程相同，分別得到5、12.5 μg/mL和25 μg/mL的湖水和自來水樣加標(biāo)溶液。實(shí)際樣品的檢測過程按照標(biāo)準(zhǔn)溶液中E2的檢測方法（1.3.5節(jié)）進(jìn)行，獲得對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度，E2最終加標(biāo)質(zhì)量濃度為1、2.5、5 μg/mL。同時(shí)對(duì)未加標(biāo)的牛奶樣品和水樣也進(jìn)行了檢測。另外，采用HPLC對(duì)同樣加標(biāo)的實(shí)際樣品進(jìn)行檢測，進(jìn)一步驗(yàn)證熒光傳感器的檢測結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有熒光測量都制備3 份平行樣品，并且使用平行樣的熒光平均值及其標(biāo)準(zhǔn)差作為最終結(jié)果。所有數(shù)據(jù)都由Excel 2019和Origin 2019b軟件進(jìn)行處理和分析。實(shí)驗(yàn)選取F-F0為熒光輸出信號(hào)，其中F0和F分別為不存在E2和存在E2時(shí)的熒光信號(hào)，也即加入AuNPs熒光被猝滅和再加入E2熒光被恢復(fù)的熒光強(qiáng)度。此外，按3s/k和10s/k計(jì)算熒光適體傳感器的檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ），其中s為空白樣品在442 nm處熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)差，k為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于AuNPs的熒光適體傳感器檢測E2的原理

AuNPs是一種消光系數(shù)高、具有拉曼增強(qiáng)特性且尺寸容易控制的金屬納米材料，并且基于其高消光系數(shù)，AuNPs還是一種優(yōu)良的熒光猝滅劑，在光學(xué)傳感中有著出色的表現(xiàn)[17]。因此本實(shí)驗(yàn)利用AuNPs的熒光猝滅作用建立了一種靈敏、準(zhǔn)確、快捷的熒光適體傳感器。其檢測原理如圖1所示，首先利用酰胺反應(yīng)在CQDs上連接E2的短鏈適配體P1，形成CQDs-P1，然后通過檸檬酸鹽還原法合成了酒紅色的AuNPs，當(dāng)在離心管中加入這二者時(shí)，由于適配體堿基間的金屬配位作用，AuNPs對(duì)適配體具有較強(qiáng)的吸附親和力[23]，CQDs-P1會(huì)吸附在AuNPs表面，而CQDs的熒光發(fā)射光譜與AuNPs的紫外吸收光譜有較大的重疊，當(dāng)它們相互靠近時(shí)且CQDs與AuNPs的距離在10 nm以內(nèi)時(shí)，處于激發(fā)態(tài)的CQDs就會(huì)將能量轉(zhuǎn)移至處于基態(tài)的猝滅劑AuNPs，即FERT效應(yīng)，表現(xiàn)為CQDs的熒光被猝滅；當(dāng)目標(biāo)物E2加入溶液體系后，適配體P1更傾向于與E2結(jié)合從而離開AuNPs表面，缺乏近距離這一條件后FRET不再發(fā)生，CQDs的熒光得以恢復(fù)，因此可以通過建立E2濃度與熒光恢復(fù)程度的線性關(guān)系達(dá)到定量檢測E2的目的。

圖1 基于AuNPs的熒光適體傳感器檢測E2的原理圖Fig.1 Schematic diagram of the fluorescence aptasensor for E2 detection based on AuNPs

2.2 CQDs的表征

通過微波輔助水熱法快速合成熒光CQDs，其形貌特征通過透射電子顯微鏡圖像進(jìn)行觀察，如圖2A所示，CQDs外觀接近球形并且在溶液中分散均勻，其粒徑在2.0～6.0 nm之間，平均值在3.5 nm左右。CQDs的紫外和熒光性能如圖2B所示，可以觀察到CQDs的最佳熒光激發(fā)波長和發(fā)射波長分別位于350 nm和442 nm，并且由于芳香族C＝C鍵的π-π*躍遷和C＝O鍵的n-π*躍遷，CQDs的UV-Vis光譜在239 nm和346 nm處分別有一個(gè)吸收峰[24]。圖2B右上角的插圖顯示了合成的CQDs在自然光下呈現(xiàn)淺黃色（左），在365 nm的紫外燈照射下會(huì)發(fā)出明亮的藍(lán)色熒光（右），表明制備的CQDs具有良好的熒光性能。此外，利用FTIR光譜對(duì)CQDs表面的官能團(tuán)進(jìn)行研究，結(jié)果如圖2C所示，很明顯在3250 cm-1附近出現(xiàn)了一個(gè)強(qiáng)寬峰，這歸因于O—H和N—H的伸縮振動(dòng)[25]，另外在1683 cm-1和1257 cm-1觀察到的兩個(gè)吸收峰分別是由C—O和C—N的伸縮振動(dòng)引起，在1544 cm-1和1378 cm-1出現(xiàn)的吸收峰分別是N—H和—CH2的變形振動(dòng)導(dǎo)致，最后在1186、1072 cm-1和992 cm-1處觀察到的弱吸收峰是由C—OH的伸縮振動(dòng)引起，這與Liu Yingnan等[26]報(bào)道的結(jié)果一致。FTIR的結(jié)果表明CQDs表面氨基、羧基和 羥基等諸多官能團(tuán)的存在，這也是CQDs具有良好水溶性的原因。

圖2 CQDs的表征Fig.2 Characterization of CQDs

2.3 CQDs-P1的表征

通過UV-Vis光譜表征E2短鏈適配體P1在CQDs上的連接，如圖3A所示，單獨(dú)的P1由于其堿基在260 nm觀察到明顯的紫外吸收峰[27]，單獨(dú)的CQDs在346 nm和249 nm兩個(gè)位置出現(xiàn)了紫外吸收峰，而連接了P1的CQDs同時(shí)在346 nm和260 nm左右出現(xiàn)了歸屬于P1和CQDs的紫外吸收峰，初步證明了CQDs-P1的形成。圖3B是瓊脂糖凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，泳道1是CQDs，在紫外燈的照射下觀察不到DNA條帶的存在，泳道2是適配體P1，可以看見清晰明亮的DNA條帶出現(xiàn)，泳道3代表與CQDs反應(yīng)后的P1，由于連接了CQDs，P1的遷移率降低[20]，導(dǎo)致其條帶明顯落后泳道2，其下方的另外一條條帶應(yīng)該是多余的未連接的P1，該結(jié)果更為有力地證明了CQDs-P1的成功合成。

圖3 CQDs、P1和CQDs-P1的UV-Vis光譜（A）和 瓊脂糖凝膠電泳（B）圖 Fig.3 UV-Vis absorption spectra (A) and agarose gel electropherograms (B) of CQDs,P1 and CQDs-P1

2.4 AuNPs的表征

從圖4A可以看出，加入700 μL檸檬酸鹽還原出的AuNPs呈現(xiàn)近圓形，粒徑在30～40 nm范圍內(nèi)，與理論計(jì)算值相近，但大小均勻性不是很好，這可能是一步還原法的不足之處。圖4B中展示了所合成的AuNPs在527 nm處由于Au的表面等離子體共振所引起的寬紫外吸收帶[28]，可以觀察到它和CQDs的熒光發(fā)射光譜有較大面積的重合，符合FRET發(fā)生的條件之一，右上角的插圖是AuNPs的圖片，可以看到AuNPs在自然光下呈現(xiàn)粉紫色，以上結(jié)果證明了AuNPs的成功合成和AuNPs作為優(yōu)良熒光猝滅劑的潛力。

圖4 AuNPs的SEM（A）和CQDs的熒光光譜和AuNPs的 UV-Vis光譜（B）圖像Fig.4 SEM image of AuNPs (A) and UV-vis absorption spectra of AuNPs and fluorescence emission spectra of CQDs (B)

2.5 E2檢測的可行性分析及檢測條件優(yōu)化

2.5.1 可行性分析

為確定該熒光適體傳感器的可行性，以E2終濃度為2×10-7mol/L的樣品組進(jìn)行熒光測試。如圖5所示，CQDs-P1表示100 μL CQDs-P1與400 μL PB混合均勻后測試得到的熒光光譜，其熒光強(qiáng)度最高；CQDs-P1＋ AuNPs表示200 μL AuNPs與200 μL PB加入到100 μL CQDs-P1溶液中，然后輕柔振蕩20 min后測試得到的熒光光譜，可以看出其熒光強(qiáng)度明顯降低，證明CQDs的熒光確實(shí)能被AuNPs有效猝滅；CQDs-P1＋AuNPs＋E2則表示200 μL AuNPs與100 μL PB加入到100 μL CQDs-P1溶液中輕柔振蕩20 min，再加入100 μL 10-6mol/L E2孵育60 min后測試得到的熒光光譜，相較于被猝滅的熒光強(qiáng)度，能觀察到加入E2后其熒光有明顯的恢復(fù)，證明E2與其適配體結(jié)合并將其帶離了AuNPs表面，使得CQDs熒光恢復(fù)。由此可知，將該熒光適體傳感器用于E2的檢測可行。

圖5 CQDs-P1、CQDs-P1＋AuNPs、CQDs-P1＋ AuNPs＋E2的熒光光譜Fig.5 Fluorescence spectra of CQDs-P1,CQDs-P1+AuNPs and CQDs-P1+AuNPs+E2

2.5.2 AuNPs粒徑優(yōu)化

為探究不同粒徑的AuNPs對(duì)CQDs熒光的猝滅效果，首先通過添加不同體積的Tc制備不同粒徑的AuNPs，對(duì)應(yīng)UV-Vis光譜如圖6A所示，隨著Tc溶液添加量從500 μL增加到900 μL，還原得到的AuNPs其表面等離子體共振峰位置從531 nm逐漸藍(lán)移至522 nm，通過紫外峰位置與AuNPs粒徑的關(guān)系[29]換算得知其粒徑分別為50、42、39、32、15 nm，右上角的插圖顯示了隨著粒徑的減?。═c溶液添加量的增加），AuNPs溶液的顏色逐漸由紫紅色轉(zhuǎn)變成亮酒紅色。隨后將合成的不同粒徑的AuNPs溶液用于猝滅CQDs的熒光，結(jié)果如圖6B所示，在AuNPs加入體積固定為100 μL的前提下，不同粒徑的AuNPs對(duì)CODs熒光的猝滅效率相差不大，都能猝滅CQDs 30%左右的熒光，39 nm的AuNPs表現(xiàn)出最佳的熒光猝滅效率，可能是因?yàn)檫@個(gè)粒徑大小的AuNPs在溶液中比較穩(wěn)定，并且適合吸附大量的CQDs-P1，因此AuNPs的粒徑優(yōu)化為39 nm。根據(jù)紫外吸光度與該粒徑大小的AuNP濃度關(guān)系[29]換算得到，合成并濃縮5 倍后39 nm的AuNP濃度大約為 4.57×10-10mol/L。

圖6 添加不同Tc體積AuNPs的UV-Vis光譜（A）和不同粒徑 AuNPs對(duì)CQDs熒光的猝滅效率（B）Fig.6 UV-Vis spectra of AuNPs with different volumes of added Tc (A) and fluorescence quenching efficiency of AuNPs with different particle sizes on CQDs (B)

2.5.3 AuNPs添加體積和猝滅時(shí)間優(yōu)化

在AuNPs粒徑優(yōu)化為39 nm的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)AuNPs的添加體積和猝滅時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。在CQDs-P1的溶液中分別加入100、150、200、250、300 μL的AuNPs溶液進(jìn)行熒光猝滅實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖7A所示，隨著AuNPs溶液的添加體積從100 μL增加到200 μL，CQDs的熒光猝滅程度逐漸增加，而當(dāng)AuNPs溶液的添加體積進(jìn)一步增加時(shí)，CQDs的熒光猝滅程度卻在逐漸降低，這可能是因?yàn)槿芤后w系中AuNPs濃度較大，容易發(fā)生聚集，導(dǎo)致AuNPs沉降[30]，進(jìn)而影響到其對(duì)CQDs熒光的猝滅，因此AuNPs的添加體積優(yōu)選為200 μL。圖7B是200 μL濃度約為4.57×10-10mol/L的AuNPs加入到CQDs-P1溶液中不同時(shí)間后對(duì)CQDs熒光的猝滅效率，可以看到隨著時(shí)間的延長，AuNPs對(duì)CQDs熒光的猝滅效率越來越高，說明越來越多的CQDs-P1吸附到AuNPs上，熒光猝滅效率在20 min之后達(dá)到平穩(wěn)，此時(shí)應(yīng)該已經(jīng)達(dá)到吸附飽和狀態(tài)，因此AuNPs對(duì)CQDs的猝滅時(shí)間優(yōu)化為20 min。

圖7 不同AuNPs添加體積（A）和AuNPs添加不同時(shí)間后（B）對(duì) CQDs的熒光猝滅效率Fig.7 Effect of AuNPs amount (A) and quenching time (B) on fluorescence quenching efficiency of CQDs

2.5.4 E2與P1孵育時(shí)間優(yōu)化

為獲得最佳的熒光恢復(fù)效果，對(duì)E2加入不同時(shí)間后CQDs熒光恢復(fù)的情況進(jìn)行探究。圖8是E2與CQDs-P1/AuNPs溶液體系分別孵育15、30、45、60、75、90 min后的相對(duì)熒光強(qiáng)度（F-F0，F(xiàn)0為CQDs熒光被AuNPs猝滅后的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)為猝滅后再加入E2的熒光強(qiáng)度），即熒光的恢復(fù)程度，隨著孵育時(shí)間的延長，體系的F-F0越來越高，表明越來越多的P1與E2結(jié)合并不再吸附在AuNPs表面，從而引起CQDs熒光的恢復(fù)，體系的F-F0在60 min后趨于穩(wěn)定，表明此時(shí)E2能結(jié)合的P1達(dá)到了最大值。因此熒光的恢復(fù)時(shí)間優(yōu)化為60 min。

圖8 E2與P1孵育不同時(shí)間后體系的相對(duì)熒光強(qiáng)度Fig.8 Effect of incubation time between E2 and P1 on relative fluorescence intensity (F-F0) of the system

2.6 熒光適體傳感器檢測E2的靈敏度測試

AuNPs可以通過FRET猝滅CQDs的熒光，而E2加入后會(huì)與其適配體P1結(jié)合從而破壞FRET，使得CQDs的熒光有一定程度的恢復(fù)，不同濃度的E2會(huì)引起CQDs熒光不同程度的恢復(fù)，基于此可以實(shí)現(xiàn)E2的定量檢測。在優(yōu)化的檢測條件下，AuNPs先與CQDs-P1溶液混合以猝滅其熒光，然后加入不同濃度的E2標(biāo)準(zhǔn)溶液（10-10～10-5mol/L）孵育60 min，反應(yīng)完成后進(jìn)行熒光測試，結(jié)果如圖9A所示，CQDs-P1溶液具有最高的熒光強(qiáng)度，加入AuNPs后其熒光被大幅度猝滅（F0），隨著加入E2濃度的增大，CQDs的熒光強(qiáng)度逐漸恢復(fù)的越來越高（F），可以觀察到E2最終濃度低至2×10-10mol/L 時(shí)幾乎就起不到恢復(fù)CQDs熒光的作用了。以E2最終濃度（2×10-9～2×10-5mol/L）的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的相對(duì)熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖9B），擬合得到線性方程y=58.50x＋558.95，決定系數(shù)R2為0.992。在此基礎(chǔ)上，計(jì)算出該熒光適體傳感器測定E2的LOD為3.4×10-10mol/L，LOQ為1.0×10-9mol/L。結(jié)果表明，該傳感器對(duì)痕量E2的定量檢測具有寬廣的檢測范圍和較高的靈敏度。

圖9 E2適體傳感器的熒光光譜（A）和適體傳感器的F-F0 與E2濃度對(duì)數(shù)值之間的線性關(guān)系圖（B）Fig.9 Fluorescence spectra of aptasensor with E2 concentration ranging from 2 × 10–10–2 × 10–5 mol/L (A) and linear plot between F–F0 of aptasensor and logarithm of E2 concentration ranging from 2 × 10–10–2 × 10–5 mol/L (B)

2.7 熒光適體傳感器檢測E2的特異性及重復(fù)性測試

為研究該適體傳感器的特異性，同樣地選用E1、E3、DES、BPA這些E2類似物和Ca2＋、Fe3＋、K＋、Mg2＋、Na＋、Zn2＋、S、Cl-這些可能與E2共存的離子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，這些干擾物質(zhì)的最終濃度為2×10-6mol/L，E2的最終濃度為2×10-7mol/L。如圖10A所示，可以看出CQDs熒光被AuNPs猝滅后，只有加入E2或者將E2連同干擾物一起加入才能引起熒光大幅度的恢復(fù)，而單獨(dú)加入上述干擾物質(zhì)幾乎不會(huì)引起熒光強(qiáng)度的變化，表明適配體只會(huì)特異性地與E2結(jié)合從而恢復(fù)CQDs的熒光，該結(jié)果證明了所構(gòu)建的熒光適體傳感器在檢測E2時(shí)具有良好的選擇性。另一方面，為了研究該熒光適體傳感器用于E2檢測的重復(fù)性，制備了10組E2最終濃度為2×10-7mol/L 的平行樣品用于實(shí)驗(yàn)，其對(duì)應(yīng)的相對(duì)熒光強(qiáng)度F-F0如圖10B所示，可以看出這10 組平行樣品的熒光恢復(fù)程度接近，計(jì)算其F-F0的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為5.0%，說明該熒光適體傳感器對(duì)E2的檢測同樣具有良好的重復(fù)性。

圖10 E2與不同干擾物加入檢測體系后適體傳感器（A）和10 組2×10－7 mol/L E2平行樣品（B）的相對(duì)熒光強(qiáng)度Fig.10 Relative fluorescent intensities of aptasensor with 10–6 mol/L interferences and 10–7 mol/L E2 (A) and relative fluorescent intensities of 10 parallel samples of E2 at 10–7 mol/L (B)

2.8 實(shí)際樣品中E2的檢測

該研究選擇牛奶、湖水和實(shí)驗(yàn)室自來水作為實(shí)際樣品對(duì)E2進(jìn)行加標(biāo)檢測，將其按照1.3.6節(jié)經(jīng)過簡單的預(yù)處理后制備成E2的加標(biāo)溶液，然后與CQDs-P1和AuNPs的混合溶液孵育60 min后進(jìn)行熒光測試，其中E2的加標(biāo)終質(zhì)量濃度為1、2.5、5 μg/mL。另外也對(duì)未添加E2的牛奶和水樣進(jìn)行了檢測，將其作為對(duì)照結(jié)果。表1 顯示在對(duì)照中未檢測到E2的存在，原因可能是所選取的牛奶和水樣中E2的濃度低于該適體傳感器的檢出限；此外，不同E2加標(biāo)質(zhì)量濃度的牛奶樣品獲得的回收率為89.67%～108.66%，對(duì)應(yīng)的RSD在3.8%～6.3%之間，兩種水樣中得到的E2回收率在90.34%～113.36%之間，RSD均小于5%；HPLC方法檢測實(shí)際樣品中的E2得到的回收率在81.53%～115.44%之間，RSD為0.6%～9.4%。從結(jié)果可以得出該熒光適體傳感器的檢測結(jié)果與HPLC方法得到的檢測結(jié)果較為一致，表明該熒光適體傳感器在監(jiān)測實(shí)際樣品中E2的含量時(shí)具有良好的準(zhǔn)確度和精度[31]，并且有望作為一種簡便快捷的傳感方法在現(xiàn)實(shí)場景中準(zhǔn)確靈敏地檢測痕量的E2殘留。

表1 適體傳感器與HPLC方法測定實(shí)際樣品中E2含量的回收率Table 1 Recoveries of E2 in spiked real samples by this aptasenor and HPLC

3 結(jié)論

利用AuNPs對(duì)CQDs熒光的猝滅作用建立了一種用于E2檢測的熒光適體傳感器，結(jié)果顯示該傳感器對(duì)E2具有寬廣的檢測范圍（2×10-5～2×10-9mol/L），且LOD能達(dá)到3.4×10-10mol/L，E2和其短鏈適配體的高親和性賦予了該傳感器良好的選擇性，最后將其用于牛奶和湖水等實(shí)際樣品中E2的檢測，得到的回收率為89.67%～113.36%，RSD為1.4%～6.3%，其結(jié)果與HPLC方法檢測E2得到的結(jié)果較為一致，表明該傳感器具有實(shí)際的應(yīng)用潛力。