抗纖丸激活Nrf2信號通路抗小鼠慢性肝損傷的作用和機(jī)制研究*

曹敏，王麗，劉海朝，潘贊紅，劉建衛(wèi)，邊育紅

（1．天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.天津市第二人民醫(yī)院，天津 300192）

肝臟是調(diào)節(jié)代謝穩(wěn)態(tài)的重要器官，可以去除機(jī)體許多有害化學(xué)物質(zhì)和藥物，基于這些重要功能，肝臟也易被這些物質(zhì)損傷[1]。研究表明，抗氧化防御系統(tǒng)紊亂是肝損傷的主要機(jī)制之一[2]?？寡趸瘎┑膽?yīng)用也被認(rèn)為是防治氧化應(yīng)激性肝病的一種合理治療策略[3]。核因子相關(guān)因子2（Nrf2）是細(xì)胞氧化還原的主要調(diào)節(jié)因子，在肝臟、腎臟中表達(dá)較高[4]。經(jīng)證實(shí)，活化后入核的Nrf2與抗氧化和解毒基因啟動子區(qū)域的的抗氧化反應(yīng)元件（AREs）結(jié)合進(jìn)而激活下游血紅素氧合酶1（HO-1）、谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基（Gclc）和醌氧化還原酶 1（NQO1）等Ⅱ相解毒酶或抗氧化基因的表達(dá)[5]。因此，激活Nrf2及其相關(guān)抗氧化酶可能在治療慢性肝損傷中發(fā)揮重要作用。

抗纖丸是天津市第二人民醫(yī)院劉作恩醫(yī)師在多年臨床實(shí)踐中總結(jié)出的經(jīng)驗(yàn)方。該方以“血府逐瘀湯”為底方，加入冬蟲夏草、黃芪等補(bǔ)益藥研制而成，具有扶正祛邪、活血化瘀的功效。臨床上用于治療肝損傷，肝纖維化等慢性肝病，療效顯著，但其具體作用機(jī)制尚未明確。研究表明，抗纖丸組方中當(dāng)歸[6]、川芎[7]和冬蟲夏草[8]等中藥均具有抑制氧化應(yīng)激的作用。當(dāng)歸多糖通過抑制氧化應(yīng)激并減少肝細(xì)胞凋亡緩解對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷[9]。五味子醇提物主要活性成分之一的五味子酸性多糖通過降低丙二醛（MDA）水平，提高超氧化物歧化酶（SOD）活性改善乙醇誘導(dǎo)的氧化損傷[10]。此外，前期的研究表明抗纖丸通過調(diào)節(jié)腸道菌群，抑制腸上皮的通透性，減輕肝臟的炎癥反應(yīng)緩解四氯化碳（CCL4）誘導(dǎo)的慢性肝損傷[11]。為了探討抗纖丸治療慢性肝損傷的潛在機(jī)制，本文通過腹腔注射CCL4建立慢性肝損傷小鼠模型，基于Nrf2信號通路，初步探討抗纖丸對模型小鼠肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 抗纖丸由天津市第二人民醫(yī)院提供；甘草酸二銨腸溶膠囊購自正大天晴藥業(yè)集團(tuán)；四氯化碳（CCL4，純度≥99%）購自天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）檢測試劑盒（貨號：C010-1-1）；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）試劑盒（貨號：C009-1-1）；Masson三色染色液試劑盒（貨號：G1340），DAB 顯色試劑盒（貨號：DA1010）購自北京索萊寶科技有限公司；山羊抗鼠IgG（貨號：bs-0296GBio）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；抗α-SMA抗體（貨號：ab7817）購自Abcam公司，抗-Nrf2抗體（貨號：16396-1-AP），抗-HO-1抗體（貨號：10701-1-AP），抗-NQO1 抗體（貨號：67240-1-lg），抗-Gclc抗體（貨號：12601-1-AP）和抗-β-actin抗體（貨號：20536-1-AP）都購自Proteintech公司；總蛋白定量測試盒（貨號：A045-4-2）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（貨號：A001-1-2）；丙二醛（MDA）測試盒（貨號：A003-1-2）；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測試盒（貨號：A005-1-2）均購自南京建成生物工程研究所；總RNA提取試劑盒（貨號：DP419）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號：KR116）、熒光定量擴(kuò)增試劑盒（貨號：FP205）均購自天根生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及模型復(fù)制

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 雄性BALB/c小鼠40只，6周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購自斯貝福生物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2019-0010。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組，甘草酸二銨組（陽性對照組）、抗纖丸組，每組10只。

1.2.2 動物模型復(fù)制 正常組：腹腔注射橄欖油溶液（2 mL/kg），每周2次，連續(xù)6周；模型組、陽性對照組、抗纖丸組：腹腔注射20%的CCL4橄欖油溶液（2 mL/kg），每周 2 次，連續(xù) 6 周[12]。

1.3 給藥方法 持續(xù)造模6周后，每組隨機(jī)取2只，收集血清和肝組織。檢測血清中轉(zhuǎn)氨酶水平，肝組織中SOD，GSH-Px以及MDA等氧化應(yīng)激的標(biāo)志物。蘇木精-伊紅（HE）染色觀察肝組織的病理變化，確定造模是否成功。造模成功后，將慢性肝損傷模型小鼠隨機(jī)分為模型組，甘草酸二銨組（陽性對照組）、抗纖丸組。正常組和模型組每日灌服生理鹽水10 mL/kg，陽性對照組和抗纖丸組分別灌服甘草酸二銨水溶液60 mg/（kg·d）[13]和抗纖丸水溶液3 g/（kg·d），連續(xù)灌胃4周。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 小鼠的一般情況及肝指數(shù) 造模給藥期間觀察小鼠的毛色及生活狀況、隔日測量小鼠的體質(zhì)量。末次給藥后小鼠禁食12 h，腹腔注射10%的水合氯醛麻醉小鼠，記錄小鼠體質(zhì)量后脫頸處死小鼠。取小鼠的整個肝組織于生理鹽水中清洗后用濾紙吸干水分，稱質(zhì)量，按照如下公式計(jì)算小鼠的肝指數(shù)：肝指數(shù)（%）=肝質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100[13]。

1.4.2 血清AST、ALT水平檢測 各組小鼠目內(nèi)眥取血后，室溫靜置30 min，離心半徑8 cm，轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心5 min，收集血清。根據(jù)說明書檢測血清中（ALT），AST的水平。

1.4.3 肝組織病理學(xué)檢測 取各組小鼠相同部位厚約5 mm的肝組織固定于4%的多聚甲醛溶液中。經(jīng)石蠟包埋，切片（4 μm），H＆E 染色觀察各組小鼠肝組織的病理改變。

1.4.4 肝組織Masson染色 按說明書依次將蠟切片石脫蠟至水、蘇木素染細(xì)胞核、麗春紅染色、磷鉬酸處理、苯胺藍(lán)染色、1%冰醋酸分化后將切片依次放入95%酒精，無水乙醇，二甲苯中脫水透明后稍晾干，用中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡觀察肝組織膠原纖維的變化。

1.4.5 肝組織α-SMA免疫組化染色 石蠟切片脫蠟至水，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，熱修復(fù)抗原后滴加山羊血清封閉液，滴加一抗α-平滑肌動蛋白（α-SMA，1∶300）4℃孵育過夜，PBS清洗，滴加二抗，37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明、中性樹膠封片后光學(xué)顯微鏡觀察。

1.4.6 肝組織中SOD、GSH-Px和MDA含量的檢測準(zhǔn)確稱取各組小鼠的肝組織取100 mg，加入900 μL的生理鹽水于冰上超聲勻漿，制備成10%的肝組織勻漿。離心（3 000×g，4℃，10 min）取上清，按說明書檢測肝組織勻漿蛋白含量、SOD、GSH-Px的活性和MDA的含量。

1.4.7 肝組織Nrf2、HO-1及相關(guān)基因的表達(dá) 取各組小鼠的肝組織，提取肝組織中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用SYBR Green Real-time PCR試劑盒擴(kuò)增，以相對定量法檢測小鼠肝臟組織中Nrf2，HO-1、Gclc和 NQO1的 mRNA 表達(dá)水平，采用GAPDH做內(nèi)參，見表1。運(yùn)用2-ΔΔCT方法計(jì)算對照組和給藥組的mRNA的相對表達(dá)量。

表1 引物序列

1.4.8 肝組織Nrf2、HO-1及相關(guān)蛋白的表達(dá) 取小鼠肝臟組織30 mg加入裂解液500 mL（RIPA∶PMSF=100∶1），勻漿離心后取上清，使用 BCA 蛋白測定試劑盒測定總蛋白濃度。制備8%的SDSPAGE分離膠，取等量蛋白（20 μg）電泳后將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2小時(shí)后，分別加入抗 Nrf2（稀釋比例 1∶1000）、抗 HO-1（稀釋比例 1∶2 000）、抗 Gclc（稀釋比例 1∶6 000）、抗NQO1（稀釋比例 1∶10 000）、抗 β-actin（稀釋比例 1∶2 000）。4℃孵育過夜后加入二抗羊抗兔IgG（稀釋比例1∶10 000），室溫孵育1 h。TBST洗膜后使用ECL試劑，顯影成像。使用image J對條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，GraphPad Prism 7繪制統(tǒng)計(jì)分析圖。所有計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗纖丸對慢性肝損傷模型小鼠治療作用的影響 本研究通過檢測血清AST和ALT的水平，計(jì)算肝指數(shù)以及觀察肝組織的病理改變考察抗纖丸對CCL4誘導(dǎo)的慢性肝損傷模型小鼠的治療作用。與正常組相比，模型組小鼠肝指數(shù)明顯升高（P<0.01）；與模型組相比，陽性對照組與抗纖丸組的肝指數(shù)明顯降低（P<0.01），見表2。與正常組相比，模型組小鼠AST與ALT活性均顯著增加（P<0.01）；與模型組相比，陽性對照組與抗纖丸組血清中轉(zhuǎn)氨酶活性明顯降低（P<0.01），見表2。HE染色結(jié)果顯示，正常組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞呈條索狀分布，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰；與正常組相比，模型組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞廣泛水腫并伴有壞死，而陽性對照組與抗纖丸組能顯著的改善CCL4所致的肝組織病變，見圖1A。Masson染色結(jié)果顯示，模型組膠原沉積明顯增多，而陽性對照組與抗纖丸組膠原沉積的程度均有不同程度的改善，見圖1B，2A。免疫組化的結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組α-SMA的表達(dá)明顯增加；與模型組相比，陽性對照組與抗纖丸組α-SMA的表達(dá)明顯降低，見圖1C，2B。這些結(jié)果說明，抗纖丸能明顯改善CCL4誘導(dǎo)的肝組織損傷，并且通過減少小鼠肝組織中膠原積累，降低α-SMA的表達(dá)明顯抑制了CCl4誘導(dǎo)肝損傷向肝纖維化進(jìn)展的趨勢。

表2 抗纖丸對慢性肝損傷小鼠轉(zhuǎn)氨酶及肝指數(shù)的影響（±s）

表2 抗纖丸對慢性肝損傷小鼠轉(zhuǎn)氨酶及肝指數(shù)的影響（±s）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

組別 例數(shù)正常組 8模型組 8陽性對照組 8抗纖丸組 8 AST（U/L） ALT（U/L） 肝指數(shù)（%）35.66± 4.74 17.64± 3.7 4.55±0.16 113.79±20.67## 99.45±11.33## 6.31±0.43##38.07± 6.32**34.18±11.95** 5.38±0.35**50.47±14.51**37.86± 8.85** 5.43±0.17**

圖1 小鼠肝組織H＆E染色，Masson染色和α-SMA的表達(dá)

2.2 抗纖丸對慢性肝損傷模型小鼠氧化損傷的影響 研究表明，過氧化/抗氧化系統(tǒng)與肝損傷的病理過程密切相關(guān)[14]。因此，本研究通過檢測肝組織中SOD和GSH-Px的活性以及MDA的含量考察抗纖丸對CCL4誘導(dǎo)的慢性肝損傷模型小鼠氧化損傷的影響。與正常組相比，模型組小鼠肝組織中SOD，GSH-Px活性明顯降低（P<0.01），同時(shí)MDA的含量增加（P<0.01）；與模型組相比，給予甘草酸二銨和抗纖丸水溶液灌胃治療后肝組織中SOD，GSH-Px活性增加（P<0.05），MDA的含量也顯著降低（P<0.01），見圖3。這說明，抗纖丸能抑制氧化應(yīng)激緩解CCL4誘導(dǎo)的慢性肝損傷。

圖2 各組小鼠肝組織中Masson染色和α-SMA免疫組化的分析

圖3 抗纖丸對各組小鼠肝組織中SOD，GSH-Px和MDA含量的影響

2.3 抗纖丸對慢性肝損傷模型小鼠肝組織中Nrf2相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的影響 Nrf2相關(guān)通路被認(rèn)為是細(xì)胞抗氧化應(yīng)激最重要的機(jī)制[15]。為了驗(yàn)證抗纖丸是否通過激活Nrf2信號通路保護(hù)肝細(xì)胞氧化損傷，檢測了肝組織中Nrf2通路相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)水平。與正常組相比，慢性肝損傷模型組小鼠肝組織中Nrf2，HO-1，NQO1和Gclc的mRNA表達(dá)水平均顯著下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組相比，陽性藥對照組小鼠肝組織中Nrf2，HO-1，NQO1和Gclc和抗纖丸組小鼠肝組織中Nrf2，HO-1，NQO1和Gclc的mRNA表達(dá)水平均顯著上調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），見圖4。此外，WB的結(jié)果顯示與正常組相比，慢性肝損傷模型組小鼠肝組織中Nrf2，NQO1和Gclc的蛋白表達(dá)水平均顯著下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組相比，陽性藥對照組小鼠肝組織中Gclc和抗纖丸組小鼠肝組織中Nrf2，NQO1和Gclc的蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)（P＜0.05 或 P＜0.01），見圖5。這些結(jié)果說明抗纖丸能激活Nrf2及下游相關(guān)抗氧化酶，從而緩解CCL4誘導(dǎo)的慢性肝損傷模型小鼠肝細(xì)胞氧化應(yīng)激水平。

圖4 抗纖丸對各組小鼠Nrf2通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

圖5 抗纖丸對各組小鼠Nrf2通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論與結(jié)論

CCL4被廣泛用于制備小鼠肝損傷模型。研究表明，CCL4可通過細(xì)胞色素P450酶代謝產(chǎn)生三氯甲烷自由基（·CCl3）或三氯甲烷過氧化物（·OOCCl3）自由基，誘導(dǎo)肝細(xì)胞氧化損傷[16]。本實(shí)驗(yàn)采用CCL4腹腔注射6周后，檢測血清中AST，和ALT的水平均顯著增高；此外，病理切片顯示肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞水腫且伴有壞死。這與前期報(bào)道的結(jié)果一致，說明模型復(fù)制成功[17]。

ALT、AST被認(rèn)為是肝組織損傷的敏感指標(biāo)[2]，研究結(jié)果表明，抗纖丸能顯著降低CCL4誘導(dǎo)的慢性肝損傷模型小鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶活性的升高。此外，HE染色結(jié)果也顯示抗纖丸能顯著抑制肝細(xì)胞損傷。研究表明，在慢性肝損傷過程中，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的合成與降解的平衡被破壞，導(dǎo)致肝ECM產(chǎn)生過多[18]。膠原是ECM的主要成分，正如Masson染色的結(jié)果顯示抗纖丸能顯著減少慢性肝損傷小鼠肝組織的膠原沉積。α-SMA是肌成纖維細(xì)胞活化的標(biāo)志，在纖維形成過程中起關(guān)鍵作用[19]。免疫組化的結(jié)果顯示，抗纖丸能顯著減少α-SMA的表達(dá)，這說明抗纖丸能延緩慢性肝損傷進(jìn)一步向肝纖維化進(jìn)展。

研究表明，氧化應(yīng)激在肝損傷的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，可間接反映自由基對肝臟的損傷程度。相反，SOD和GSH-Px可保護(hù)肝細(xì)胞免受氧化劑的傷害，清除脂質(zhì)過氧化物和氧自由基[20]。與預(yù)期的結(jié)果一致，抗纖丸組能明顯逆轉(zhuǎn)SOD，GSH-Px和MDA等氧化損傷相關(guān)參數(shù)的變化。Nrf2作為細(xì)胞氧化還原的主要調(diào)節(jié)因子，在抑制氧化應(yīng)激緩解肝損傷的中起關(guān)鍵作用[21]。經(jīng)證實(shí)，肝臟中特異性敲除Nrf2的基因小鼠比野生型小鼠更易誘發(fā)氧化應(yīng)激導(dǎo)致肝損傷[22]，而使用Nrf2激活劑可以緩解氧化損傷引發(fā)的疾病[23]。在生理?xiàng)l件下，Nrf2與Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1（Keap1）結(jié)合位于細(xì)胞質(zhì)中，而在氧化或親電應(yīng)激時(shí)，Nrf2與Keap1解離并轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核與sMaf蛋白等形成二聚體與抗氧化和解毒基因啟動子區(qū)域的AREs結(jié)合激活下游II相解毒酶和抗氧化基因發(fā)揮抗氧化作用[5，24]。結(jié)果顯示，抗纖丸組能明顯激活慢性肝損傷模型小鼠肝組織中Nrf2、HO-1、NQO1和Gclc的mRNA表達(dá)水平，以及肝組織中Nrf2、NQO1和Gclc的蛋白表達(dá)水平。

本研究結(jié)果表明抗纖丸能增加肝組織中SOD、GSH-Px的水平并且激活肝組織中 Nrf2、HO-1、NQO1和Gclc等抗氧化酶活性，提示抗纖丸可能是通過抑制氧化應(yīng)激保護(hù)肝細(xì)胞受損，這為抗纖丸的臨床應(yīng)用提供了基礎(chǔ)理論依據(jù)。此外，本研究選用甘草酸二銨作為陽性藥，結(jié)果顯示抗纖丸對CCL4誘導(dǎo)的慢性肝損傷小鼠相關(guān)療效指標(biāo)與甘草酸二銨處理組無顯著差異，但是抗纖丸在臨床中能否替代甘草酸二銨還有待進(jìn)一步研究。