病證結合模式下腹瀉型腸易激綜合征實驗動物模型的研究進展*

王寧，紀昌春，萬鵬，畢宇峰

（1.陜西中醫(yī)藥大學，咸陽 710046；2.陜西省中醫(yī)醫(yī)院針灸康復醫(yī)院，西安 710003）

腹瀉型腸易激綜合征（IBS-D）是由多種原因引起的一種功能性腸道疾病，人群發(fā)病率約占總腸易激綜合征40.83%[1]，且病程長、難治愈、易復發(fā)，嚴重的導致患者生活質量下降。然而目前IBS-D的病因及發(fā)病機制尚未明確，治療上西醫(yī)通常使用止瀉劑、解痙藥、益生菌等對癥治療為主，目前尚缺乏特效藥物治療[2-3]。中醫(yī)以其獨特的理論體系及診療方法對于臨床治療IBS-D的療效優(yōu)勢日益凸顯，而辨證論治是其良好療效的根本保障。近年來，國內外學者對中醫(yī)治療本病的作用機制不斷深入，建立病證結合動物模型是中醫(yī)研究IBS-D的核心所在。目前，已有學者采用多種方法構建IBS-D病證結合動物模型。

1 腹瀉型腸易激綜合征多因素聯(lián)合動物模型的建立及相關評價指標

1.1 IBS-D多因素聯(lián)合動物模型的建立 IBS-D動物模型大多選擇SD大鼠，其次從Wistar大鼠，小鼠，豚鼠和兔子中選擇。關于實驗動物的性別，一些文獻僅限于雄性或雌性，而另一些則根據(jù)雌雄各半的比例選擇動物。腹瀉和內臟高敏感是IBS-D的動物模型具備的兩大主要特征。目前現(xiàn)代醫(yī)學運用較多的造模方法有：采用冰番瀉葉、辣素、大黃水煎液等藥物以導瀉；乙酸等化學藥物灌腸刺激；急、慢性應激；母嬰分離法和直結腸球囊擴張法[4-5]等?；瘜W藥品（如：乙酸等）灌腸刺激及急慢性應激均會造成內臟高敏感性和情緒應激障礙的雙重作用。母嬰分離和新生兒直腸球囊擴張刺激的方法模擬了早期負面生活事件引起的心理壓力，形成的內臟高敏反應可以持續(xù)到成年。近年來在上述的多種造模方法中，目前多數(shù)學者應用多因素復合法制備IBS-D動物模型，其中應激反應聯(lián)合其他方法是IBS-D最為常用的造模方法。王一程等[6]研究發(fā)現(xiàn)母嬰分離聯(lián)合束縛應激+冰水應激+夾尾應激3種應激方式建立的IBS-D模型，能較好的復制出IBS-D腹瀉、內臟高敏感和心理抑郁的情況。Shan等[7]采用一種新型方式即慢、急性結合應激（CAS）成功復制IBS-D大鼠模型。韓亞飛等[8]采用球囊直腸刺激+冰醋酸灌腸+夾尾刺激+0.5 g/mL的番瀉葉濃縮劑（給藥體積為20 mL/kg）灌胃成功制備IBS-D模型。張濤等[9]研究發(fā)現(xiàn)束縛應激+夾尾刺激+0.25%辣素灌胃，持續(xù)2周制備的IBS-D大鼠模型與IBS-D患者較為相似，因其具備腹瀉頻次和內臟敏感性增加、肥大細胞表達升高等特點，且該方法簡單易行，認為值得推廣應用。

目前還有文獻提出當給藥劑量和濃度及急、慢性束縛應激的刺激量和周期不合適時，均不能穩(wěn)定地誘導出IBS-D模型。周天然等[10]研究發(fā)現(xiàn)慢性束縛應激的刺激量為束縛2 h/d且持續(xù)束縛14 d，才能復制出較成熟的IBS-D模型。此外，該研究在束縛應激中使用了創(chuàng)新性的束縛器材——用醫(yī)用彈性網(wǎng)狀繃帶來束縛大鼠。馬曉玲等[11]在采用慢性束縛應激+特殊飲食制備IBS-D大鼠模型的時效及量效關系中發(fā)現(xiàn)，當束縛時間在1 h以上，飼料中乳糖比例＞30%，連續(xù)造模7～14 d時可成功制備出IBS-D模型。此外，趙妍等[12]研究發(fā)現(xiàn)當用0.3 g/mL番瀉葉灌胃+束縛時間1 h制備出的IBS-D模型在內臟敏感性及腹瀉指數(shù)上具有一定的優(yōu)勢。張北華等[13]在比較幾種不同IBS-D大鼠造模方法時發(fā)現(xiàn)：新生期母子分離+4.5 g/kg番瀉葉灌胃或高乳糖飼料飼養(yǎng)所致大鼠模型可模擬IBS-D的主要臨床特征，認為其是較為理想的造模方法。同時也發(fā)現(xiàn)4%的醋酸溶液、外源性5-HT等方法造模時有一定的缺陷，難以與IBS-D模型的特征相一致。

綜上所述，上述復合因素復制的動物模型比較接近臨床患者的表現(xiàn)，也較為成熟，是目前國內外比較認可的造模方法。但在病因和發(fā)病機制的多因素化、復雜化和個體特殊化等方面存在一定的局限性，并且藥物的濃度及給藥藥量、應激時間等都會影響IBS-D模型的制備。

1.2 疾病模型的評價 目前對于IBS-D疾病模型的評估主要是對其兩大主要特征（腹瀉和內臟高敏感性）的評價。其中，腹瀉可采用布里斯托bristol大便分級法、腹瀉指數(shù)、一定時間內動物的排便粒數(shù)、糞便含水量及糞便積分等作為評價方法。布里斯托bristol大便分級是評估大便形態(tài)最簡單、有效的工具。腹瀉指數(shù)在評價不成形糞便時具有優(yōu)勢；一定時間內的排便粒數(shù)反映了動物大便的頻率；糞便含水量的估算則需要先稱原大便重量，然后用特有設備烘干大便稱其干重，最后通過計算公式得出結果。該方法雖比較繁瑣，但相對客觀；大便積分將大便次數(shù)和性狀結合在一起，是根據(jù)糞便性狀分別賦予不同的數(shù)值，并結合大便粒的數(shù)量進行計算的，該方法操作簡便。腹壁肌電活動、腹壁撤退反射（AWR）等方法可進行評估內臟敏感性的增加。此外，結合結腸組織學觀察，其病理變化應與功能性腸病的特點相一致[6-13]。

2 IBS-D證候模型研究概況

隨著近年來研究的深入，構建IBS-D病證結合模型的方法主要是基于西醫(yī)IBS-D模型再結合相關致病因素制備。根據(jù)中醫(yī)的病因病機采取化學藥物、物理和機械刺激3種方法，或制備特殊飲食，或模擬相關外界環(huán)境等來使原有動物狀態(tài)及身體條件發(fā)生變化，表現(xiàn)出與相關證型相符合的癥狀和體征，從而構建出證型和疾病兼具的模型。目前諸多學者已成功制備出肝郁脾虛證、脾腎陽虛證和脾胃濕熱證等IBS-D動物模型。

2.1 肝郁脾虛證的IBS-D動物模型的建立及評價

2.1.1 肝郁脾虛證的IBS-D動物模型的建立 肝郁脾虛的IBS-D模型與其他證候的模型相比，它更加完整和成熟。中醫(yī)認為本型IBS-D的病因主要與情志等因素密切相關，病機主要為肝氣疏泄失職，氣郁太過則犯脾，繼則脾失運化而致泄瀉。故肝郁脾虛證IBS-D動物模型在復制出IBS-D疾病模型的同時還要多從情志、飲食、化學及物理刺激等致病因素來使實驗動物肝氣不舒，脾失健運，從而導致其出現(xiàn)胃腸動力紊亂及焦慮抑郁等肝郁脾虛癥狀。近年來，諸多學者建立肝郁脾虛證IBS-D模型大多采用兩個因素以上的方式聯(lián)合制備，常采用藥物導瀉以及應激反應等方式。在藥物刺激方面多選擇影響脾胃功能而致瀉的中藥或是化學藥品，如番瀉葉、大黃、冰醋酸等。羅丹妮等[14]結合脾虛及肝郁兩點因素，選用0.3 g/mL的番瀉葉浸劑按10 mL/kg的劑量灌胃+慢性不可預知輕度應激，連續(xù)2周成功制備出IBS-D模型。其中采用的慢性不可預知輕度應激是一種常用的抑郁、焦慮造模方式，且具有導致內臟高敏感性及情緒應激性障礙的雙重作用，從而產(chǎn)生類似肝郁的表現(xiàn)，并以番瀉葉浸劑導瀉產(chǎn)生脾虛類似癥狀，復制出IBS-D肝郁脾虛型病證癥結合大鼠模型。鐘毅等[15]同樣采用番瀉葉（濃度：0.4 g/kg；給藥體積：0.1 mL/kg）灌胃+饑飽失常（隔日喂食）+強迫游泳法（溫度：22～25℃，水深70 cm，游泳至頭沒入水下≥10 s未浮出）連續(xù)2周復制出肝郁脾虛證IBS-D大鼠模型。張北華[16]選取番瀉葉水煎劑（4.5 g/kg）灌胃1周+母子分離+慢性束縛應激3周，成功制備肝郁脾虛證IBS-D大鼠模型。郭軍雄等[17]認為0.4 g/mL番瀉葉劑按4g/（kg·d）灌胃法聯(lián)合傳統(tǒng)束縛應激法連續(xù)進行2周復建的模型可能存在免疫平衡漂移。

此外，葉曉梅等[18]采用乙酸灌腸+夾尾激怒+束縛應激法，連續(xù)造模3周，復制了肝郁脾虛型IBS大鼠模型。還有文獻報道[19]采用“精神刺激+飲食失常+過度疲勞”方法復制出肝郁脾虛型IBS-D動物模型。具體方法是：利用冷水（11±1）℃游泳至精疲力竭（頭沒入水下 5 s）；禁食、禁水 24 h；高溫（45℃）烤箱15 min；夾尾5 min；30 V電壓電擊5 s后，間歇5 s，共電擊180 s；以上6種刺激，每天隨機選擇一種刺激再結合自制鐵籠束縛1 h，共循環(huán)3個周期成功制備出肝郁脾虛型IBS-D動物模型。

2.1.2 肝郁脾虛型特征的評價方法 肝郁脾虛證患者表現(xiàn)為：腹痛、腹瀉、急躁易怒、情緒低落，或善太息等。因此可通過借鑒焦慮抑郁癥的評價方法對中醫(yī)肝郁證IBS-D模型進行評價。常用的評價方法有：1）一般狀態(tài)觀察：通過大鼠皮毛變化（毛發(fā)凌亂、弓背蜷縮等）、對外界刺激反應遲鈍、精神心理狀態(tài)情況等來評價。2）相關實驗指標：如模型鼠內臟敏感性增加、糖水偏愛度增加，高架十字迷宮、曠場實驗水平和垂直運動降低等。此外，脾主運化，脾失健運則出現(xiàn)不思飲食，便溏等癥狀，因此從體重變化、飲食較少、大便不成形等狀態(tài)、大便頻次、腹瀉指數(shù)等指標進行脾虛癥狀評價[14-22]。

2.2 脾腎陽虛證的IBS-D動物模型的建立及評價

2.2.1 脾腎陽虛證的IBS-D動物模型的建立 中醫(yī)認為先天不足、病后體虛、飲食失宜及感受外邪等因素均可致脾腎陽虛，從而出現(xiàn)雞鳴瀉，腹部冷痛等一系列脾腎陽虛的癥狀。脾腎陽虛型IBS-D在臨床中十分常見。目前脾腎陽虛型IBS-D模型主要是基于中醫(yī)基礎理論指導，以物理、化學因素為主，結合苦寒瀉下傷陽等飲食失調、勞倦過度及驚恐傷腎等來模擬中醫(yī)的致病因素，選用幾種因素復合制備脾腎陽虛證模型。如劉佳星等[23]結合腎陽虛和脾陽虛兩點因素，采用0.2 g/kg腺嘌呤灌胃28 d+10 mL/kg的冰番瀉葉水浸劑灌胃14 d成功制備出脾腎陽虛型IBS-D大鼠模型。史海霞等[24]采用母嬰分離3周聯(lián)合1 g/mL番瀉葉水煎液按10 mL/kg灌胃4周，制備出脾腎陽虛型IBS-D大鼠模型后，并通過腹壁撤退反射、曠場實驗等指標評估IBS-D模型大鼠成功制備。此外，譚瑋璐[25]采用每日2次以200%番瀉葉濃縮溶液按20 mL/kg灌胃，再聯(lián)合束縛應激，共14 d制備出IBS-D大鼠模型后，用溫腎健脾法附子理中湯劑治療后發(fā)現(xiàn)此湯藥可改善腸道免疫功能、保持免疫穩(wěn)態(tài)從而達到治療效果。此模型的建立在一定程度上體現(xiàn)IBS-D動物模型的特點，但筆者認為在該研究過程中并未描述實驗動物在中醫(yī)證候脾腎陽虛方面的變化，而是僅僅憑借實驗指標推斷出附子理中湯對IBS-D癥狀有所改善。因此有必要進一步研究脾腎陽虛證IBS-D的造模，完善相應的評估標準，以期縮小模型與中醫(yī)臨床表現(xiàn)實際的差距。

2.2.2 脾腎陽虛型特征的評價方法 脾腎陽虛證患者多表現(xiàn)為五更瀉，腹部冷痛，四肢發(fā)涼，怕冷、乏力、腰膝酸軟等癥狀，因此對中醫(yī)脾腎陽虛證動物模型的評價首先可通過其宏觀體征進行評估——脾腎陽虛大鼠常表現(xiàn)為大便稀軟不成形，體溫下降、怕冷、自主活動減少、反應慢、弓背蜷縮、體毛枯疏、體重減輕等。其次，還可通過實驗指標、相關理化指標等方面進行評價。如負重游泳實驗及曠場試驗，可反映脾腎陽虛大鼠自主活動能力的下降。此外，如尿D-木糖排泄率或血清D-木糖含量等理化指標可測定大鼠的吸收功能，從而客觀反應脾的生理功能；血漿中環(huán)磷酸腺苷、磷酸鳥苷以及24 h尿17-羥類固醇含量是公認的反映腎陽虛證特異性病理變化的指標[24-27]。

2.3 脾胃濕熱證的IBS-D動物模型的建立及評價

2.3.1 脾胃濕熱證的IBS-D動物模型的建立 中醫(yī)認為脾胃濕熱證的IBS-D多因感受濕熱之邪，或過食肥甘厚膩所致腸腑傳化失常，而發(fā)生泄瀉。目前，關于脾胃濕熱型IBS-D模型相關文獻報道較少，其模型主要是在現(xiàn)代醫(yī)學疾病動物模型基礎上給予內、外致病因素等制備，牛曉玲等[28]分別從外在和內在濕熱兩方面制備此模型，將實驗動物置于高溫潮濕的環(huán)境中以模擬外界濕度，并且給予實驗動物高脂肪、高糖分等飲食方法以損傷脾胃從而制備脾胃濕熱的IBS-D模型。具體方法為：SD大鼠經(jīng)歷2周母嬰分離后，再給予普通飼料+12%豬油+8%蜂蜜混合喂養(yǎng)并每日按2 mL/kg劑量灌服一次大黃水煎液，連續(xù)1周，第4周進行直腸內氣囊擴張并將大鼠置入的濕熱環(huán)境（T：32±2℃、相對濕度90%～95%）中，1 h/次，2次/d；第5周進行夾尾和束縛應激連續(xù)進行14 d，第7周停止造模。

2.3.2 脾胃濕熱證IBS-D特征的評價方法 脾胃濕熱證患者其表現(xiàn)為瀉下急迫，大便溏滯不爽，肛門灼熱不適，口干、口苦或口臭，舌紅，苔黃膩，脈滑數(shù)等臨床特點。但根據(jù)動物癥狀辨別的可行性，可通過觀察一般狀態(tài)進行評價：在模型動物后期，體質量降低，無精打采，毛發(fā)松散粗糙，自由活動減少，大便時干時塘等作為觀察指標。

3 展望

IBS-D根據(jù)疾病表現(xiàn)屬于中醫(yī)“泄瀉”“腹痛”等范疇，根據(jù)《腸易激綜合征中醫(yī)診療專家共識意見（2017）》確定IBS-D包括脾虛濕阻、脾腎陽虛、寒熱錯雜、肝郁脾虛和脾胃濕熱5個中醫(yī)證型。然而，并未隨著證型分布的增加而構建出新增的病證結合的IBS-D動物模型。近年來脾虛濕阻和寒熱錯雜等證型的病人臨床上也較多見，但目前研究卻很少涉及，因此有必要建立脾虛濕阻和寒熱錯雜的病證結合的IBS-D模型，以深入了解本病的發(fā)病機理。此外，在已知的IBS-D動物實驗中，目前許多學者已經(jīng)意識到制備病證結合模式下動物模型時存在疾病與證候關聯(lián)性不強，所選動物與疾病人群體質不符，缺乏病證結合動物模型評價體系的問題，尤其是在模型評價方面，目前對于如舌苔、脈象這類不易得到又而與中醫(yī)的辨證、診斷密切相關的宏觀觀察指標，該如何提取、檢測以及建立相應的標準是今后動物模型研究中應該努力的方向。其次，模型應用中也存在忽視模型的周期性，忽視造模給藥的濃度及藥量等對動物模型影響的問題。這些也是十分需要解決的問題，值得進一步研究。綜上所述，IBS-D動物模型的發(fā)展方向其中之一是病證結合方法的應用。對于不同的病因病機、證候等特點，需要不斷完善IBS-D的模型，并且需要不斷探索、修正。只有要經(jīng)過大量而深入的實踐檢驗，才能真正地推動中醫(yī)藥研究IBS-D的不斷進步。