超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物源性食品中的13 種利尿劑

任曉偉，范力欣，何亮娜，孫 磊，馬俊美

（河北省食品安全重點實驗室，國家市場監(jiān)管重點實驗室（特殊食品監(jiān)管技術(shù)），特殊食品安全與健康河北省工程研究中心，河北省食品檢驗研究院，河北 石家莊 050000）

利尿劑是作用于腎臟，增加電解質(zhì)和水排出的能夠產(chǎn)生利尿作用的一類藥物[1]，在臨床上廣泛應(yīng)用于利尿消腫、降壓和腦水腫等治療[2-5]。利尿劑因為具有很強的排尿能力在需要快速減肥才能達到某一體質(zhì)量類別的運動中經(jīng)常被濫用。利尿劑還可以作為掩蔽劑增加尿量，從而稀釋一些違禁興奮劑的濃度，使這些違禁興奮劑的檢測變得更加困難。例如呋塞米和布美他尼等高效利尿劑可使尿液中興奮劑的濃度降低4～5 倍[6]。此外，碳酸酐酶抑制劑組的利尿劑會導(dǎo)致尿液呈堿性，從而抑制堿性興奮劑的排泄，導(dǎo)致興奮劑的陰性分析[6-9]。1988年漢城奧運會期間，4 名運動員的利尿劑速尿檢測呈陽性。1988年另一種引起廣泛關(guān)注的利尿劑丙磺舒，它能有效減少合成類固醇和抗生素的排泄，使尿液中的類固醇濃度降低至原來的十分之一。因此在使用丙磺舒后對合成類固醇和抗生素的準確分析難度較大。自1988年，國際奧委會禁止在冬季和夏季奧運會上使用不同種類的利尿劑。另外，利尿劑還被應(yīng)用到動物飼養(yǎng)當(dāng)中，用于治療奶牛乳房炎，或者是改善禽蛋蛋白比例等[10]。這會使利尿劑在動物體內(nèi)存在殘留。運動員誤食這些食品后不僅會對身體健康產(chǎn)生負面影響，也會造成尿檢陽性事件。所以開發(fā)出一種靈敏、簡捷的檢驗食品中違禁利尿劑的分析技術(shù)手段刻不容緩。

由于動物源性食品中利尿劑的微量存在和顯著的基質(zhì)效應(yīng)，前處理過程在儀器分析之前至關(guān)重要。為了獲得更好的分析準確度，需要去除樣品基質(zhì)中的干擾。在以往的一些研究中，利尿劑的凈化方法主要是液-液萃?。╨iquid-liquid extraction，LLE）和常規(guī)的固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）[11-14]。這些方法往往需要較長的提取時間，大量的溶劑和繁雜的后續(xù)步驟。本實驗中使用PRiME HLB通過式固相萃取柱凈化。PRiME HLB通過式固相萃取柱是近年來發(fā)展起來的一種直通型SPE固相萃取柱[15-18]。它將提取、濃縮、凈化融為一體，不僅能有效去除樣品基質(zhì)中的脂肪和磷脂類化合物等雜質(zhì)，而且使用前無需活化和平衡[19]。直通型SPE固相萃取柱既精簡了實驗的前處理過程，又提高了分析準確度。

目前，利尿劑的檢測主要針對人及動物的尿樣、保健品和飼料等樣品，方法有薄層色譜（thin-layer chromatography，TLC）法[20]、循環(huán)伏安法[21]、膠束液相色譜法[22]、液相色譜（liquid chromatography，LC）法[23-24]、液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）法[25-28]、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[29-30]等。其中LC-MS和GC-MS是兩種比較常見的方法。但是在使用GC-MS法對利尿劑進行分析時，為提高利尿劑的揮發(fā)性，在GC-MS分析前需要對樣品進行甲基化或硅烷化等衍生化處理[16]。而衍生化處理包含許多實驗步驟，前處理過程比較復(fù)雜。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）不僅不用衍生化的處理，而且靈敏度高、準確度好、應(yīng)用廣泛。因此，本實驗開發(fā)出了一種直通型SPE聯(lián)合內(nèi)標法檢測13 種利尿劑的新型UPLC-MS/MS方法。該方法簡單高效、精密度好、重復(fù)性好和特異性強，適用于動物源性食品中13 種利尿劑的批量、準確檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋、牛奶、雞肉和豬肉食品樣品來源于本地農(nóng)貿(mào)市場，均未檢出實驗中涉及的13 種利尿劑。

氨苯蝶啶、螺內(nèi)酯、坎利酮、乙酰唑胺、4-氨基-6-氯苯-1,3-二磺酰胺、氯噻嗪、氫氯噻嗪、氯噻酮、呋塞米、芐氟噻嗪、托拉塞米、坎利酮-D6、氫氯噻嗪-13C-D2、呋塞米-D5、乙酰唑胺-D3、氯噻酮-D4、芐氟噻嗪-D5、氨苯蝶啶-D5、氯噻嗪-13C15N2、丙磺舒-D14、4-氨基-6-氯苯-1,3-二磺酰胺-N2、托拉塞米-D7標準物質(zhì)（純度大于95%）天津ALTA科技有限公司；丙磺舒標準物質(zhì)（純度＞95%）CATO Research Chemicals公司；托伐普坦、托伐普坦-D7標準物質(zhì)（純度＞95%）加拿大 TLC PharmaChem有限公司；乙腈、甲醇、正己烷（均為色譜純）美國Millipore公司；甲酸（色譜純）美國Sigma公司；乙酸銨（純度98%）上海麥克林生化科技有限公司；超純水 屈臣氏商標有限公司；Oasis PRiME HLB固相萃取柱（200 mg/6 mL）美國Waters公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TSQ Quantiva UPLC-MS/MS儀 美國Thermo公司；Elmasonic P300H超聲波清洗器 德國Elma公司；3-18KS離心機 美國Sigma公司；Multi Reax振蕩器 德國Heidolph公司；N-EVAP 112氮吹儀 美國Organomation 公司；ME204E/02電子分析天平（感量0.00001 g）Mettler Toledo國際貿(mào)易（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準品溶液的配制

1.3.1.1 標準貯存液、內(nèi)標貯存液

準確稱取13 種利尿劑標準品和12 種利尿劑內(nèi)標標準品，分別使用甲醇配制為0.1 mg/mL的利尿劑標準貯存液和內(nèi)標貯存液（氨苯蝶啶和氨苯蝶啶-D5標準品需先用甲酸溶解，再用甲醇稀釋并定容）。于-20 ℃避光貯存，有效期6 個月。

1.3.1.2 混合標準工作液

準確量取氯噻嗪、氫氯噻嗪、芐氟噻嗪、坎利酮和托拉塞米的外標貯存液（1.3.1.1節(jié)）各1 mL，氯噻酮、乙酰唑胺、呋塞米、螺內(nèi)酯、4-氨基-6-氯苯-1,3-二磺酰胺、氨苯蝶啶、丙磺舒和托伐普坦的外標貯存液（1.3.1.1節(jié)）各2.5 mL，到同一100 mL容量瓶中，甲醇定容?；旌贤鈽斯ぷ饕褐新揉玎骸渎揉玎?、芐氟噻嗪、坎利酮和托拉塞米的質(zhì)量濃度為1 μg/mL；氯噻酮、乙酰唑胺、呋塞米、螺內(nèi)酯、4-氨基-6-氯苯-1,3-二磺酰胺、氨苯蝶啶、丙磺舒和托伐普坦的質(zhì)量濃度為 2.5 μg/mL。4 ℃以下避光貯存，有效期1 個月。

1.3.1.3 混合內(nèi)標工作液

量取12 種利尿劑內(nèi)標貯存液（1.3.1.1節(jié)）各1 mL，到同一100 mL容量瓶中，甲醇定容。混合內(nèi)標工作液中12 種利尿劑內(nèi)標質(zhì)量濃度為1 μg/mL。4 ℃以下避光貯存，有效期1 個月。

1.3.2 樣品前處理1.3.2.1 試樣制備

取雞蛋、雞肉和豬肉試樣約200 g（雞蛋需去殼），用勻漿機充分勻漿均勻，放入潔凈聚乙烯瓶中，于4 ℃冷藏密封保存。取牛奶試樣攪拌均勻，裝入潔凈聚乙烯瓶中，于4 ℃冷藏密封保存。

1.3.2.2 提取

準確稱取均質(zhì)后試樣2 g于（精確至0.01g）50 mL塑料離心管中，添加1 μg/mL的12 種利尿劑混合內(nèi)標工作液（1.3.1.3節(jié)）40 μL，加入10 mL 90%乙腈溶液（對于豬、牛、羊、禽類食品）/乙腈（對于蛋、奶類食品），于旋渦振蕩器上劇烈振蕩2 min，超聲15 min，4 ℃、8000 r/min離心5 min。加入3 mL正己烷溶液（乙腈飽和），低速渦旋10 s，4 ℃、8000 r/min離心3 min，取乙腈層待凈化。

1.3.2.3 凈化

取上述提取液5 mL過PRiME HLB固相萃取柱，以不大于1 mL/min的速率通過固相萃取柱，用帶有刻度的玻璃試管準確接收流出的樣液，并用1 mL的90%乙腈-甲醇溶液淋洗過柱，接收全部液體。洗脫液于40 ℃氮氣吹至近干。加入1 mL乙腈-水（1∶1，V/V）溶液溶解殘渣，過0.22 μm微孔濾膜，待測。

1.3.3 樣品檢測

1.3.3.1 色譜條件色譜柱：ACQUITY HSS T3色譜柱（100 mm× 2.1 mm，1.8 μm）；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL；流速：0.3 mL/min；流動相：流動相和梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧（electrospray ion source，ESI）離子源；離子化電壓＋3500 V/-2500 V；離子傳輸管溫度342 ℃；加熱溫度358 ℃；鞘氣（N2）：35 arb；輔助氣（N2）：10 arb；13 種利尿劑及其內(nèi)標物的其他質(zhì)譜參數(shù)見表2、3。

表2 13 種利尿劑的MRM參數(shù)和內(nèi)標物Table 2 MRM parameters and internal standards of 13 diuretics

表3 12 種利尿劑內(nèi)標物的MRM參數(shù)Table 3 MRM parameters of 12 internal standards of diuretics

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理條件的優(yōu)化

甲醇和乙腈是動物源性食品中常用的有機提取試劑，考察甲醇和乙腈對13 種利尿劑的提取效果。結(jié)果顯示：用乙腈時響應(yīng)值普遍更高，13 種利尿劑的回收率更好（圖1）。據(jù)報道，乙腈具有蛋白質(zhì)沉淀效果好、相容性好、脂溶性低等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于食品中有毒有害物質(zhì)的提取[31-32]。但是，當(dāng)使用甲醇或乙腈提取時，肌肉組織容易聚集導(dǎo)致提取溶劑不能充足的滲入樣品，而使用有機試劑的水溶液就能有效避免肌肉組織的這種聚集。因此，本研究還對比乙腈、90%乙腈溶液和80%乙腈溶液對肌肉組織中利尿劑的提取效果。結(jié)果顯示：對于豬、牛、羊、禽類使用90%乙腈溶液提取效果更好（圖2）。對于豬、牛、羊、禽類食品，最佳提取溶劑為90%乙腈溶液；對于雞蛋和牛奶類食品，最佳提取溶劑是乙腈。另外，動物源性食品中基質(zhì)復(fù)雜。進樣前進行凈化處理是很有必要的。本研究采用PRiME HLB通過式固相萃取柱凈化，省去了常規(guī)SPE的分析操作步驟（活化、淋洗和調(diào)整pH值）。該操作能有效分離出動物源性食品中富含的磷脂類化合物和脂肪等物質(zhì)，提高分析靈敏度。由圖3可見，經(jīng)PRiME HLB通過式固相萃取柱凈化后的雞肉樣品，以基質(zhì)成分的強度估算，基質(zhì)成分明顯減少。

圖1 甲醇和乙腈對13 種利尿劑回收率的影響Fig.1 Effects of methanol and acetonitrile on recoveries of 13 diuretics

圖2 乙腈、90%乙腈溶液和80%乙腈溶液在肌肉中對 13 種利尿劑回收率的影響Fig.2 Effects of acetonitrile,90% acetonitrile solution and 80% acetonitrile solution on recoveries of 13 diuretics from muscle

圖3 未經(jīng)PRiME HLB凈化（A）和經(jīng)PRiME HLB凈化（B）的 空白雞肉樣品的總離子流圖比較Fig.3 Total ion current chromatograms of blank chicken sample before (A) and after (B) purification on PRiME HLB column

2.2 基質(zhì)效應(yīng)評價

基質(zhì)效應(yīng)會抑制或增強被分析物的信號，導(dǎo)致定量結(jié)果的不準確和儀器壽命縮短。在本研究中，采用基質(zhì)和溶劑所繪標準曲線的斜率比值評價基質(zhì)效應(yīng)對實驗結(jié)果的影響程度。當(dāng)斜率比值大于1.2或小于0.8時，基質(zhì)效應(yīng)就會影響分析結(jié)果[33]。為有效消除基質(zhì)效應(yīng)對分析結(jié)果造成的影響，本實驗選用雞肉作為基質(zhì)對比無內(nèi)標和有內(nèi)標時13 種利尿劑的基質(zhì)效應(yīng)。如表4所示，在不使用內(nèi)標時僅有7 種利尿劑無顯著的基質(zhì)效應(yīng)。而使用內(nèi)標后13 種利尿劑的斜率比值均在0.8～1.2之間，基質(zhì)效應(yīng)對分析結(jié)果的影響可以忽略。這一結(jié)果證實了內(nèi)標法可以消除基質(zhì)效應(yīng)造成的定量結(jié)果偏差，提高檢測方法的穩(wěn)定性和精準性。

表4 無內(nèi)標和有內(nèi)標時13 種利尿劑的基質(zhì)效應(yīng)Table 4 Matrix effects of 13 diuretics in the absence and presence of internal standard

2.3 色譜條件的優(yōu)化

本研究測驗多個液相色譜參數(shù)對13 種利尿劑及其內(nèi)標物分離效果的影響。對比Waters XBridge BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）和ACQUITY HSS T3柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）的分離性能，結(jié)果顯示，ACQUITY HSS T3色譜柱在峰形、分辨率、保留時間等方面表現(xiàn)更好；流動相的組成對分析物的電離和質(zhì)譜的檢測靈敏度都有一定的影響，乙腈是一種常用的流動相，具有很強的洗脫能力，乙酸銨可以有效的改善色譜峰的峰形，因此，本研究的流動相采用乙腈和乙酸銨溶液，同時使用梯度洗脫對目標化合物進行有效分離。圖4顯示了13 種利尿劑優(yōu)化后的SRM譜圖。

圖4 13 種利尿劑的提取離子色譜圖Fig.4 Extracted ion chromatograms of 13 diuretics

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將13 種利尿劑及其內(nèi)標物的標準溶液注入質(zhì)譜，從結(jié)構(gòu)上分析，有的化合物容易帶正電荷，即正離子電離信號響應(yīng)強；有的化合物容易帶負電荷，即負離子電離信號響應(yīng)強。因此，母離子掃描使用ESI＋/ESI-模式。其中在正模式下，質(zhì)子化的分子[M＋H]＋作為基峰；在負模式下，去質(zhì)子化的分子[M-H]-作為基峰。在這種條件下，對相應(yīng)的母離子峰實施后續(xù)的子離子掃描，得到它們各自的子離子，并挑選2 對響應(yīng)值高的子離子進行二級質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化。優(yōu)化后的相關(guān)參數(shù)見表2、3。

2.5 線性關(guān)系考察和方法定量限

使用利尿劑混合標準工作液（1.3.1.2節(jié)）以及內(nèi)標工作液（1.3.1.3節(jié)）通過50%乙腈溶液配制成混合標準系列溶液。其中氯噻嗪、氫氯噻嗪、芐氟噻嗪、坎利酮和托拉塞米的質(zhì)量濃度為2、5、10、20 ng/mL和 50 ng/mL；氯噻酮、乙酰唑胺、呋塞米、螺內(nèi)酯、4-氨基-6-氯苯-1,3-二磺酰胺、氨苯蝶啶、丙磺舒和托伐普坦質(zhì)量濃度為5、12.5、25、50 ng/mL和125 ng/mL；內(nèi)標溶液的質(zhì)量濃度為20 ng/mL?，F(xiàn)用現(xiàn)配，后對配制的標準系列溶液進行數(shù)據(jù)分析。

使用內(nèi)標法對供試品溶液中的利尿劑進行數(shù)據(jù)分析，其中內(nèi)標法采用以各個利尿劑質(zhì)量濃度為X軸，以各個利尿劑對其內(nèi)標物的峰面積的比值為Y軸。測定數(shù)據(jù) 見表5。

表5 13 種利尿劑的線性關(guān)系和定量限Table 5 Calibration equations and LOQs of 13 diuretics

2.6 回收率和精密度實驗結(jié)果

實驗選取豬肉、雞肉、雞蛋和牛奶4 種空白基質(zhì)進行精密度和準確度的實驗，在每種空白基質(zhì)中分別加入相應(yīng)量的13 種利尿劑混合標準工作液以及混合內(nèi)標工作液制成一定濃度的質(zhì)控樣本：高、中和低濃度水平，每個水平獨立檢測6 次。如表6所示，在豬肉中，加標回收率為68.8%～115.9%以內(nèi)，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為0.47%～9.5%。在雞肉中，加標回收率在73.0%～116.6%以內(nèi)，RSD為0.51%～9.3%。在雞蛋中加標回收率為68.3%～117.9%，RSD 為0.59%～8.7%。在牛奶中加標回收率為69.9%～118.0%，RSD為0.72%～6.6%。

表6 13 種利尿劑的回收率和RSD（n=6）Table 6 Recoveries and RSDs of 13 diuretics from spiked real samples (n =6)

3 結(jié)論

本實驗成功地開發(fā)了一種通過式SPE-UPLC-MS/MS同時檢測肉、蛋、奶食品中13 種利尿劑的新型方法。采用乙腈或90%乙腈溶液為提取試劑，有效提取樣品中13 種利尿劑，采用PRiME HLB柱凈化后，有效去除了樣品中的雜質(zhì)，同時使用同位素內(nèi)標法在一定程度上排除了基質(zhì)效應(yīng)對結(jié)果的干擾。該方法簡單、高效，實現(xiàn)了對動物源性食品中13 種利尿劑的精確定量分析。本方法不僅可以作為一種執(zhí)法監(jiān)督和檢查手段，為動物源性食品中的利尿劑的檢測提供依據(jù)，也可以作為其他方法的輔助手段，為其他研究人員提供技術(shù)支持。