基于代謝組學(xué)法鑒定液體果蠟中漂白紫膠的模型構(gòu)建

李 坤，張雯雯,，唐保山，邢淑婕，馬金菊，朱 靜，雷福厚，張 弘,

（1.信陽農(nóng)林學(xué)院食品學(xué)院，河南 信陽 464000；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院高原林業(yè)研究所，國家林業(yè)和草原局特色森林資源工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650233；3.廣西民族大學(xué) 廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西 南寧 530006）

為了保持水果和蔬菜較好的感官品質(zhì)、微生物安全和營養(yǎng)價(jià)值，延長果蔬貯藏期和貨架期，保鮮處理是果蔬采后管理的重要環(huán)節(jié)。液體果蠟是一種用于果蔬處理的涂膜劑，是廣泛使用的果蔬涂膜保鮮劑[1]。液體果蠟涂覆在果蔬表面形成一層多孔、連續(xù)的不規(guī)則薄膜，可以很好地抑制各種生理生化的反應(yīng)速率，減少水分和營養(yǎng)物質(zhì)的流失，保持果蔬的品質(zhì)[2-3]。出于安全、環(huán)保和優(yōu)質(zhì)的因素，可食性液體果蠟在果蔬中的應(yīng)用也愈發(fā)受到人們的青睞。

紫膠是紫膠蟲分泌的一種呈紫紅色的天然混合物，也叫赤膠或蟲膠，中藥學(xué)上稱為紫草茸。紫膠是目前已經(jīng)開發(fā)利用的唯一一種動(dòng)物樹脂，主要由紫膠樹脂、色素和蠟組成[4-6]。紫膠樹脂經(jīng)過漂白，去除紫膠黃色素，便得到漂白紫膠[7-9]。漂白紫膠具有原料天然、無毒的特點(diǎn)，且具有良好的成膜性、生物相容性和可降解性，是中國[10]和聯(lián)合國糧農(nóng)組織及世界衛(wèi)生組織[11]允許在食品和藥品領(lǐng)域添加的齊聚物，在果蔬保鮮領(lǐng)域應(yīng)用 極廣[12]。然而，由于近年來紫膠價(jià)格波動(dòng)，市場上出現(xiàn)了冒充漂白紫膠基液體果蠟的假冒液體果蠟產(chǎn)品。中國已發(fā)生數(shù)件因液體果蠟中是否含有漂白紫膠的爭議而引發(fā)的商業(yè)糾紛案件。然而，由于缺乏相應(yīng)的檢測手段，不僅從業(yè)者面對琳瑯滿目的樣品時(shí)難以辨別，相關(guān)管理部門也顯得無能為力。

紫膠樹脂是由多種脂肪酸和倍半萜烯酸組成的內(nèi)酯和交酯[13]，是一系列復(fù)雜單體形成的聚酯混合物，沒有固定的結(jié)構(gòu)和組成，這給紫膠的檢測帶來了極大的困難。漂白紫膠是紫膠樹脂經(jīng)漂白后形成的淺色紫膠樹脂，漂白過程中除色素等發(fā)色基團(tuán)被破壞外，同時(shí)不同程度地對紫膠樹脂產(chǎn)生影響，這無疑加劇了紫膠樹脂結(jié)構(gòu)和組成的復(fù)雜性。在液體果蠟配方中，漂白紫膠 是成膜基質(zhì)，此外還含有其他類型聚合物或輔助性添加物[14]，這些物質(zhì)的干擾再次增加了漂白紫膠檢測的難度。目前，紫膠的檢測方法可采用光譜法[15]，其雖可與紫膠結(jié)構(gòu)產(chǎn)生直接的關(guān)聯(lián)，但當(dāng)紫膠存在于混合物中時(shí)可靠性急劇下降。此外，Wang Lili[16]和Sutherland[17]等分別采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用及熱裂解氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用在分子水平上獲得紫膠組成的詳細(xì)信息。然而，由于氣相色譜需要化學(xué)或熱預(yù)處理，容易造成紫膠組成的信息丟失[18]。為此，Tamburini[18]和Coelho[19]等探索了以 液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，LC-QTOF-MS）的方法檢測紫膠的工作。這不僅促使業(yè)界深入認(rèn)識了紫膠的化學(xué)組成，同時(shí)給液體果蠟保鮮涂膜中漂白紫膠的定性檢測帶來了啟示。

代謝組學(xué)是一種旨在識別和量化小分子代謝物的新型研究手段，它從整體角度出發(fā)，運(yùn)用現(xiàn)代檢測技術(shù)對目標(biāo)物中盡可能多的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析檢測。代謝組學(xué)與現(xiàn)代儀器分析方法和化學(xué)計(jì)量學(xué)的結(jié)合大幅促進(jìn)了其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用。隨著高精度、高分辨儀器的發(fā)展和數(shù)據(jù)庫的不斷完善，目前，已在微生物代謝[20]、藥物開發(fā)[21]、毒性評價(jià)[22]等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。

本實(shí)驗(yàn)借鑒代謝組學(xué)的研究思路和方法，通過LC-QTOF-MS和蒸發(fā)光散射檢測器（evaporative lightscattering detector，ELSD）結(jié)合的方式，對漂白紫膠的組成成分進(jìn)行鑒定分析，并篩選出其共性化合物組分，從而建立漂白紫膠的定性分析方法。最后，通過商業(yè)化液體果蠟和對照品的驗(yàn)證性分析證明方法的可靠性，為液體果蠟產(chǎn)品中漂白紫膠的定性鑒定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

漂白紫膠分別來自B（17 個(gè)樣本）、D（27 個(gè)樣本）、L（54 個(gè)樣本）、X（18 個(gè)樣本）和Z（18 個(gè)樣本）5 個(gè)組。5 組樣品分別購自云南省漂白紫膠的五家主要生產(chǎn)企業(yè)：安寧戴科精細(xì)化工有限公司、昆明西萊克生物科技有限公司、貝思帝諾生物科技（昆明）有限公司、云南澤林林業(yè)科技有限公司、墨江縣洪森蟲膠有限公司（樣本編碼與企業(yè)無對應(yīng)關(guān)系）。

GL-1實(shí)驗(yàn)室中制備，漂白紫膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)9%的液體果蠟產(chǎn)品；GL-2～GL-4為中國市場隨機(jī)購買的商業(yè)液體果蠟產(chǎn)品。

(±)-9,10,16-三羥基棕櫚酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）TCL（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）賽默飛世爾科技（中國）有限公司；甲酸（分析純）天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

6540LC-QTOF-MS儀、1260B型蒸發(fā)光散射檢測器 美國Agilent有限公司；AB204-S電子天平 梅特勒-托利多（中國）有限公司；FD-1C-50冷凍干燥機(jī) 北京 博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；PURELAB ELGA純水機(jī) 萊特萊德（北京）環(huán)境技術(shù)股份有限公司；78-1磁力加熱攪拌器 金壇市杰瑞爾電器有限公司；高純氮（純度≥ 99.999%）昆明廣瑞達(dá)氣體有限公司。

1.3 方法

1.3.1 漂白紫膠樣品的預(yù)處理

稱取漂白紫膠樣品各20 g放入250 mL帶冷凝器的圓底燒瓶中，各加入200 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%氫氧化鈉溶液在90 ℃攪拌反應(yīng)30 h。反應(yīng)停止后各加入飽和氯化鈉溶液200 mL進(jìn)行鹽析，鹽析目的是去除大部分的紫膠桐酸（aleuritic acid，Ale），此為Ale的堿水解制備方 法[23-24]，以免Ale單一組分含量過高對其他化合物的檢測靈敏度和準(zhǔn)確性造成干擾。然后用硅藻土作為過濾介質(zhì)進(jìn)行抽濾，濾液用18%鹽酸溶液酸化至弱酸性，之后離心，沉淀用水洗至中性，最后冷凍干燥備用。

1.3.2 液體果蠟樣品的預(yù)處理

量取各商用液體果蠟100 mL，其他步驟與1.3.1節(jié)保持一致。

1.3.3 HPLC-QTOF-MS分析條件

色譜條件：Zorbax 5 SB-C18色譜柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積10 μL；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）進(jìn)行梯度洗脫；洗脫程序：0～60 min，5%～100% A、95%～0% B；流速1.0 mL/min。

ELSD參數(shù)：霧化器溫度60 ℃；蒸發(fā)管溫度60 ℃；氣體流速1.6 L/min（高純氮）。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離源，負(fù)離子模式；噴霧電壓為3500 V；工作氣為氮?dú)猓F化氣壓力35 psi；離子源溫度350 ℃；碰撞能量10 eV；碰撞能量范圍±1.0 eV。建立信息關(guān)聯(lián)采集方法結(jié)合動(dòng)態(tài)背景扣除，設(shè)置一級 質(zhì)譜質(zhì)量掃描范圍m/z100～1700，二級質(zhì)譜質(zhì)量掃描范圍為m/z50～1700，在每個(gè)循環(huán)內(nèi)同時(shí)進(jìn)行10 個(gè)MS/MS掃描。

1.3.4 質(zhì)控樣本

質(zhì)控（quality control，QC）主要是為了保證樣品檢測過程的準(zhǔn)確性，對提取或檢測過程中差異較大的樣品或代謝物質(zhì)進(jìn)行分析判斷[25-26]。QC樣本由不同來源的5 組樣本目標(biāo)物等量混合制備而成，共3 個(gè)重復(fù)，用來分析樣品在相同處理方法下的重復(fù)性。在儀器分析過程中，每5 個(gè)檢測樣本加入一個(gè)QC樣本，通過對不同QC樣本展示分析，考察整個(gè)分析過程的重復(fù)性。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理與化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

使用Qualitative Analysis B.06.00軟件對HPLC-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，之后結(jié)合網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫和相關(guān)文獻(xiàn)記載（表1）進(jìn)行對比，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證，確定物質(zhì)結(jié)構(gòu)?；衔锎_定后，通過HPLC-ELSD歸一法計(jì)算相對含量，最后將處理的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件，進(jìn)行無監(jiān)督的主成分分析（principal component analysis，PCA）和有監(jiān)督的偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）等多元統(tǒng)計(jì)分析，再根據(jù)變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）和組間變化的顯著性（P＜0.05）進(jìn)行差異性化合物和共性化合物的篩選[27-28]。

表1 文獻(xiàn)中組成紫膠樹脂單體的已知化合物Table 1 Compounds from shellac monomer reported in the literature

2 結(jié)果與分析

2.1 漂白紫膠中靶向化合物的確定

從結(jié)構(gòu)看，漂白紫膠是由種類眾多的環(huán)狀組分和鏈狀組分形成的內(nèi)酯與交酯；從組成看，漂白紫膠是由一系列結(jié)構(gòu)類似化合物組成的復(fù)雜混合物，并且漂白紫膠的結(jié)構(gòu)和組成還受到不同漂白工藝的影響，這些影響給漂白紫膠的檢測帶來了極大的不確定性[29-30]。因此，直接以漂白紫膠為靶向化合物進(jìn)行差異或共性化合物的鑒定分析時(shí)難度較大，尤其靶向化合物的鑒定十分困難。為解決上述問題，選擇組成漂白紫膠單體的鏈狀和環(huán)狀化合物進(jìn)行靶向化合物的篩選。由圖1可知，漂白紫膠鑒定的化合物為15 種，其中環(huán)狀組分為8 種，鏈狀組分為7 種，具體化合物見表2。

圖1 LC-QTOF-MS檢測樣品的總離子流圖Fig.1 Total ion flow chromatogram of compounds from bleached shellac samples detected by LC-QTOF-MS

表2 LC-QTOF-MS在目標(biāo)物中檢測到的特征標(biāo)記化合物Table 2 Overview of characteristic biomarker compounds detected by LC-QTOF-MS

2.2 漂白紫膠樣品的HPLC-ELSD定量檢測

在檢測中發(fā)現(xiàn)，由于不同結(jié)構(gòu)單體化合物電離響應(yīng)性的差異，目標(biāo)物的質(zhì)譜檢測器和ELSD的響應(yīng)強(qiáng)度存在明顯區(qū)別[31]。依據(jù)2 種檢測器的響應(yīng)差異，進(jìn)一步將在HPLC-ELSD中響應(yīng)信號不明顯的LSA、LJA和BA去掉，從而將漂白紫膠靶向化合物的篩選范圍限定在12 種化合物中（圖2）?？紤]到不同來源的漂白紫膠分析是以尋找共性靶向化合物為目的，因此，為了消除質(zhì)譜檢測時(shí)電離響應(yīng)性差異所帶來的離子豐度差異，獲得化合物更加真實(shí)的含量數(shù)據(jù)，在以LC-QTOF-MS中化合物的分子質(zhì)量和碎片完成靶向化合物的鑒定后，選擇以HPLC-ELSD的方法對漂白紫膠單體的化合物組成進(jìn)行峰面積歸一法的定量分析，以靶向化合物含量進(jìn)行代謝組學(xué)的聚類和差異性分析。

圖2 不同組漂白紫膠的HPLC-ELSD定量分析圖Fig.2 Quantitative analysis of target compounds from different groups of bleached shellac by HPLC-ELSD

2.3 靶向代謝組學(xué)模型的建立和分析

2.3.1 聚類分析

為進(jìn)一步明確不同來源漂白紫膠在單體組成上的聚類特征，首先對樣本進(jìn)行無監(jiān)督模式下的PCA。如圖3a 所示，6 個(gè)PC的相關(guān)性僅達(dá)到95.9%，PC1、PC2、PC3的占比為87.8%。這說明各個(gè)來源組的樣本較為分散，聚類特征不明顯。PCA雖然能夠有效地提取主要信息，但是對于相關(guān)性較小的變量不敏感，而PLS-DA可以使組間區(qū)分最大化，有利于尋找差異性化合物。在無監(jiān)督PCA基礎(chǔ)上進(jìn)行有監(jiān)督模式下的PLS-DA，由圖3b可知，QC樣本聚類明顯，表明實(shí)驗(yàn)操作及儀器穩(wěn)定，數(shù)據(jù)可靠。L組的樣品相對分散，B組的樣品聚類明顯。說明PLS-DA模型解釋度較好，相比于PCA模型效果更好。且PLS-DA模型的為0.999，R2Y為0.589，Q2為0.54，3 個(gè)參數(shù)值均大于0.5，說明模型建立合理有效[32]。

圖3 靶向化合物的無監(jiān)督PCA（a）和有監(jiān)督PLS-DA（b）得分圖Fig.3 Score plots of PCA (a) and PLS-DA (b) of target compounds

2.3.2 果蠟保鮮劑中紫膠樹脂的靶向代謝組學(xué)鑒定模型

為了直觀呈現(xiàn)12 種靶向化合物在不同5 個(gè)來源組漂白紫膠中的分布情況，將化合物含量繪制熱圖（顏色編碼刻度表示每個(gè)化合物的相對含量：綠色為含量低，紅色為含量高）。如圖4所示，5 個(gè)來源組漂白紫膠中單體化合物的含量及分布均有差異。B組漂白紫膠中的 16-HAA、9,10-DAA、9,10-DEA含量較為豐富；D組漂白紫膠中的Ale、9,10-DAA、LA、LLA、9,10-DTA的含量相對豐富；L組漂白紫膠中的9,10-DTA、SA、JA、JAI、SAI、LLA、16-H-9-A含量相對豐富；X組漂白紫膠中的LA、9,10-DEA、9,10-DAA、JAI、16-HAA、16-H-9-A的含量相對豐富；Z組漂白紫膠中的Ale、SAI、SA、JA、JAI、LLA、LA的含量相對豐富。

圖4 靶向化合物熱圖Fig.4 Heatmap of target compounds

液體果蠟是以漂白紫膠為選擇性配方之一的商業(yè)化產(chǎn)品，一般不以漂白紫膠原料來源對產(chǎn)品做有效區(qū)分。換言之，液體果蠟中的漂白紫膠原料可能來源于任意一個(gè)組。因此，為增加定性檢測方法的可靠性，必須要求在靶向化合物中所篩選出的標(biāo)志性化合物是5 個(gè)組的共性化合物，且含量差異較小。熱圖雖然可以直觀地顯示各種化合物的含量水平與分布情況，但哪些化合物可作為不同組漂白紫膠的共性化合物，并可用于漂白紫膠的定性分析并不能直接給出結(jié)論。為此，采用代謝組學(xué)差異性分析的方法，進(jìn)一步對不同靶向化合物在5 個(gè)組漂白紫膠中的代表性進(jìn)行分析。

如圖5a所示，化合物離中心點(diǎn)越近，說明該化合物在5 個(gè)組中的共性越強(qiáng)，離中心點(diǎn)越遠(yuǎn)，則表示該化合物在5 個(gè)組中的差異性越大。顯然，16-H-9-A、Ale、16-HAA、9,10-DTA、LA是偏離中心點(diǎn)較遠(yuǎn)的化合物，說明其在5 個(gè)組中有較大的差異。為量化評價(jià)這種差異性，通過化合物（變量）的VIP值對相關(guān)性進(jìn)行排序，結(jié)果如圖5b所示。通常認(rèn)為VIP值大于1的化合物，可作為差異性化合物。相反，VIP值小于1的化合物，則可作為共性化合物[33-34]。因此，漂白紫膠的共性化合物（標(biāo)志性化合物）有7 種，按照相關(guān)性由大到小排序?yàn)镾AI、9,10-DEA、JA、SA、LLA、JAI、9,10-DAA；差異性化合物共5 種，按照差異性由大到小的順序?yàn)?6-H-9-A、Ale、16-HAA、9,10-DTA、LA。對比上述7 種共性化合物后發(fā)現(xiàn)，僅有9,10-DEA和9,10-DAA為鏈狀組分，其余5 種均為環(huán)狀萜烯。而在5 種差異性化合物中，僅有LA為環(huán)狀組分，其余4 種均為鏈狀脂肪酸。在化合物本身對紫膠樹脂的標(biāo)識性方面，脂肪酸具有更加廣泛的來源和豐富的結(jié)構(gòu)，因此，環(huán)狀萜烯酸相對特殊的結(jié)構(gòu)和組成更加適合作為漂白紫膠的特征標(biāo)識物用在液體果蠟中漂白紫膠的鑒定分析中。

圖5 靶向代謝物的PLS-DA載荷圖（a）和VIP值（b）Fig.5 Loading plot (a) and VIP values (b) of PLS-DA for target compounds

2.4 商業(yè)化液體果蠟中漂白紫膠的鑒定分析

以上述篩選出的標(biāo)志性化合物為依據(jù)、從市場隨機(jī)購買不同品牌并在產(chǎn)品說明書中標(biāo)明含有漂白紫膠的液體果蠟商業(yè)產(chǎn)品（GL-2～GL-4）為檢測樣品、實(shí)驗(yàn)室自制的樣品（GL-1）作為對照品，按照1.3.2節(jié)方法進(jìn)行樣品處理后進(jìn)行HPLC-ELSD檢測，結(jié)果如圖6所示。在本研究所選的3 種市售液體果蠟產(chǎn)品中，GL-2檢出了本實(shí)驗(yàn)鑒定的12 種靶向化合物，且與對照品（GL-1）的鑒定結(jié)果高度一致。從GL-4樣品的色譜圖中看出，該液體果蠟中不含有漂白紫膠中的靶向化合物，可基本判斷該液體果蠟產(chǎn)品中不含有漂白紫膠。在GL-3樣品中未檢測到漂白紫膠樹脂的共性化合物，但從色譜圖中看出GL-3樣品中檢測出了Ale組分，而Ale組分是本研究得出的差異性化合物之一，目前，依據(jù)公開的文獻(xiàn)資料，在除紫膠以外的其他物質(zhì)中，未見發(fā)現(xiàn)Ale的研究報(bào)道，因此從理論上來講，Ale可作為漂白紫膠的標(biāo)識性化合物。但根據(jù)上述代謝組學(xué)的鑒定結(jié)果，僅以Ale作為液體果蠟中漂白紫膠的標(biāo)識性化合物時(shí)不僅含量波動(dòng)大，影響其檢測準(zhǔn)確性；且Ale作為一種多羥基脂肪酸類的化合物已是成熟的商業(yè)化產(chǎn)品，可通過在配方中添加的方式達(dá)到規(guī)避檢測的目的。因此，不能僅憑借GL-3樣品中含有Ale就判定該產(chǎn)品中含有漂白紫膠，這也是本研究篩選共性化合物的意義所在，只有同時(shí)含有7 種共性化合物才可作為漂白紫膠定性的依據(jù)。因此，GL-3、GL-4樣品中不含漂白紫膠，GL-2中含有漂白紫膠。綜上可見，本研究建立的標(biāo)識性化合物篩選方法，對果蔬保鮮液體果蠟中漂白紫膠的定性分析具有較高的可靠性。

圖6 HPLC-ELSD法檢測商業(yè)化液體果蠟產(chǎn)品的色譜圖Fig.6 Chromatograms of target compounds in commercial liquid fruit wax products detected by HPLC-ELSD

3 結(jié)論

針對液體果蠟中是否添加漂白紫膠的問題，借鑒代謝組學(xué)的方法，采用基于LC-QTOF-MS結(jié)合ELSD的檢測技術(shù)，通過收集不同來源且具有代表性的漂白紫膠開展系統(tǒng)研究。由無監(jiān)督的PCA和有監(jiān)督的PLS-DA多元統(tǒng)計(jì)分析，鑒定出12 種已知代表性的化合物。結(jié)合化合物VIP值大小，分為7 種共性化合物（SAI、9,10-DEA、JA、SA、LLA、JAI、9,10-DAA）和5 種差異性化合物（16-H-9-A、Ale、16-HAA、9,10-DTA、LA）。為增加檢測方法的可靠性，以共性化合物為生物標(biāo)識物，在市售的商業(yè)化液體果蠟產(chǎn)品中驗(yàn)證了該方法的可行性。結(jié)果表明，本研究可為液體果蠟中是否含有漂白紫膠的鑒定分析提供新思路和科學(xué)依據(jù)。