抗纖益心方調(diào)控線粒體質(zhì)量控制對(duì)大鼠心肌細(xì)胞肥大模型的影響

馮堯偉，劉舜禹，黑炫鼎，強(qiáng)祎彤，常紅波，王振濤，王占利（. 河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450008；. 河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 45000）

擴(kuò)張型心肌?。―ilated cardiomyopathy，DCM）是以心室擴(kuò)張和心肌收縮功能障礙為主要特征的非缺血性心肌疾病，臨床常表現(xiàn)為進(jìn)行性心力衰竭，其預(yù)后較差，5 年病死率為42.24%[1-2]。線粒體質(zhì)量控制主要包括了線粒體動(dòng)力學(xué)（融合/分裂）、線粒體自噬及線粒體生物合成，在DCM 的發(fā)展過程中存在線粒體質(zhì)量控制失衡的狀態(tài)[3-4]。沉默信息調(diào)節(jié)因子3（Silent Information Regulator 3，SIRT3）是線粒體中去乙酰化修飾酶，有多種底物參與線粒體的生物過程，在維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)及細(xì)胞存活方面發(fā)揮重要作用[5-6]。

抗纖益心方由升陷湯化裁而來，方由紅參、丹參、澤蘭、益母草、黃芪、茯苓、白術(shù)、升麻、麥冬等組成，具有益氣升陷、活血利水之效。臨床研究[7]表明，在常規(guī)治療基礎(chǔ)上聯(lián)用抗纖益心方可顯著抑制DCM 患者心室重構(gòu)；基礎(chǔ)研究[8-10]發(fā)現(xiàn)抗纖益心方能夠通過調(diào)控線粒體介導(dǎo)的凋亡與自噬明顯改善心功能，逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)。

本研究通過去甲腎上腺素（NE）誘導(dǎo)成年大鼠心肌細(xì)胞肥大模型，探討抗纖益心方對(duì)線粒體質(zhì)量控制相關(guān)因子的調(diào)控作用，明確抗纖益心方的作用機(jī)制，以期為DCM 的臨床治療提供新方向。

1 材料

1.1 動(dòng)物SD 大鼠，雄性，SPF 級(jí)，8 周齡，體質(zhì)量（200±20）g，濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（魯）20190003，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：370726201100417315。動(dòng)物飼養(yǎng)于河南省中醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，使用許可證為：SYXK（豫）2016-0009。本研究通過河南省中醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：PZ-HNSZYY-2019-004。

1.2 藥物及試劑抗纖益心方的配方顆粒由四川新綠藥業(yè)科技發(fā)展有限公司提供，主要由紅參12 g、黃芪30 g、丹參15 g、澤蘭15 g、益母草15 g、茯苓15 g、白術(shù)15 g、升麻9 g、麥冬12 g 組成，批號(hào)分別為：19080058、20100015、20040120、19110126、20040219、20100186、20090042、20060046、20060012，每克顆粒相當(dāng)于生藥8 g。給藥前將顆粒溶解于生理鹽水中，配為溶液備用。輔酶Q10片，購自河南省中醫(yī)院，批號(hào)：H10 930021；異氟烷，深圳瑞沃德生命科技有限公司，批號(hào)：217 171101；去甲腎上腺素、左旋肉堿、層粘連蛋白，美國MedChemExpress 公司，批號(hào)分別為：HY-13715、HY-B0399、HYP0131；Joklik、牛血清白蛋白，美國Sigma 公司，批號(hào)分別為： M8028、 V 900933； M199 培養(yǎng)基、HEPES，美國Gibco 公司，批號(hào)分別為：11150067、11 344041；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、增強(qiáng)型ATP檢測(cè)試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為： P0012、 A025； GAPDH、 SIRT3、PGC-1α、Pink1、Parkin 抗體，美國Proteintech 公司，批號(hào)分別為：60004-1-Ig、10099-1-AP、66369-1-Ig、23274-1-AP、14060-1-AP；Drp1、Mff 抗體，美國Cell signaling 公司，批號(hào)分別為：8570S、84580；ECL 化學(xué)發(fā)光液，北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：PE0010；山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗，美國Proteintech 公司，批號(hào)分別為：15015、15014；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，日本Takara 公司，批號(hào)：RR047A；PCR 引物依據(jù)NCBI 網(wǎng)站提供的引物序列設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，具體見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences of target genes

1.3 儀器ML176-V 型離體心臟灌流系統(tǒng)，美國AD Instrument 公司；3110 型CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo Scientific 公司； IncuCyte S3 型活細(xì)胞成像觀察系統(tǒng)，美國Essen BioScience 公司；OD-2000+型超微量核酸蛋白測(cè)定儀，美國One-drop 公司；7500 FAST 型PCR 儀，賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；185-2148 型基因擴(kuò)增儀、164-5070 型蛋白垂直電泳儀、170-4070 型電轉(zhuǎn)儀、Chemidoc XRS+型化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀，美國Bio-RAD 公司。

2 方法

2.1 隔離成年大鼠心肌細(xì)胞運(yùn)用改良Langendorff灌流法[11]隔離成年大鼠心肌細(xì)胞。給予異氟烷吸入麻醉后，解剖大鼠迅速取出心臟，放入冰的灌流液（Joklik 11.2 g，碳酸氫鈉2 g，硫酸鎂0.144 g，左旋肉堿0.198 g，加入1 000 mL 去離子水中，完全溶解，通氧30 min，調(diào)整pH 值至7.3）中，輕壓排除殘血，將主動(dòng)脈懸掛到Langendorff 灌流裝置，灌入37 ℃灌流液，將心臟內(nèi)瘀血排出；5 min 后，將灌流液換為膠原酶消化液，約30 min 后心臟發(fā)白，即停止消化。剪下心室，將其放入培養(yǎng)皿內(nèi)，滴管吸取心肌細(xì)胞懸液，用0.45 μm 微孔濾膜過濾，濾液收集到50 mL 離心管中，再將濾液離心（室溫，離心半徑15 cm，2 000 r·min-1，20 s），棄上清，使用不同濃度的含鈣培養(yǎng)基梯度復(fù)鈣。從培養(yǎng)箱中取出提前加入配制好的M199 培養(yǎng)基（0.5 g HEPES，0.05 g 左旋肉堿，1 g BSA，100 mL M199，1 mL 青鏈霉素）的培養(yǎng)皿，每個(gè)皿中加入300 μL 心肌細(xì)胞懸液，孵3 h 后更換培養(yǎng)基，即可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 抗纖益心方含藥血清制備60 只雄性SD 大鼠隨機(jī)分為3 組：空白組、抗纖益心方組、輔酶Q10組。抗纖益心方組、輔酶Q10組分別給予相應(yīng)的藥物灌胃處理，空白組給予等量生理鹽水灌胃。課題組前期研究[11]發(fā)現(xiàn)，抗纖益心方高劑量（3.6 g·kg-1）灌胃有較好療效，故本實(shí)驗(yàn)選用此劑量。輔酶Q10給藥劑量由以下公式計(jì)算： Dm=Dh/W·F，其中Dm 為當(dāng)前小鼠抗纖益心方的給藥劑量，Dh 為抗纖益心方的臨床劑量，W 為人體質(zhì)量，F(xiàn) 為小鼠與人的劑量轉(zhuǎn)換因子，W 設(shè)置為70 kg，小鼠與人轉(zhuǎn)換系數(shù)為6.3。故輔酶Q10灌胃量為（2.67 mg·kg-1）。大鼠連續(xù)灌胃7 d，每天1 次，在末次灌胃后2 h 內(nèi)經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，室溫靜置2 h，離心半徑13.5 cm，3 000 r·min-1，離心15 min，取上清即為含藥血清。于56 ℃水浴30 min滅活，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌后，分裝保存。

2.3 細(xì)胞分組、給藥及模型復(fù)制原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)于M199 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育，待細(xì)胞生長至80% 融合時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞分為正常組、模型組（NE）、中藥組（NE+抗纖益心方）、西藥組（NE+輔酶Q10）。在進(jìn)行NE 造模前1 h，棄培養(yǎng)基，將中藥組和西藥組換成含有10% 相應(yīng)含藥血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，其余組用含10% 正常血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育。1 h 后，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道方案[12]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選定0.5 μmol·L-1的NE 再處理24 h，誘導(dǎo)成年大鼠心肌細(xì)胞肥大模型。

2.4 心肌細(xì)胞表面積測(cè)定心肌細(xì)胞按照“2.3”項(xiàng)下分組、干預(yù)后于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，于顯微鏡下觀察并且拍照，用ImageJ 圖像專業(yè)分析軟件，測(cè)量單個(gè)活細(xì)胞的面積。每組取5 個(gè)視野，每個(gè)視野按20 個(gè)細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.5 Real-time PCR 法測(cè)定BNP 及線粒體質(zhì)量控制相關(guān)指標(biāo)mRNA 的表達(dá)水平心肌細(xì)胞按照“2.3”項(xiàng)下分組、干預(yù)后，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用PBS清洗2 遍。加入Buffer Rlysis-AG 裂解，按照生工RNA 抽提純化試劑盒說明書提取總RNA，根據(jù)Takara 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件設(shè)定為：37 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃冷卻后取出cDNA 模板?；赾DNA 模板，采用TB GreenTM Premix EX Ta q TM Ⅱ試劑盒配制熒光定量PCR 反應(yīng)液。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s 后進(jìn)行PCR 循環(huán)，95 ℃變性5 s，60 ℃退火31 s，共40 個(gè)循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參校正，采用2-△△Ct相對(duì)定量法計(jì)算各組基因表達(dá)情況并進(jìn)行結(jié)果分析。

2.6 熒光素酶檢測(cè)細(xì)胞ATP 水平大鼠心肌細(xì)胞按照“2.3”項(xiàng)下分組、干預(yù)后，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，PBS 洗2 遍，每孔中加入400 μL 裂解液，收集裂解細(xì)胞于1.5 mL EP 管中，4 ℃12 000 r·min-1離心5 min（離心半徑5 cm），取上清。冰上融解待用試劑，將ATP 標(biāo)準(zhǔn)溶液用裂解液稀釋成不同的濃度梯度。按照說明書配制ATP 工作液，每孔加100 μL ATP 檢測(cè)工作液，室溫靜置5 min，以清除本底性的ATP，減少誤差。在待檢測(cè)孔中加入20 μL 待測(cè)樣品溶液，迅速混勻后化學(xué)發(fā)光儀測(cè)定ATP 含量。

2.7 Western Blot 法檢測(cè)線粒體質(zhì)量控制相關(guān)蛋白表達(dá)水平大鼠心肌細(xì)胞干預(yù)后使用裂解液（RIPA∶PMSF 為100∶1）提取蛋白，4 ℃，12 000 r·min-1離心5 min（離心半徑5 cm）后取上清，BCA 法檢測(cè)蛋白濃度；取相同蛋白量制備上樣樣本進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜（濕轉(zhuǎn)）2 h，5% 脫脂奶粉封閉1 h；置于相應(yīng)一抗（1∶1 000）中4 ℃孵育過夜，次日TBST 洗膜5 次，每次5 min；室溫孵育二抗（1∶4 000）1 h，TBST 洗膜5 次（每次5 min）后置于ECL 化學(xué)發(fā)光液中，利用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)。以GAPDH 為內(nèi)參蛋白，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參的比值作為蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用GraphPad Prism 6.0 軟件進(jìn)行作圖。數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。采用單因素方差分析，兩兩比較采用TurKey 法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 NE 誘導(dǎo)成年大鼠心肌細(xì)胞肥大模型的建立見圖1、表2。通過顯微鏡下觀察可見多數(shù)貼壁生長的心肌細(xì)胞呈梭形，部分心肌細(xì)胞可觀察到自發(fā)性收縮。成年大鼠心肌細(xì)胞經(jīng)過NE 處理后，細(xì)胞表面積有所增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Real-Time PCR 檢測(cè)顯示，經(jīng)NE 處理后，心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志基因BNP mRNA 變化明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。以上表明模型復(fù)制成功。

圖1 去甲腎上腺素（NE）誘導(dǎo)的成年大鼠心肌細(xì)胞肥大（×100）Figure 1 Norepinephrine（NE）-induced cardiomyocytes hypertrophy of adult rats（×100）

表2 去甲腎上腺素（NE）誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞表面積及BNP mRNA 水平變化（±s，n=6）Table 2 Surface area and mRNA level of BNP in NE induced hypertrophic cardiomyocytes（±s，n=6）

表2 去甲腎上腺素（NE）誘導(dǎo)的肥大心肌細(xì)胞表面積及BNP mRNA 水平變化（±s，n=6）Table 2 Surface area and mRNA level of BNP in NE induced hypertrophic cardiomyocytes（±s，n=6）

注：與正常組比較，*P＜0.05

BNP mRNA 1.00 ± 0.00 2.15 ± 0.09*正常組模型組表面積/μm2 1.00 ± 0.00 1.41 ± 0.13*

3.2 抗纖益心方對(duì)成年大鼠心肌細(xì)胞肥大模型的影響見圖2、表3。與正常組比較，模型組心肌細(xì)胞表面積增加，BNP mRNA 表達(dá)增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組大鼠心肌細(xì)胞表面積減小，BNP mRNA 表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；西藥組較模型組大鼠心肌細(xì)胞表面積有所減少，BNP mRNA 表達(dá)有所下降，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 抗纖益心方對(duì)大鼠心肌細(xì)胞表面積變化的影響（×400）Figure 2 Effect of Kangxian Yixin Decoction on surface area in rat cardiac myocytes（×400）

表3 抗纖益心方對(duì)大鼠心肌細(xì)胞表面積及BNP mRNA、ATP 含量的影響（±s，n=6）Table 3 Effect of Kangxian Yixin Decoction on surface area，mRNA level and ATP level of BNP in rat cardiac myocytes（±s，n=6）

表3 抗纖益心方對(duì)大鼠心肌細(xì)胞表面積及BNP mRNA、ATP 含量的影響（±s，n=6）Table 3 Effect of Kangxian Yixin Decoction on surface area，mRNA level and ATP level of BNP in rat cardiac myocytes（±s，n=6）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

ATP/（nmol·mg-1）1.00 ± 0.00 0.51 ± 0.11*0.74 ± 0.09*0.70 ± 0.11#正常組模型組中藥組西藥組表面積/μm2 1.00 ± 0.00 1.49 ± 0.11*1.27 ± 0.14#1.38 ± 0.17 BMP mRNA 1.00 ± 0.00 2.29 ± 0.18*1.61 ± 0.21#1.97 ± 0.23

3.3 抗纖益心方對(duì)成年大鼠心肌細(xì)胞肥大模型的ATP 水平的影響見表3。與正常組比較，模型組ATP 含量有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與模型組比較，中藥組與西藥組大鼠心肌細(xì)胞ATP含量有所增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中藥組與西藥組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3.4 抗纖益心方對(duì)心肌細(xì)胞肥大模型線粒體質(zhì)量控制相關(guān)蛋白的影響見圖3、表4。與正常組比較，模型組SIRT3、PGC-1α、Mff、Pink1、Parkin 蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Drp1 蛋白表達(dá)有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，中藥組大鼠心肌細(xì)胞中SIRT3、PGC-1α、Mff、Pink1、Parkin 蛋白表達(dá)有所升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Drp1 蛋白表達(dá)無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。西藥組與模型組比較，SIRT3、Mff、Parkin 蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PGC-1α、Drp1、Pink1 蛋白表達(dá)相對(duì)有所增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 各組心肌細(xì)胞線粒體質(zhì)量控制相關(guān)蛋白條帶Figure 3Electrophoresis of mitochondrial quality controlrelated proteins in cardiomyocytes

表4 抗纖益心方對(duì)心肌細(xì)胞線粒體質(zhì)量控制相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，n=6）Table 4 Effect of Kangxian Yixin Decoction on the protein expression of mitochondrial quality control-related proteins in cardiomyocytes（±s，n=6）

表4 抗纖益心方對(duì)心肌細(xì)胞線粒體質(zhì)量控制相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，n=6）Table 4 Effect of Kangxian Yixin Decoction on the protein expression of mitochondrial quality control-related proteins in cardiomyocytes（±s，n=6）

注：與正常組比較，*P＜0.05，與模型組比較，#P＜0.05

Parkin 1.00 ± 0.00 0.53 ± 0.02*1.02 ± 0.22#1.19 ± 0.21#組別正常組模型組中藥組西藥組SIRT3 1.00 ± 0.00 0.57 ± 0.06*0.79 ± 0.03#0.73 ± 0.11#PGC-1α 1.00 ± 0.00 0.41 ± 0.03*0.57 ± 0.09#0.45 ± 0.05 Mff 1.00 ± 0.00 0.43 ± 0.08*0.69 ± 0.12#0.70 ± 0.13#Drp1 1.00 ± 0.00 0.70 ± 0.09 0.96 ± 0.25 1.00 ± 0.06 Pink1 1.00 ± 0.00 0.59 ± 0.05*0.84 ± 0.17#0.75 ± 0.12

3.5 抗纖益心方對(duì)心肌細(xì)胞肥大模型線粒體質(zhì)量控制相關(guān)指標(biāo)mRNA 的影響見表5。與正常組比較，模型組SIRT3、PGC-1α、Mff、Pink1、Parkin 的mRNA 表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Drp1 mRNA 表達(dá)有所降低，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，中藥組大鼠心肌細(xì)胞中SIRT3、PGC-1α、Mff、Pink1、Parkin mRNA 表達(dá)有所升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）； Drp1 mRNA表達(dá)有所升高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。西藥組與模型組比較，SIRT3、Mff、Parkin mRNA 表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），PGC-1α、Drp1、Pink1 mRNA 表達(dá)無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表5 抗纖益心方對(duì)心肌細(xì)胞線粒體質(zhì)量控制相關(guān)指標(biāo)mRNA 水平的影響（±s，n=6）Table 5 Effect of Kangxian Yixin Decoction on the mRNA expression of mitochondrial quality control-related proteins in cardiomyocytes（±s，n=6）

表5 抗纖益心方對(duì)心肌細(xì)胞線粒體質(zhì)量控制相關(guān)指標(biāo)mRNA 水平的影響（±s，n=6）Table 5 Effect of Kangxian Yixin Decoction on the mRNA expression of mitochondrial quality control-related proteins in cardiomyocytes（±s，n=6）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

Parkin 1.00 ± 0.00 0.48 ± 0.04*0.67 ± 0.13#0.69 ± 0.15#組別正常組模型組中藥組西藥組SIRT3 1.00 ± 0.00 0.49 ± 0.09*0.73 ± 0.06#0.85 ± 0.12#PGC-1α 1.00 ± 0.00 0.52 ± 0.11*0.68 ± 0.10#0.62 ± 0.05 Mff 1.00 ± 0.00 0.58 ± 0.14*0.83 ± 0.17#0.60 ± 0.08#Drp1 1.00 ± 0.00 0.78 ± 0.20 0.88 ± 0.21 0.70 ± 0.18 Pink1 1.00 ± 0.00 0.47 ± 0.15*0.79 ± 0.16#0.59 ± 0.07

4 討論

擴(kuò)張型心肌?。―CM）可歸屬于中醫(yī)“心脹”“心悸”“心水”等范疇，屬本虛標(biāo)實(shí)證，以正氣虛為核心病機(jī)，血瘀、水濕、痰濁等為主要病理現(xiàn)象[13]。河南省中醫(yī)院王振濤教授總結(jié)多年臨床經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為宗氣下陷為本病核心病機(jī)，以升陽舉陷為根本大法，兼以益氣活血自擬治療DCM 的專方——抗纖益心方。該方以黃芪、紅參為君藥，大補(bǔ)元?dú)猓剐姆沃畾獬渑?，宗氣充足，氣旺則血行；丹參、茯苓、益母草、澤蘭等共為臣藥，活血化瘀，兼以利水；白術(shù)運(yùn)脾強(qiáng)胃，使氣血化生有源，并助黃芪、紅參補(bǔ)氣；升麻升陽舉陷，助黃芪升舉宗氣；麥冬清心安神，并有佐制方中藥物溫燥作用。諸藥合用，共奏益氣升陷、活血利水之功。前期臨床研究[14-15]表明，抗纖益心方可改善患者心功能，抑制心室重構(gòu)；基礎(chǔ)研究[16]通過蛋白組學(xué)鑒定，發(fā)現(xiàn)抗纖益心方對(duì)DCM 的治療作用與線粒體質(zhì)量密切相關(guān)。此外，現(xiàn)代藥理學(xué)研究[17-19]證實(shí)抗纖益心方中所含有的黃芪、紅參、丹參等藥物及其有效成分可以通過多途徑、多靶點(diǎn)調(diào)控線粒體質(zhì)量控制，發(fā)揮心肌保護(hù)作用，改善心功能。

線粒體質(zhì)量控制是維持心肌細(xì)胞線粒體穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制。研究[20]發(fā)現(xiàn)，缺氧會(huì)引起心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)的改變及線粒體分裂、融合相關(guān)蛋白功能的失常，導(dǎo)致線粒體功能障礙、ATP 供應(yīng)減少和細(xì)胞死亡途徑的激活。特異性敲除線粒體自噬相關(guān)基因Parkin 會(huì)導(dǎo)致異常線粒體過度累積、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡的發(fā)生，最終導(dǎo)致左心室功能障礙[21]；在應(yīng)激狀態(tài)下，線粒體自噬適當(dāng)清除受損線粒體可以保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響維持心臟正常生理功能[22]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ 輔助因子1α（peroxisome proliferators activated receptor-γ coactivator-1α，PGC-1α）是線粒體生物合成的關(guān)鍵因子，PGC-1α 基因缺失導(dǎo)致小鼠心肌氧化應(yīng)激標(biāo)志物增加，左心室擴(kuò)大，導(dǎo)致心臟收縮功能障礙；而過表達(dá)PGC-1α 能夠減少ATP 缺失及線粒體膜電位耗散，從而減輕心臟肥大和重塑[23-24]。

SIRT3 具有很強(qiáng)的NAD 依賴性脫乙酰基酶活性，在病理過程中通過修飾多種線粒體相關(guān)蛋白的活性來調(diào)節(jié)線粒體功能[25-26]。SIRT3 能夠通過調(diào)控線粒體自噬從而改善阿霉素對(duì)心肌細(xì)胞的損傷，而針對(duì)線粒體生物合成的影響，則有文獻(xiàn)支持其通過對(duì)PGC-1α 的調(diào)控作用發(fā)揮對(duì)心肌肥大的保護(hù)作用[27-28]。同時(shí)有研究[29-30]表明SIRT3 缺失介導(dǎo)的線粒體紊亂參與了DCM 的發(fā)生、發(fā)展。通過比較健康老年人和患有心血管疾病的老年人的樣本發(fā)現(xiàn)，患有心血管疾病的患者血清中SIRT3 表達(dá)明顯降低；隨著SIRT3 基因敲除小鼠年齡的增長，會(huì)使心臟加速衰老，出現(xiàn)明顯的心肌肥大和纖維化表現(xiàn)，最終發(fā)展為心力衰竭，過表達(dá)SIRT3 能夠明顯降低心肌纖維化損傷[31-33]。

本研究發(fā)現(xiàn)，抗纖益心方能明顯降低離體成年大鼠心肌細(xì)胞肥大模型中BNP mRNA 的表達(dá)水平，明顯恢復(fù)線粒體分裂水平，加快受損線粒體的清除，提高線粒體生物合成水平；還能夠上調(diào)成年大鼠心肌細(xì)胞肥大模型中SIRT3 mRNA 及蛋白表達(dá)水平，提示抗纖益心方可能通過調(diào)控線粒體質(zhì)量控制改善心肌細(xì)胞肥大，其機(jī)制可能與SIRT3 密切相關(guān)。SIRT3 是否為抗纖益心方調(diào)控線粒體質(zhì)量控制的重要靶點(diǎn)，將是我們下一步研究的重點(diǎn)。