抗纖軟肝顆粒調(diào)控Hedgehog通路核轉(zhuǎn)錄因子Gli1抑制肝星狀細(xì)胞活化的研究*

黃大偉 陸定波Δ 高 翔 鄧郭琳

1.湖北省中醫(yī)院肝病科 (湖北 武漢， 430074) 2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)2013級(jí)研究生班

·基礎(chǔ)理論研究·

抗纖軟肝顆粒調(diào)控Hedgehog通路核轉(zhuǎn)錄因子Gli1抑制肝星狀細(xì)胞活化的研究*

黃大偉1陸定波1Δ高 翔1鄧郭琳2

1.湖北省中醫(yī)院肝病科 (湖北 武漢， 430074) 2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)2013級(jí)研究生班

目的：探討抗纖軟肝顆粒調(diào)控Hedgehog(Hh)信號(hào)通路抑制HSC活化的作用機(jī)制。方法引進(jìn)人肝星狀細(xì)胞系HSC-LX2，常規(guī)培養(yǎng)及傳代，設(shè)立空白對(duì)照組、模型組和抗纖軟肝顆粒中、低劑量組。藥物作用24h后收集細(xì)胞，測(cè)定各組Hh信號(hào)通路相關(guān)信號(hào)分子Gli1、Shh、Ptc、Smo的表達(dá)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)及PDGF-B的水平。結(jié)果模型組HSC細(xì)胞Hh信號(hào)通路相關(guān)信號(hào)分子Shh、Ptc、Smo、Gli1 mRNA表達(dá)均增高，與空白對(duì)照組比較，差異具有顯著性意義(P<0.05)；抗纖軟肝顆粒中、低劑量組Shh、Ptc、Smo、Gli1 mRNA表達(dá)較模型組減少，差異具有顯著性意義(P<0.05)，各劑量組之間比較，差異無(wú)顯著性意義。HSC誘導(dǎo)活化后，模型組TGF-β1及PDGF-B合成增加，與空白對(duì)照組比較差異具有顯著性意義(P<0.05)；抗纖軟肝顆粒中、低劑量組TGF-β1及PDGF-B合成較模型組下降，差異具有顯著性意義(P<0.05)，各劑量組之間比較，差異無(wú)顯著性意義。結(jié)論抗纖軟肝顆粒能夠下調(diào)Hh信號(hào)通路核轉(zhuǎn)錄因子Gli1及相關(guān)信號(hào)分子Shh、Ptc、Smo的表達(dá)，從而抑制HSC活化，減少TGF-β1、PDGF-B的合成。

肝纖維化；抗纖軟肝顆粒；Hedgehog通路；Gli1

AbstractObjective:To study the mechanism of anti-hepatic fibrosis through Kangxian Ruangan granule regulating the Hedgehog (Hh) signaling pathway which activated Hepatic Stellate Cells (HSC) and inhibiting the activation of HSC.Methods:To introduce Human Hepatic Stellate Cell line HSC-LX2,culture and passage them in conventional methods. The expertment was divided into blank control group, model group and Kangxian Ruangan granule medium, low does group. Conventional cultured cells as the blank control group.For 24 hours. Followed, the cells were collected.The expression of Hh signaling pathway’s related signal molecules such as Gli1, Shh, Ptc and Smo and the effect of Kangxian Ruangan granule on HSC activation and synthesis of transforming growth factor-beta 1 (TGF-1) and PDGF-B were analyzed.Results:Compared with the blank control group,the expression of Hh signaling pathway’s related signal molecules include Shh, Ptc, Smo, Gli1 mRNA were increased in HSC cells of the model group, the difference was significant (P<0.05);The expression of Shh, Ptc, Smo, Gli1 mRNA in Kangxian Ruangan granule medium, low does group were lower than that in the model group (P<0.05), and there was no significant difference among different does groups; Compared with the blank control group, the synthesis of TGF-β1 and PDGF-B increased after HSCs activated by PDGF-BB in the model group (P<0.05). Compared with the model group, the synthesis of TGF-β1 and PDGF-B decreased in Kangxian Ruangan granule medium, low does group (P<0.05).Conclusion:Kangxian Ruangan granule could regulate the expression of nuclear transcription factor Gli1 and its related signal molecules include Shh, Ptc and Smo of Hedgehog (Hh) signal pathway, and then inhibit the activation of HSCs and reduce the synthetise of TGF-β1and PDGF-B.

KeyWordsHepatic Fibrosis; Kangxian Ruangan granule; Hedgehog Pathway; Gli1.

抗纖軟肝顆粒是我院肝病研究所的院內(nèi)制劑，由名中醫(yī)肝病專(zhuān)家張赤志教授創(chuàng)立。前期研究顯示抗纖軟肝顆粒能通過(guò)細(xì)胞因子途徑、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制肝呈狀細(xì)胞(HSC)活化、促進(jìn)HSC凋亡，進(jìn)而抑制細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的過(guò)度沉積，發(fā)揮抗肝纖維化作用。它能干擾血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)在HSC的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，阻斷PDGF的生物學(xué)效應(yīng)[1]，故推測(cè)抗纖軟肝顆粒是Glil小分子抑制劑。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，探討抗纖軟肝顆粒對(duì)HSC中Hh信號(hào)通路核轉(zhuǎn)錄因子Gli1的調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1 研究材料

1.1.1 細(xì)胞系 肝星狀細(xì)胞系HSC-LX2由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院劉成海教授惠贈(zèng)，表現(xiàn)為靜止的HSC。

1.1.2 藥物 抗纖軟肝顆粒為湖北省中醫(yī)院院內(nèi)制劑(批準(zhǔn)文號(hào)：鄂藥制字Z20113145)，由湖北省中醫(yī)院制劑中心制備。臨用時(shí)，以含10% 胎牛血清(美國(guó)GIBCO公司)的DMEM(高糖)培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司)充分溶解，分別制備濃度為5mg/ml、1.25mg/ml的藥物溶液，采用孔徑為0.22μm的微孔濾膜針頭濾器抽濾除菌后4℃保存，1周內(nèi)用完。

1.2 研究方法

1.2.1 HSC細(xì)胞傳代培養(yǎng) 將人HSC-LX2細(xì)胞系接種至含10% 胎牛血清的DMEM(高糖)完全培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，12h后首次更換培養(yǎng)基，以后每3天更換培養(yǎng)基一次，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)瓶底約90% 時(shí)以0.125% 胰蛋白酶-EDTA溶液消化、傳代。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及樣品處理 培養(yǎng)的HSC-LX2細(xì)胞分為空白對(duì)照組、模型組和抗纖軟肝顆粒中、低劑量組?？瞻讓?duì)照組為正常培養(yǎng)的HSC-LX2細(xì)胞，未做特殊處理，是靜息狀態(tài)的HSC細(xì)胞。模型組和抗纖軟肝顆粒中、低劑量組細(xì)胞均分別給予10ng/ml PDGF-BB處理24h以誘導(dǎo)靜息狀態(tài)的HSC細(xì)胞活化，抗纖軟肝顆粒中、低劑量組在PDGF誘導(dǎo)24h后再分別給予濃度5mg/ml、1.25mg/ml的抗纖軟肝顆粒藥物溶液處理24h。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法分析HSC細(xì)胞Hh信號(hào)通路相關(guān)信號(hào)分子和TGF-β1、PDGF-B mRNA的表達(dá)情況 各組細(xì)胞樣品分別處理后，吸棄培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基，加入適量4℃預(yù)冷的TRIzol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)，輕柔吹打數(shù)次以使貼壁細(xì)胞脫落，將含有細(xì)胞的TRIzol試劑轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管，酚-氯仿法提取總RNA，采用RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR法(KAPA SYBR FAST qPCR試劑盒，美國(guó)Kapa Biosystems公司)測(cè)定各組細(xì)胞中Hh信號(hào)通路核轉(zhuǎn)錄因子Gli1及其他相關(guān)信號(hào)分子Shh、Ptc、Smo 以及HSC合成TGF-β1、PDGF-B mRNA的表達(dá)。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，序列見(jiàn)表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有計(jì)量數(shù)據(jù)錄入Excel表格，采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PDGF-BB誘導(dǎo)HSC活化 HSC細(xì)胞經(jīng)PDGF-BB誘導(dǎo)后活化并增殖。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定各組細(xì)胞合成TGF-β1、PDGF-B mRNA的表達(dá)量，以及各組細(xì)胞Hh信號(hào)通路關(guān)鍵因子Gli1、Shh、Ptc、Smo的表達(dá)量。以空白對(duì)照組細(xì)胞為對(duì)照，將該組TGF-β1、PDGF-B、Gli1、Shh、Ptc、Smo mRNA表達(dá)量視為1，采用相對(duì)定量2-ΔΔCt進(jìn)行比較。HSC誘導(dǎo)活化后，模型組TGF-β1 mRNA相對(duì)空白對(duì)照組的表達(dá)倍數(shù)為3.55±0.20，顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)；模型組PDGF-B mRNA相對(duì)空白對(duì)照組的表達(dá)倍數(shù)為3.81±0.09，顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)；模型組細(xì)胞Hh信號(hào)通路關(guān)鍵因子Gli1、Shh、Ptc、Smo mRNA相對(duì)空白對(duì)照組的表達(dá)倍數(shù)分別為2.33±0.05、1.37±0.07、2.03±0.18、2.15±0.21，顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)。

2.2 抗纖軟肝顆粒對(duì)HSC合成TGF-β1、PDGF-B的影響 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定抗纖軟肝顆粒中、低劑量組及模型組細(xì)胞合成TGF-β1、PDGF-B mRNA的表達(dá)量，以模型組細(xì)胞為對(duì)照，將該組TGF-β1、PDGF-B mRNA表達(dá)量視為1，采用相對(duì)定量2-ΔΔCt進(jìn)行比較?？估w軟肝顆粒中、低劑量組TGF-β1 mRNA相對(duì)模型組的表達(dá)倍數(shù)分別為0.31±0.02、0.35±0.01，與模型組相比差異具有顯著性意義(P<0.05)，各劑量組之間比較差異無(wú)顯著性意義；抗纖軟肝顆粒中、低劑量組PDGF-B mRNA相對(duì)模型組的表達(dá)倍數(shù)分別為0.19±0.01、0.36±0.02，與模型組相比差異具有顯著性意義(P<0.05)，各劑量組之間比較差異無(wú)顯著性意義(見(jiàn)表2、圖1)。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

圖1 抗纖軟顆粒中劑量組(n=3)、低劑量組(n=3)細(xì)胞中TGF-β1、PDFG-B mRNA表達(dá)圖

組別TGF-β1PDGF-B抗纖軟肝顆粒中劑量組0.31±0.02*0.35±0.01*抗纖軟肝顆粒低劑量組0.19±0.01*0.36±0.02*

注：模型組各項(xiàng)指標(biāo)表達(dá)量視為1。(見(jiàn)2.2中內(nèi)容)下表同。與模型組比較，*P<0.05

2.3 抗纖軟肝顆粒對(duì)HSC細(xì)胞Hh信號(hào)通路關(guān)鍵信號(hào)分子表達(dá)的影響 以模型組細(xì)胞Hh信號(hào)通路相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)量為對(duì)照，將該組Gli1、Shh、Ptc、Smo mRNA表達(dá)量視為1，采用相對(duì)定量2-ΔΔCt進(jìn)行比較。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，抗纖軟肝顆粒中、低劑量組Gli1 mRNA相對(duì)模型組的表達(dá)倍數(shù)分別為0.45±0.01、0.65±0.03，與模型組相比差異具有顯著性意義(P<0.05)，各劑量組之間比較，差異無(wú)顯著性意義；抗纖軟肝顆粒中、低劑量組Shh mRNA相對(duì)模型組的表達(dá)倍數(shù)分別為1.12±0.03、1.09±0.10，與模型組相比，差異具有顯著性意義(P<0.05)，各劑量組之間比較，差異無(wú)顯著性意義；抗纖軟肝顆粒中、低劑量組Ptc mRNA相對(duì)模型組的表達(dá)倍數(shù)分別為0.40±0.02、0.39±0.07，與模型組相比，差異具有顯著性意義(P<0.05)，各劑量組之間比較，差異無(wú)顯著性意義；抗纖軟肝顆粒中、低劑量組Smo mRNA相對(duì)模型組的表達(dá)倍數(shù)分別為0.44±0.09、0.42±0.05，與模型組相比，差異具有顯著性意義(P<0.05)，各劑量組之間比較，差異無(wú)顯著性意義(見(jiàn)表3、圖2)。

表3 抗纖軟肝顆粒中、低劑量組Hh信號(hào)通路相關(guān)信號(hào)分子mRNA相對(duì)模型組表達(dá)量比較(2-ΔΔCt，mean±SD，n=3)

與模型組比較，*P<0.05

圖2 抗纖軟肝顆粒中劑量組(n=3)、低劑量組(n=3)細(xì)胞中Hh信號(hào)通路Glil、Shh、Ptc、Smo mRNA表達(dá)圖

3 討論

肝星狀細(xì)胞(HSC)的異?；罨歉卫w維化進(jìn)展的核心環(huán)節(jié)，表現(xiàn)為表達(dá)α-SMA，產(chǎn)生TGF、PDGF、ANGⅡ等，最終形成纖維瘢痕。近年學(xué)者認(rèn)識(shí)到經(jīng)典的Hh信號(hào)通路與肝星狀細(xì)胞的活化有關(guān)。實(shí)驗(yàn)研究表明：多種活化的HSC均表達(dá)Hh配體和Hh通路Shh、Patch、 Smo和Gli等多重組分[2]。

抗纖軟肝顆粒是張赤志教授在我院已故名老中醫(yī)呂繼端教授臨床經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)之上創(chuàng)立，張教授認(rèn)為肝纖維化是肝硬化“證未顯現(xiàn)”階段，“肝絡(luò)瘀阻、痰瘀互結(jié)”是這一階段的總病機(jī)，從而確立以“痰瘀阻絡(luò)”為核心的辨證治療體系?？估w軟肝顆粒具有“化痰軟堅(jiān)、活血化瘀”之功效，現(xiàn)為我院自制中成藥制劑，在我院肝炎肝硬化中醫(yī)診療方案中作為代償性肝硬化治療常規(guī)用藥。該藥由海藻、鱉甲、牡蠣、莪術(shù)、丹參、山楂、地骷髏組成，具有“化痰軟堅(jiān)、活血化瘀”之功效。我們采用不同濃度的抗纖軟肝顆粒干預(yù)經(jīng)PDGF誘導(dǎo)活化的HSC，發(fā)現(xiàn)藥物干預(yù)后，HSC中Hh信號(hào)通路核轉(zhuǎn)錄因子Gli1及其他Hh通路相關(guān)組分Shh、Ptc、Smo的相對(duì)表達(dá)量均下降，而各劑量組之間無(wú)明顯差異。這一結(jié)果說(shuō)明抗纖軟肝顆粒對(duì)HSC中Hh信號(hào)通路具有調(diào)控作用，能下調(diào)Hh信號(hào)通路核轉(zhuǎn)錄因子Gli1和Hh信號(hào)通路關(guān)鍵因子Shh、Ptc、Smo的表達(dá)，從而抑制HSC活化，減少TGF-β1、PDGF-B的合成，這可能是其減輕肝纖維化病變程度、延緩病程進(jìn)展的作用機(jī)制之一。

[1] 楊玲, 朱清靜, 笪邦紅, 等.中藥抗纖軟肝顆粒抑制PDGF誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞MEK-1和c-fos表達(dá)[J].世界華人消化雜志，2004，12(2):347-350.

[2] Taipale J, Chen JK, Cooper MK,etal. Effects of oncogenic mutations in smoothened and patched can be reversed cyclopamine [J].Nature，2000，206(6799):10005-1009.

StudyofKangxianRuanganGranuleregulatingHedgehogpathway’snuclearfactorGli1foranti-activationofhepaticstellatecells

HUANGDa-wei1,LUDing-bo1Δ,GAOXiang1,etal.

1.DepartmentofHepatologydiseases,HubeiHospitalofTraditionalChineseMedicine(WuhanHubei,430061)China

2016-09-03 編輯：黃育華)

10.3969/j.issn.1005-0264.2017.01.013

湖北省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)資助項(xiàng)目(No.2012Z-Y01)；Δ通訊作者,Email:ludingbo64@163.com