麥盧卡蜂蜜植物源性成分鑒別方法的建立

楊艷歌，王迎春，劉鳴暢，牛 娜，黃文勝，吳占文，王 帥，康 婕，吳亞君,

（1.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京 100176；2.深圳海關(guān)食品檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東 深圳 518045；3.陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，陜西 西安 710048）

蜂蜜一直以抗菌、修復(fù)、調(diào)養(yǎng)而聞名于世，體外研究和局部使用均已證明蜂蜜對許多病原微生物具有抗菌修復(fù)作用，這種抗菌活性是滲透（吸水）、酸度、過氧化氫和植物化學(xué)因子（如多酚）等作用的結(jié)果[1-4]。少數(shù)蜂蜜品種體外抗菌活性高于過氧化氫的存在，這種活性不依賴于蜂蜜中的過氧化氫，被稱為非過氧化氫抗菌活性（non-peroxide antibacterial activity，NPA）[5-7]。由新西蘭麥盧卡樹（Leptospermum scoparium）產(chǎn)生的一種單花蜜——麥盧卡蜂蜜就是這類蜂蜜中最突出的一種，這是由于其花蜜中存在二羥基丙酮（dihydroxyacetone，DHA），可通過非酶脫水形成了殺菌劑甲基乙二醛（methylglyoxal，MGO）的緣故[8-11]。另外，有研究證實麥盧卡蜂蜜還具有抗氧化[12-13]、抗腫瘤以及抑制腫瘤細胞增殖[14-15]、幫助傷口愈合[16]和消炎[17-18]等特性。因此麥盧卡蜂蜜被認為具有較高藥用價值而被喻為新西蘭的“國寶”，并在全世界范圍內(nèi)受到追捧[19]，這也導(dǎo)致其售價遠高于其他蜂蜜，并且還在不斷攀升，已成為蜂蜜中的奢侈品[20-21]。一些不法分子為謀取暴利，將麥盧卡蜂蜜摻假摻雜卡奴卡或其他蜂蜜，作為單一麥盧卡蜂蜜進行交易[22]。并且據(jù)不完全統(tǒng)計，新西蘭每年生產(chǎn)約1700 t麥盧卡蜂蜜，然而全球每年的消費量約為1萬 t[23]，也就是全世界銷售的麥盧卡蜂蜜遠超過新西蘭蜂蜜的產(chǎn)量，因此其真實性也受到全社會的關(guān)注[24]。

通過花粉、風味和顏色分析和/或通過電導(dǎo)率測量等傳統(tǒng)的蜂蜜純度測定方法不適用于麥盧卡蜂蜜的真實性鑒別[25]，因為通過顯微鏡觀察同時收獲的麥盧卡和卡奴卡花粉粒，發(fā)現(xiàn)外觀幾乎相同[26]，因此無法通過花粉分析區(qū)分這兩個品種。然而麥盧卡蜂蜜和卡奴卡蜂蜜的花期相似，在田間也很難區(qū)分，而卡奴卡峰蜜既不含DHA[27]也不含MGO[28]，也幾乎不顯示非過氧化物活性[29]。因此，檢測麥盧卡蜂蜜中是否含有卡奴卡成分對于確定其純度非常重要。以往通過檢測特征標志物MGO鑒別麥盧卡蜂蜜，以及依賴于MGO的含量對麥盧卡蜂蜜認證定級的方法也不可行[30]，因為一方面造假者可以通過直接添加MGO或其前體DHA到卡奴卡蜂蜜中進行摻偽而升級為“麥盧卡”蜂蜜[31]，另一方面DHA在長時間的儲存和加熱過程中會被非酶轉(zhuǎn)化為MGO，而導(dǎo)致MGO增加[17,32]。為此，新西蘭農(nóng)業(yè)部（Ministry for Primary Industries，MPI）在2014年發(fā)起了“麥盧卡蜂蜜科學(xué)計劃”項目[25]，并確定了用4 種化學(xué)物和一個DNA標記物5 種屬性綜合判別的方式，以區(qū)分麥盧卡蜂蜜和非麥盧卡蜂蜜、單花麥盧卡蜂蜜以及多花麥盧卡蜂蜜[33-34]。然而該規(guī)定的檢測耗時長、成本高，并且其DNA標記物方法未公開檢測的引物探針序列，每此實驗需要采購其規(guī)定的DNA提取試劑盒和實時聚合酶鏈式反應(yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）檢測試劑盒，因此開發(fā)廉價、快速的麥盧卡蜂蜜鑒定方法具有重要意義[35]。

此外，MPI規(guī)定的DNA標記物方法是對蜂蜜花粉沉淀提取DNA進行檢測，事實上以往基于DNA區(qū)分蜂蜜物種來源的方法一般都是對蜂蜜的花粉沉淀進行DNA提取[36-37]。這是由于研究者一般認為蜂蜜本身不含植物DNA，提取蜂蜜的DNA實際上是蜜蜂采蜜過程中帶入的花粉粒DNA[38]。但僅進行此檢測很難區(qū)分造假者有意將蜂花粉摻入糖漿造假蜂蜜的方式。因此Wu Yajun等[39]建議在對蜂蜜進行植物源分辨時，建議增加蜂蜜上清液的DNA提取方法，從而進行更加客觀的判斷。

為此本研究開展了以下實驗：1）比較市場常見的試劑盒、傳統(tǒng)CTAB法以及MPI指定的DNA提取試劑盒對麥盧卡蜂蜜花粉沉淀的DNA提取效果；2）建立麥盧卡蜂蜜上清液DNA提取方法，以彌補以往研究僅對麥盧卡蜂蜜花粉沉淀進行鑒別的不足；3）建立植物內(nèi)參照、麥盧卡、卡奴卡3 種物種源性成分鑒別的real-time PCR方法，分析方法的特異性、靈敏度與檢出限；4）比較本研究與MPI規(guī)定的方法對蜂蜜樣品的檢測效果。通過以上4 個方面的研究，建立了高效提取麥盧卡蜂蜜沉淀和上清液DNA的方法；提供了可快速、靈敏、準確鑒別麥盧卡蜂蜜植物源性成分的方法；并通過對比，證實了建立方法的可行性、準確性與等效性，以期為快速檢測麥盧卡蜂蜜的真?zhèn)翁峁┘夹g(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

油菜花粉、柳樹花粉、獼猴桃花粉、蕎麥花粉、荷花花粉、茶花花粉、玫瑰花粉、虞美人花粉由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所提供；洋槐、紫云英、枸杞、荊條、荔枝、龍眼、巨桉、棗、椴樹、向日葵、棉花、蘋果、橘、芝麻、黃瓜、小麥、桑、蠶豆、冬青、木蘭、橄欖、桂花、國槐、甘薯、郁金香、芒果、葡萄、草莓、薰衣草、百合、菊花、杜鵑、水仙、番茄、銀杏、松、綠藻樣品為本實驗室收集；麥盧卡蜂蜜及卡奴卡蜂蜜樣品為MPI提供。

1.1.2 試劑

Geneaid蜂蜜基因組DNA提取試劑盒 中國臺灣Geneaid技術(shù)有限公司；NucleoSpin?Food 德國Macherey-Nagel公司；植物基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；Promega Wizard? Magnetic食品DNA純化系統(tǒng) 美國Promega公司；ManKanTM蜂蜜real-time PCR試劑盒、ManKan? DNA標準品、ManKan?蜂蜜陽性質(zhì)控 新西蘭dnature診斷研究有限公司；TaqMan Fast Advanced Master Mix 美國Applied Biosystems公司。

1.1.3 引物探針

從GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索獲得麥盧卡、卡奴卡以及其他常見蜂蜜植物物種的NADH和ITS基因序列。利用Clustal X軟件進行多重序列比對，利用Primer Premier 5.0軟件在NADH保守區(qū)域設(shè)計內(nèi)參照（顯花植物通用）引物探針，在ITS種間差異區(qū)域分別設(shè)計麥盧卡和卡奴卡的特異性引物探針。篩選好的引物和探針信息如表1所示，所有引物探針均在上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。

表1 麥盧卡蜂蜜植物源檢測引物探針信息Table 1 Primers used for the identification of plant-derived ingredients in mānuka honey

1.2 儀器與設(shè)備

7500 real-time PCR儀 美國Applied Biosystems 公司；Pico17離心機（離心力≥12000×g）美國Thermo公司；TissueLyser II組織研磨儀 德國QIAGEN 公司；核酸蛋白分析儀 日本島津公司；渦旋儀 德國 IKA公司；恒溫混勻儀、微量移液器 德國Eppendorf 公司；離心管、八連排PCR管 美國Axygen公司；電子天平 德國Sartorius公司；恒溫水浴鍋 北京六一生物科技有限公司；磁力架 美國Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

按照MPI[34]的步驟對蜂蜜樣品進行處理，部分步驟稍作改良。將蜂蜜樣品50 ℃水浴10 min左右至充分融化，上下顛倒混勻；統(tǒng)一稱取1.4 g蜂蜜樣品于2 mL離心管中，加入900 μL無菌ddH2O，65 ℃、1200 r/min振蕩孵育10 min；15000×g離心5 min，上清液于4 ℃貯存；沉淀部分用1 mL無菌水洗脫，15000×g離心5 min，并重復(fù)洗脫一次。

花粉樣品采用組織研磨機研磨1 min；水果樣品直接粉碎，10000×g離心，取沉淀物部分；其他根莖葉類植物樣品液氮速凍采用組織研磨機粉碎。

1.3.2 DNA提取

1.3.2.1 蜂蜜沉淀DNA提取

分別用NucleoSpin食品基因組DNA提取試劑盒、天根植物基因組DNA提取試劑盒、傳統(tǒng)的CTAB法，以及MPI推薦的Geneaid蜂蜜基因組DNA提取試劑盒，進行蜂蜜沉淀DNA提取效果比較。Geneaid蜂蜜基因組DNA提取試劑盒的操作步驟按照MPI的文件[34]操作，NucleoSpin食品基因組DNA提取試劑盒、天根植物基因組DNA提取試劑盒、CTAB法統(tǒng)一加入650 μL提取緩沖液，以及10 μL 10 mg/mL蛋白酶K溶液。統(tǒng)一置于65 ℃、800 r/min 恒溫混勻儀中溫育1～2 h，15000×g離心5 min，轉(zhuǎn)移上層清液至50 mL離心管中。CTAB法其余步驟按照 GB/T 19495.3—2004《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測核酸提取純化方法》CTAB-2方法操作[40]，NucleoSpin食品基因組DNA提取試劑盒、天根植物基因組DNA提取試劑盒其余步驟按照各說明書操作，獲取的DNA統(tǒng)一用50 μL無菌ddH2O溶解。分別用本研究建立的植物內(nèi)參照方法和ManKan蜂蜜real-time PCR試劑盒方法進行檢測，以ManKanTM蜂蜜質(zhì)控DNA為陽性，每份DNA重復(fù)擴增3 次，比較上述4 種DNA提取方法的擴增效率，-20 ℃保存DNA。

1.3.2.2 蜂蜜上清液DNA提取

取20 mL蜂蜜上清液分裝到2 個50 mL離心管中，每管分別加入裂解液A 4 mL、裂解液B 2 mL，充分混勻，靜置10 min。加入5 mL沉淀溶液，振蕩混勻。加入150 μL磁珠和0.9 倍溶液體積的異丙醇，室溫靜置1 h，期間不時顛倒，置磁力架上5 min，小心去除水相，其余步驟參照試劑盒說明書，DNA用50 μL無菌ddH2O溶解。用ManKan蜂蜜real-time PCR試劑盒進行DNA擴增效果比較，每份DNA重復(fù)擴增3 次，以無菌ddH2O為空白對照，-20 ℃保存DNA。

1.3.2.3 其他植物樣品DNA提取

除蜂蜜外的其他植物樣品取100～500 mg，均采用Nucleospin食品基因組DNA提取試劑盒提取DNA，用核酸蛋白定量儀測量DNA濃度，-20 ℃保存DNA。

1.3.3 real-time PCR

本研究建立的方法采用25 μL反應(yīng)體系進行real-time PCR檢測：12.5 μLTaqMan Fast Advanced Master Mix，10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，10 μmol/L探針0.5 μL，模板DNA 5 μL，用無菌水補至總體積25 μL。反應(yīng)程序為：50 ℃去除RNA 2 min；95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，40 個循環(huán)。熒光基團設(shè)為FAM，猝滅基團設(shè)為none，閾值為儀器自動生成。

MPI方法采用其規(guī)定ManKan蜂蜜real-time PCR試劑盒[34]進行檢測，采用10 μL反應(yīng)體系：20×Oligo mix 0.5 μL，5×Master mix 2 μL，PCR級別水5.5 μL，模板DNA 2 μL。在real-time PCR儀上進行PCR擴增，反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性3 min；96 ℃變性10 s，62 ℃退火30 s，40 個循環(huán)，ROX基底熒光校正設(shè)為none，內(nèi)參照、卡奴卡和麥盧卡檢測熒光分別設(shè)為ROX、VIC和FAM。

1.3.4 引物探針通用性和特異性檢測

以47 種植物的DNA（5 ng/μL）進行檢測，其中45 種為顯花植物：麥盧卡、卡奴卡、油菜、柳樹、獼猴桃、蕎麥、荷花、茶花、玫瑰、虞美人、洋槐、紫云英、枸杞、荊條、荔枝、龍眼、巨桉、棗、椴樹、向日葵、棉花、蘋果、橘、芝麻、黃瓜、小麥、桑、蠶豆、冬青、木蘭、橄欖、桂花、國槐、甘薯、郁金香、芒果、葡萄、草莓、薰衣草、百合、菊花、杜鵑、水仙、番茄，3 種為非顯花植物：銀杏、松和綠藻，以無菌水為空白對照，進行real-time PCR擴增，每個樣品2 個平行重復(fù)。

1.3.5 絕對靈敏度分析

分別將麥盧卡和卡奴卡DNA標準品進行梯度稀釋，使其質(zhì)量濃度分別為100 ng/μL、10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL，共6 個梯度，用篩選好的特異性引物探針進行real-time PCR擴增，每個反應(yīng)設(shè)置3 個平行，標準曲線由儀器自動生成。

1.3.6 檢出限分析

將卡奴卡蜂蜜和麥盧卡蜂蜜互摻，分別按照含量比為0.1∶99.9、1∶99、10∶90、50∶50模擬制備混合摻雜蜂蜜樣品，混勻后分別提取混合蜂蜜樣品上清液和沉淀的DNA，分別以卡奴卡蜂蜜和麥盧卡蜂蜜DNA為陽性，以ddH2O為空白對照，進行real-time PCR擴增檢出限分析，每個反應(yīng)設(shè)置3 個平行。

1.3.7 蜂蜜樣品檢測結(jié)果對比

對MPI提供的15 份蜂蜜樣品分別采用MPI指定的Geneaid蜂蜜基因組DNA提取試劑盒和NucleoSpin食品基因組DNA提取試劑盒進行蜂蜜沉淀的DNA提取，同時采用Promega Wizard? Magnetic食品DNA純化系統(tǒng)對蜂蜜上清液進行DNA提取。采用本研究建立的植物內(nèi)參照、麥盧卡、卡奴卡物種源性成分real-time PCR檢測方法，以及MPI指定的real-time PCR檢測試劑盒進行了檢測，以ddH2O為空白對照，每個反應(yīng)設(shè)置3 個平行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及圖表繪制

將儀器導(dǎo)出檢測數(shù)據(jù)錄入在Excel表格中，在Excel中計算平均值和標準偏差，根據(jù)數(shù)據(jù)繪制三線表和柱形圖，柱形圖用不同圖案填充，以重復(fù)實驗的標準偏差添加誤差線。擴增圖譜和標準曲線儀器由儀器自動生成并導(dǎo)出。

2 結(jié)果與分析

2.1 real-time PCR方法建立

2.1.1 引物探針篩選

為了對蜂蜜樣品的DNA進行質(zhì)量控制，根據(jù)常見的蜂蜜為顯花植物的特性，設(shè)計顯花植物通用引物探針，對48 種植物進行real-time PCR通用性檢測，結(jié)果顯示，設(shè)計的ndhB基因顯花植物引物探針可以對45 種顯花植物擴增，擴增Ct值在14～28之間，表明通用性和覆蓋性較好；銀杏、松和綠藻無擴增，表明對裸子植物和原始植物特異性較好，故依此引物探針作為內(nèi)參照進行蜂蜜樣品DNA提取效果的質(zhì)控檢測，結(jié)果如圖1A所示。

圖1 引物探針通用性和特異性分析Fig.1 Generality and specificity of primers and probes

以上述47 種植物為檢測對象，分別對設(shè)計的麥盧卡和卡奴卡引物探針進行擴增，結(jié)果顯示這兩組引物探針分別僅能對麥盧卡（圖1B）和卡奴卡（圖1C）進行有效擴增，Ct值分別為18.14±0.02和19.41±0.04，二者之間無交叉擴增，其他植物源成分無非特異擴增，說明設(shè)計的兩組引物探針的特異性較好，可以進行蜂蜜樣品中麥盧卡和卡奴卡成分的檢測。

2.1.2 靈敏度分析

將6 個質(zhì)量濃度梯度的麥盧卡和卡奴卡DNA進行絕對靈敏度檢測，結(jié)果顯示6 個梯度均有明顯的擴增，當DNA質(zhì)量濃度為1 pg/μL時，尚有良好的擴增，此時平均Ct值分別為35.66±0.13、37.02±0.42、36.27±0.29，因此初步確定內(nèi)參照、麥盧卡和卡奴卡的絕對靈敏度均為1 pg/μL，結(jié)果如圖2所示。根據(jù)儀器自動生成的標準曲線Y內(nèi)參照=-3.315X＋23.662、Y麥盧卡=-3.434X＋25.800、Y卡奴卡=-3.880X＋23.533，內(nèi)參照、麥盧卡和卡奴卡引物探針靈敏度檢測的擴增效率分別達100.298%、95.507%、81.019%，線性相關(guān)系數(shù)R2分別為0.999、0.998和0.995，說明線性關(guān)系良好，結(jié)果可信。因此確定本研究設(shè)計的內(nèi)參照、麥盧卡和卡奴卡引物探針檢測的絕對靈敏度最低可達1 pg/μL。與MPI報道的檢出限為3 fg/μL，Ct值為36的靈敏度相近。

圖2 方法靈敏度檢測的擴增曲線Fig.2 Sensitivity analysis of the established method

2.2 DNA提取方法

2.2.1 蜂蜜沉淀DNA提取方法比較

高效的DNA提取方法是保證real-time PCR檢測結(jié)果準確的前提。實驗選用3 種提取方法：CTAB法、NucleoSpin食品基因組DNA提取試劑盒、天根植物基因組DNA提取試劑盒以及傳統(tǒng)的CTAB法，與MPI規(guī)定的Geneaid蜂蜜基因組DNA提取試劑盒進行麥盧卡蜂蜜花粉沉淀DNA提取效果比較。從操作步驟和時間看，CTAB操作步驟最繁瑣、耗時最長，天根、NucleoSpin和Geneaid提取流程相近，步驟較簡單、耗時較短，對4 種方法提取流程的比較如圖3所示。從擴增效率看，CTAB擴增效果最低，NucleoSpin的擴增效果最好，其次是Geneaid，再次是天根，擴增效果的比較如圖4所示。綜上，NucleoSpin操作步驟最簡便，耗時時間較短，提取效率較Geneaid高，因此對麥盧卡蜂蜜的DNA提取不用局限于MPI的規(guī)定，檢測過程中選擇滿足需求的DNA提取方法即可。

圖4 不同方法提取的麥盧卡蜂蜜沉淀DNA的擴增效果Fig.4 Amplification efficiency of DNA from mānuka honey sediment by different DNA extraction methods

2.2.2 蜂蜜上清液DNA提取

MPI僅規(guī)定了麥盧卡蜂蜜花粉沉淀進行DNA提取的方式，但考慮到造假者有可能添加麥盧卡花粉到非麥盧卡蜂蜜進行冒充，為對這種情況進行鑒別，本研究又針對麥盧卡蜂蜜上清液建立了DNA提取方法。經(jīng)實驗，發(fā)現(xiàn)采用Promega WizardTMMagnetic食品DNA純化系統(tǒng)可對麥盧卡蜂蜜上清液進行DNA提取，并采用該方法對MPI提供的15 份蜂蜜樣品上清液進行DNA提取，并與MPI規(guī)定的Geneaid蜂蜜基因組DNA提取試劑盒的沉淀效果進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)建立的蜂蜜上清液DNA提取方法可以成功將所有蜂蜜DNA提出，可以滿足檢測要求，但與沉淀的擴增效果相比，上清液擴增效果略低于沉淀，擴增Ct值在24～36之間，沉淀DNA擴增Ct值在22～32之間，擴增結(jié)果如圖5所示。

圖5 麥盧卡蜂蜜上清液（A）和沉淀（B）DNA擴增效果分析Fig.5 Amplification efficiency of DNA from mānuka honey supernatant (A) and sediment (B)

2.3 蜂蜜實際檢出限分析

為分析本研究建立的方法對麥盧卡及卡奴卡蜂蜜檢測的實際檢出限，分別提取模擬制備的混合蜂蜜樣品的上清液和沉淀DNA，并進行real-time PCR擴增，檢測結(jié)果如圖6所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論上清液還是沉淀，本研究建立的內(nèi)參照、麥盧卡、卡奴卡成分檢出限均可達0.1%。

圖6 混合麥盧卡蜂蜜檢出限分析Fig.6 Detection limits of mixed mānuka honey

2.4 MPI提供蜂蜜樣品的檢測結(jié)果比較

采用本研究建立的方法以及MPI規(guī)定的麥盧卡蜂蜜DNA檢測方法，對MPI提供的15 份蜂蜜進行DNA提取和擴增效果比較，詳情見表2。檢測結(jié)果顯示3 種DNA提取方法均可獲得質(zhì)量良好的DNA，本研究建立的方法以及MPI規(guī)定的麥盧卡蜂蜜DNA檢測方法檢測結(jié)果一致，包括以下幾種情況：1）3 份檢出卡奴卡成分，其中1 份未檢出麥盧卡成分，另2 份樣品采用MPI方法平均Ct值為33.84±1.20和34.46±2.54，接近于MPI文件要求的Ct≤36.00的檢測閾值，但其相對分析誤差（relative percent difference，RPD）分別為5%和14.76%，MPI文件規(guī)定測試結(jié)果RPD應(yīng)小于5%[22]，因此該結(jié)果應(yīng)判為陰性。采用本研究方法，沉淀和上清液均未檢出麥盧卡，因此這2 份樣品非麥盧卡蜂蜜。2）1 份檢出植物成分，但既未檢出麥盧卡成分也未檢出卡奴卡成分，為其他植物蜂蜜。3）9 份同時檢出麥盧卡分和卡奴卡成分，為多花麥盧卡蜂蜜。4）2 份檢出麥盧卡分而未檢出卡奴卡，應(yīng)為單花麥盧卡蜂蜜。綜上，這15 份樣品中，13.33%為麥盧卡單花蜜，66.67%為雜花蜜，13.33%為卡奴卡蜂蜜，6.67%為其他植物蜂蜜。

表2 對MPI提供的蜂蜜樣品的檢測結(jié)果分析Table 2 Results of MPI detection of honey samples

3 討論

3.1 MPI麥盧卡蜂蜜DNA檢測方法使用過程中的問題

在參與MPI麥盧卡蜂蜜DNA檢測方法驗證的過程中，發(fā)現(xiàn)一些問題：一是，DNA提取試劑盒和PCR試劑盒均需購買推薦廠商的商品，費用較昂貴，一個PCR擴增試劑盒報價999 美元（不含關(guān)稅等），且這2 個商品非通用試劑，只能用于麥盧卡蜂蜜檢測的，因此通常情況下國內(nèi)沒有現(xiàn)貨，每次購買貨期較長，影響了檢測時效性。二是，未提供內(nèi)參照、麥盧卡、卡奴卡3 種成分檢測的引物探針序列，每次檢測都需要購買指定的試劑盒，而無法自行合成，因此在使用的過程中受到諸多限制。三是，僅對蜂蜜花粉沉淀進行的檢測，無法分辨以摻入花粉造假蜂蜜的方式。

3.2 麥盧卡蜂蜜DNA提取方法分析

為此，本研究首先比較常見的國產(chǎn)和進口食品DNA提取試劑盒，以及傳統(tǒng)CTAB法對麥盧卡蜂蜜的提取效果，并與MPI規(guī)定的Geneaid蜂蜜基因組DNA提取試劑盒的提取效果進行比較，結(jié)果顯示雖然擴增效果NucleoSpin食品基因組DNA提取試劑盒＞Geneaid蜂蜜基因組DNA提取試劑盒＞天根植物基因組DNA提取試 劑盒＞CTAB法，但4 種方法都能提出DNA，即在對麥盧卡蜂蜜檢測的過程中并非必須用其指定的或進口的試劑盒，國產(chǎn)試劑盒和傳統(tǒng)CTAB法也可滿足要求，若想獲取高質(zhì)量濃度的DNA，在使用的過程中可通過采用增加蜂蜜樣品量，富集花粉沉淀的方法獲取DNA，從而提高檢測效率。

同時，本研究對蜂蜜沉淀進行DNA提取的過程中，還對部分步驟進行改良，即增加了對花粉沉淀水洗的過程。這是因為基因組DNA也是糖，將蜂蜜中富集的沉淀增加水洗的過程，可以盡可能去除蜂蜜中的糖分，以避免在DNA提取的過程中造成干擾，從而提高DNA的提取效率。

3.3 蜂蜜上清液DNA提取方法的優(yōu)勢和不足

此外，為謀取利益，造假者可能將麥盧卡花粉添加到非麥盧卡蜂蜜中以假冒麥盧卡蜂蜜，所以僅僅對蜂蜜中的花粉沉淀進行檢測尚有不足。為此，本研究還建立了麥盧卡蜂蜜上清液DNA提取方法，并通過對15 份蜂蜜樣品的實際檢測，證實本方法可以有效提出蜂蜜上清液DNA。但同時研究結(jié)果顯示，利用磁珠法提取的蜂蜜上清液的DNA擴增效率低于花粉沉淀，推測原因可能是蜂蜜樣品中含有較多的糖分，會對磁珠溶液的分散體系造成影響，從而干擾了磁珠對DNA的吸附效率。但蜂蜜上清液DNA提取方法的建立彌補了以往蜂蜜蜜源植物成分溯源時僅對花粉沉淀進行檢測的不足，從而能夠分辨通過摻入花粉到糖漿中的造假蜂蜜。

4 結(jié)論

本研究建立了麥盧卡蜂蜜沉淀和上清液DNA提取方法，并建立了內(nèi)參照、麥盧卡和卡奴卡植物源性成分real-time PCR檢測方法。結(jié)果顯示，內(nèi)參照引物探針對顯花植物的通用性、覆蓋性和特異性較好，可作為內(nèi)參照進行蜂蜜樣品DNA提取的質(zhì)控檢測。麥盧卡和卡奴卡成分鑒別方法的特異性良好、靈敏度高，絕對靈敏度最低可達1 pg/μL，對混合樣品的檢出限可達0.1%。同時與MPI方法比較，證實了本研究方法的可行性、準確性和等效性。本研究建立的方法不僅可以用于麥盧卡蜂蜜的植物源靈敏、快速、高效的檢測，還能鑒別以麥盧卡花粉造假麥盧卡蜂蜜的方式，同時還可解決以往對麥盧卡蜂蜜DNA檢測需要依賴MPI官方指定檢測方法的問題，為對國境口岸麥盧卡蜂蜜的質(zhì)量監(jiān)控提供了良好的技術(shù)支撐。