桃仁-紅花通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路改善IL-1β誘導(dǎo)的軟骨炎癥和降解

揭立士，時(shí)孝晴，劉子修，吳鵬，茆軍，張農(nóng)山，殷松江，王培民（.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 20029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 20023）

膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）是一種以膝關(guān)節(jié)軟骨退化、疼痛和畸形為特征的常見疾病[1]。膝骨關(guān)節(jié)炎的高發(fā)病率造成了巨大的社會(huì)成本，并且很難通過(guò)當(dāng)前的生物醫(yī)藥和社會(huì)心理策略得到充分控制[2]。中草藥治療疾病具有悠久的歷史和良好的臨床療效，據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界上超過(guò)一半的人口正在使用藥用植物[3]。然而，中草藥成分復(fù)雜，作用機(jī)制不明確，阻礙了其臨床的廣泛使用。如何闡明中草藥治療疾病的具體機(jī)制，是目前研究人員的主要挑戰(zhàn)。

一項(xiàng)分析[4]顯示，在治療膝骨關(guān)節(jié)炎的中藥中，桃仁和紅花聯(lián)合使用具有較高的置信度。紅花是菊科植物Carthamus tinctoriusL 的干花，具有活血化瘀止痛的作用，常用于治療月經(jīng)相關(guān)疾病、風(fēng)濕病和心血管疾病[5]。紅花的這些生物活性可歸因于幾類化合物，如喹諾酮類、黃酮類、生物堿、類固醇、酚類化合物和紅花多糖[6]。羥基紅花黃色素A（HSYA）是紅花的重要活性成分，現(xiàn)代藥理和分子生物學(xué)研究[7]證實(shí)，HSYA 具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤和神經(jīng)保護(hù)作用。紅花中的山柰酚通常用作紅花的定性和定量標(biāo)準(zhǔn)。研究[8]表明，山柰酚具有鎮(zhèn)痛和抗炎作用。 桃仁是Prunus persica（L.）Batsch或Prunus davidiana（carr.）Franch的干燥成熟種子，主要成分包括脂肪油、蛋白質(zhì)、氨基酸、揮發(fā)油、甾體和甙類[9]?；A(chǔ)研究[10]表明，桃仁具有抗炎、鎮(zhèn)痛和解熱等作用?？嘈尤受帐翘胰实闹饕幚沓煞种唬芯縖11]表明，苦杏仁苷可明顯抑制RAW 264.7 細(xì)胞中IL-1β 和TNF-α 的表達(dá)，降低LPS 激活的RAW 264.7 細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、數(shù)學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的數(shù)據(jù)揭示了多靶點(diǎn)藥物的特征。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以利用計(jì)算機(jī)學(xué)和復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)等系統(tǒng)生物學(xué)的研究方法，更好地在分子水平上了解細(xì)胞和器官的行為，加速藥物靶點(diǎn)的識(shí)別，識(shí)別新的生物標(biāo)志物[12]。傳統(tǒng)的藥物發(fā)現(xiàn)既昂貴又耗時(shí)，將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)引入能夠顯著降低研究的經(jīng)濟(jì)和時(shí)間成本[13]。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，探索桃仁-紅花治療膝骨關(guān)節(jié)炎的分子機(jī)制和靶點(diǎn)，以期為該藥物的研究和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 桃仁-紅花治療膝骨關(guān)節(jié)炎的機(jī)制預(yù)測(cè)

1.1.1 藥物活性成及作用靶點(diǎn)的篩選 使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（TMSP）和中藥分子機(jī)制生物信息學(xué)分析工具（BATMAN-TCM）檢索桃仁-紅花的活性成分[14-15]。在TCMSP 中分別檢索桃仁和紅花的中藥化學(xué)成分信息，其篩選條件設(shè)置為藥物口服生物利用度（OB）≥30%，藥物相似性（DL）≥0.18，獲取藥物的活性成分。按照BATMAN-TCM 操作步驟，設(shè)置“藥物-靶標(biāo)”間相似性得分Score cutoff ≥20，校正P值＜0.05。

1.1.2 疾病靶點(diǎn)和共同靶點(diǎn)的篩選 GeneCard、DisGeNET、OMIM、DrugBank 和PharmGKB 數(shù)據(jù)庫(kù)用于建立疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)以檢索和篩選膝骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因。維恩圖用于顯示藥物和疾病靶點(diǎn)之間的邏輯關(guān)系，藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)相映射，篩選得到桃仁-紅花治療膝骨關(guān)節(jié)炎的共同靶點(diǎn)。

1.1.3 藥物-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 基于上述數(shù)據(jù)集，Cytoscape 3.7.2 建立了桃仁-紅花治療膝骨關(guān)節(jié)炎的藥物-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。對(duì)于靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的可視化分析，各節(jié)點(diǎn)（node）代表桃仁-紅花和膝骨關(guān)節(jié)炎的相關(guān)靶點(diǎn)，邊（edge）代表這些生物分析之間的相互作用。

1.1.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)與核心目標(biāo)分析 將獲得的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，并繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。條件設(shè)定：Multiple Proteins，Homo sapiens，置信度為0.7。Cytoscape 軟件中的“CytoNCA”插件用于拓?fù)鋵傩苑治?，獲得中介中心性（BC），接近中心性（CC），度中心性（DC），特征向量中心性（EC），網(wǎng)絡(luò)中心性（NC），局部平均連通性（LAC）的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)。首先篩選出DC 值大于兩倍中位數(shù)的節(jié)點(diǎn)構(gòu)成顯著交集PPI 網(wǎng)絡(luò)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步篩選出同時(shí)滿足BC、CC、DC、EC、NC、LAC 分別大于中位數(shù)的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)構(gòu)成核心PPI 網(wǎng)絡(luò)。

1.1.5 GO 和KEGG 富集分析 R 軟件用于GO 和KEGG 富集分析。參數(shù)如下：最小基因數(shù)為5，最大基因數(shù)為5 000，P值＜0.05，F(xiàn)DR＜0.25。

1.1.6 分子對(duì)接 桃仁-紅花的藥物活性成分作為配體，靶標(biāo)蛋白作為受體，運(yùn)用Discovery Studio（DS）軟件進(jìn)行分子對(duì)接。配體的資料是從Chemicalbook、TCMSP 和PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的。受體蛋白的晶體結(jié)構(gòu)是從RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的。首先通過(guò)DS軟件對(duì)受體和配體進(jìn)行自動(dòng)化預(yù)處理（默認(rèn)參數(shù)）。然后定義和編輯結(jié)合位點(diǎn)，即蛋白質(zhì)晶體中原始配體的位置定義為活性口袋。運(yùn)行Dock Ligands（LibDock）模塊，條件設(shè)定為默認(rèn)參數(shù)。LibDock 評(píng)分用于評(píng)價(jià)對(duì)接結(jié)果，得分越高表明藥物的活性成分與靶標(biāo)結(jié)合力越好。

1.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.2.1 動(dòng)物 30 只C57BL/6J 雄性小鼠（6～8 周齡）購(gòu)自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2018-0008，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：202255970。動(dòng)物飼養(yǎng)在控制溫度為（26 ± 0.5）℃、濕度為50%、以及12 h 光/暗環(huán)境中。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：202104A017。

1.2.2 藥物及試劑 DMEM 高糖培養(yǎng)基（貨號(hào)：C11995500CP）和胎牛血清（貨號(hào)：10099-141），購(gòu)自美國(guó)GIBCO 公司；Recombinant Mouse IL-1β（貨號(hào)：401-ML-010），購(gòu)自美國(guó)R&D 公司；Cell Counting Kit-8（貨號(hào)：C0038），購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Sox9（貨號(hào)：AF6330）、Collagen Ⅱ（貨號(hào)：AF0135）、Aggrecan（貨號(hào)：DF7561）、p-NF-kB p65（Ser536，貨號(hào)：AF2006）、NF-kB p65（貨號(hào)：AF5006）、JNK1/2/3（貨號(hào)：AF6318）、IKB α（貨號(hào)：AF5002）和p-JNK1/2/3（Thr183+Tyr185， 貨號(hào)：AF3318），購(gòu)自中國(guó)Affinity 公司；ERK（貨號(hào)：4695）、p-ERK（Thr202/Tyr204，貨號(hào)：4370），購(gòu)自美國(guó)CST 公司；p38 MAPK（貨號(hào)：sc-81621）、pp38 MAPK（貨號(hào)：sc-166182），購(gòu)自美國(guó)SANTA公司。

1.2.3 儀器 FreeZone 冷凍干燥機(jī)，美國(guó)Labconco 公司；N-1200B EYELA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司；Eclipse Ti 激光共聚焦倒置熒光顯微鏡，日本NIKON 公司；Enspire 多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Perkin Elmer 公司。

1.2.4 藥物制備 桃仁和紅花購(gòu)自南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將桃仁10 g、紅花10 g 加10 倍水量混合后在蒸餾水中煮沸并過(guò)濾。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)，然后在低溫真空干燥箱中凍干至恒質(zhì)量，用于進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 小鼠原代軟骨細(xì)胞的提取 用過(guò)量的戊巴比妥鈉處死小鼠。在無(wú)菌條件下提取股骨髁和脛骨平臺(tái)的關(guān)節(jié)軟骨。將組織切成小塊（1 mm3），0.2% Ⅱ型膠原酶消化4～6 h。然后過(guò)70 μm 濾器，以1 200 r·min-1（離心半徑8 cm），離心5 min。將軟骨細(xì)胞以2×105個(gè)·mL-1的密度接種在10 cm2培養(yǎng)皿中，并置于37 ℃、5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。

1.2.6 分組及給藥 將小鼠軟骨細(xì)胞分為5 組：對(duì)照組、IL-1β 組及桃仁-紅花低、中、高劑量組。桃仁-紅花各劑量組，先分別給予桃仁-紅花（75、100、200 μg·mL-1）預(yù)處理4 h，然后IL-1β 組及桃仁-紅花各劑量組再分別加入IL-1β（10 ng·mL-1）在37 ℃、含5% CO2的環(huán)境中共同孵育24 h。對(duì)照組僅給予正常細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.2.7 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活性 將細(xì)胞以6 000 個(gè)·孔-1的密度接種在96 孔板中，在培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)培養(yǎng)24 h。使用不同濃度（0、25、50、75、100 和200 μg·mL-1）的桃仁-紅花干預(yù)24 h；向每個(gè)孔中加入10 μL CCK-8 溶液，并在37 ℃下孵育2 h；多功能酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處的吸光度。

1.2.8 Western Bolt 法檢測(cè)蛋白表達(dá) 使用RIPA（含1 %PMSF）裂解液將干預(yù)后的軟骨細(xì)胞裂解并收集，于4 ℃、12 000 r·min-1（離心半徑8 cm），離心30 min。BCA 法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，確定上樣體積。用凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，按說(shuō)明書比例配制Collagen Ⅱ、Aggrecan、Sox9、p65、p-p65、和IκB 抗體，4 ℃過(guò)夜孵育。第2 天，按1∶1 000 比例配制二抗，室溫孵育2 h。滴加ECL顯影液，凝膠成像系統(tǒng)顯影，ImageJ 圖像分析軟件用于分析條帶。

1.2.9 qRT-PCR 法檢測(cè)基因表達(dá) 用TRIzol 試劑提取總mRNA，計(jì)算RNA 濃度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT Master Mix 和 SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR。在NCBI 上搜索目的基因的序列，運(yùn)用primer 5 軟件設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物。目的基因及內(nèi)參基因GAPDH 序列見表1。以2-ΔΔCt計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.10 免疫熒光法檢測(cè)軟骨細(xì)胞p65 核轉(zhuǎn)位 6 孔板內(nèi)置細(xì)胞爬片，將軟骨細(xì)胞接種于6 孔板內(nèi)。按照“1.2.6”項(xiàng)下分組完成細(xì)胞造模及給藥（200 μg·mL-1）。取細(xì)胞爬片以4%多聚甲醛固定，Block Buffer 室溫封閉，加入p65 一抗4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗室溫避光孵育1 h。滴加DAPI 對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色5 min，洗去DAPI，待干燥后用抗熒光淬滅封片劑封片，使用激光共聚焦倒置熒光顯微鏡觀察p65 蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位與表達(dá)。

1.2.11 HE 和番紅O/Fast Green 染色對(duì)軟骨進(jìn)行組織學(xué)評(píng)估 將30 只小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、給藥組，每組各10 只。其中假手術(shù)組僅切開膝關(guān)節(jié)部位皮膚予以對(duì)照，而模型組和給藥組在麻醉后，通過(guò)手術(shù)構(gòu)建不穩(wěn)定內(nèi)側(cè)半月板（DMM）的膝骨關(guān)節(jié)炎小鼠模型[14]。在術(shù)后第14 天進(jìn)行治療，其中給藥組按照3 g·kg-1對(duì)小鼠進(jìn)行桃仁-紅花藥液灌胃，而假手術(shù)組及模型組則給予等容積的蒸餾水，每天灌胃給藥1 次，連續(xù)56 d[15]。末次給藥完成后，1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，切取膝軟骨組織，每組隨機(jī)選取2 只小鼠軟骨放入4%多聚甲醛保存，用石蠟包埋，切片，并進(jìn)行HE、番紅O/固綠染色。此外，用OARSI 評(píng)分評(píng)估小鼠的關(guān)節(jié)損傷[16]。

1.2.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 使用SPSS 22.0 版軟件（SPSS）和GraphPad Prism 8.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）的形式表示。通過(guò)t檢驗(yàn)、單向方差分析或雙向方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 活性藥物成分的篩選見表2。根據(jù)篩選條件進(jìn)行檢索篩選，共獲得桃仁-紅花有效成分45 種，刪除無(wú)效及重復(fù)的15 種活性成分，最終得30 種活性成分以進(jìn)一步分析。

表2 桃仁和紅花的活性成分信息Table 2 Active components information of Persicae Semen and Carthami Flos

2.2 “藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分子對(duì)接分析通過(guò)搜索TCMSP 和BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選出藥物靶標(biāo)，共588 個(gè)。之后將獲得的靶標(biāo)上傳到UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行基因名稱轉(zhuǎn)換。刪除無(wú)效和重復(fù)靶標(biāo)后，共獲得459 個(gè)活性成分靶點(diǎn)。在GeneCard、DisGeNET、OMIM、DrugBank 和PharmGKB數(shù)據(jù)庫(kù)中，以“Knee osteoarthritis”“Osteoarthritis of Knee”和“Osteoarthritis，Knee”作為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，篩選得到1 952 個(gè)膝骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點(diǎn)。將疾病和藥物靶點(diǎn)進(jìn)行映射后，得到126 個(gè)共同靶點(diǎn)，見圖1-A。

使用Cytoscape 軟件構(gòu)建了藥物活性成分-共同靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖，包含152 個(gè)點(diǎn)和323 條邊（圖1-B）。以Degree 值作為拓?fù)浞治龅闹饕獏⒖家罁?jù)，前5 位的活性成分分別為槲皮素、β-谷甾醇、鞣花酸、天竺葵素和豆甾醇。這些排位靠前的藥物成分可能是桃仁-紅花治療膝骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵化合物。

為進(jìn)一步研究桃仁-紅花治療膝骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制，利用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，繪制蛋白質(zhì)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。我們將126 個(gè)共同基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，得到桃仁-紅花作用于膝骨關(guān)節(jié)炎的PPI 網(wǎng)絡(luò)。之后依據(jù)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果進(jìn)行核心靶點(diǎn)篩選，篩選過(guò)程及參數(shù)見圖1-C。

對(duì)篩選得到的3 個(gè)核心靶點(diǎn)（JUN、IL-6 和RELA）和活性成分進(jìn)行分子對(duì)接分析。通過(guò)靶點(diǎn)之間的結(jié)合程度來(lái)評(píng)價(jià)配體與受體的結(jié)合能力，即計(jì)算擬合后得到的LibDock 分?jǐn)?shù)。拓?fù)浞治霰砻?，槲皮素的預(yù)測(cè)排第一位，我們展示了槲皮素與3 個(gè)核心靶點(diǎn)的對(duì)接過(guò)程，見圖1-D。

2.3 GO 和KEGG 富集分析圖2-A GO 富集分析結(jié)果表明，共富集了2 302 條生物學(xué)過(guò)程（Biological processes，BP），桃仁-紅花治療膝骨關(guān)節(jié)炎可能與脂多糖、氧化應(yīng)激、活性氧和類固醇激素的反應(yīng)有關(guān)。在分子功能（Molecular function，MF）類別中，富集了154 個(gè)過(guò)程，包括細(xì)胞因子活性、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、受體配體活性等。在細(xì)胞組分（Cellular components，CC）類別中，富集了77 條，主要與膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、小窩和囊泡腔有關(guān)。

圖2 GO 和KEGG 富集分析Figure 2 GO and KEGG enrichment analysis

圖2-B 的KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，流體剪切應(yīng)力、IL-17 和NF-κB 信號(hào)通路可能與桃仁-紅花治療膝骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制密切相關(guān)。

2.4 桃仁-紅花對(duì)小鼠軟骨細(xì)胞活性的影響圖3-A和圖3-B 結(jié)果顯示，桃仁-紅花在25、50、75、100和200 μg·mL-1分別處理24 h 和48 h 后，桃仁-紅花均不抑制軟骨細(xì)胞的活力。故在隨后的研究中，選用濃度分別為75、100 和200 μg·mL-1的桃仁-紅花對(duì)軟骨細(xì)胞進(jìn)行24 h 的藥物干預(yù)。

圖3 CCK-8 法測(cè)定不同濃度桃仁-紅花對(duì)軟骨細(xì)胞活性的影響（±s，n=6）Figure 3 The effect of different concentration of Persicae Semen and Carthami Flos on the activity of chondrocytes by CCK-8 assay（±s，n=6）

2.5 桃仁-紅花對(duì)IL-1β 誘導(dǎo)的小鼠軟骨降解的影響Collagen Ⅱ、Aggrecan 和Sox9 常用于評(píng)估軟骨退變[18]。軟骨細(xì)胞在有或沒有桃仁-紅花的情況下暴露于IL-1β（10 ng·mL-1）24 h。采用Western Blotting 檢測(cè)Collagen Ⅱ、Aggrecan 和Sox9 的表達(dá)。如圖4 所示，桃仁-紅花可以劑量依賴性地逆轉(zhuǎn)IL-1β 誘導(dǎo)的Collagen Ⅱ、Aggrecan 和Sox9 在蛋白質(zhì)水平上的下調(diào)。

圖4 桃仁-紅花對(duì)IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞Collagen Ⅱ、Aggrecan 和Sox9 蛋白表達(dá)的影響（±s，n=3）Figure 4 The effect of Persicae Semen and Carthami Flos on the protein expressions of Collagen Ⅱ，Aggrecan and Sox9 in chondrocytes induced by IL-1β（±s，n=3）

2.6 桃仁-紅花對(duì)細(xì)胞內(nèi)炎癥介質(zhì)mRNA 的影響包括COX-2、iNOS 和IL-6 在內(nèi)的炎癥介質(zhì)常用于評(píng)估細(xì)胞炎癥反應(yīng)[19]。軟骨細(xì)胞在有或沒有桃仁-紅花的情況下暴露于IL-1β（10 ng·mL-1）24 h，采用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)COX-2、iNOS 和IL-6 的mRNA 水平。如圖5 所示，桃仁-紅花可以劑量依賴性地降低IL-1β誘導(dǎo)的COX-2、iNOS 和IL-6 的mRNA 水平。

圖5 桃仁-紅花對(duì)IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中炎癥因子COX-2、iNOS 和IL-6 mRNA 的影響（±s，n=3）Figure 5 The effect of Persicae Semen and Carthami Flos on the mRNA expressions of inflammatory factors（COX-2，iNOS and IL-6）in IL-1β-induced chondrocytes（±s，n=3）

2.7 桃仁-紅花對(duì)IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞NF-κB 信號(hào)激活的影響用Western Blot 法檢測(cè)IκBα、p-p65和p65 的蛋白質(zhì)水平，以進(jìn)一步探索桃仁-紅花的潛在抗炎機(jī)制。圖6-A 的結(jié)果表明，IL-1β 誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞IκBα 蛋白表達(dá)下降，并增強(qiáng)p65 的磷酸化水平（P＜0.05）；然而，桃仁-紅花逆轉(zhuǎn)了這些影響，以200 μg·mL-1組效果為佳（P＜0.05）。圖6-B 免疫熒光結(jié)果顯示，p65 蛋白主要位于未用IL-1β 處理的小鼠軟骨細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，經(jīng)過(guò)IL-1β 刺激后，p65 蛋白易位進(jìn)入細(xì)胞核，桃仁-紅花可逆轉(zhuǎn)IL-1β 誘導(dǎo)的p65 核轉(zhuǎn)位。

圖6 桃仁-紅花對(duì)IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞NF-κB 信號(hào)激活的影響（±s，n=3）Figure 6 The effect of Persicae Semen and Carthami Flos on activation of NF-κB signaling in IL-1β-induced chondrocytes（±s，n=3）

2.8 桃仁-紅花改善膝骨關(guān)節(jié)炎小鼠的軟骨退變使用HE 和番紅O/固綠染色評(píng)估小鼠膝骨關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度。如圖7-A 所示，桃仁-紅花阻止了膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨的進(jìn)一步退化。圖7-B 顯示，與假手術(shù)組比，模型組OARIS 評(píng)分升高，使用桃仁-紅花處理后，給藥組中膝骨關(guān)節(jié)炎小鼠的OARIS 評(píng)分降低（均P＜0.05）。圖7-C 的Western Blot 結(jié)果顯示，模型組Collagen Ⅱ、Aggrecan 和Sox9 蛋白表達(dá)低于假手術(shù)組，而桃仁-紅花可升高相應(yīng)蛋白的表達(dá)量（P＜0.05）。此外，圖7-D 顯示，桃仁-紅花降低了模型組COX-2、iNOS 和IL-6 的mRNA 水平（P＜0.05）。這些數(shù)據(jù)表明，桃仁-紅花可改善膝骨關(guān)節(jié)炎小鼠的軟骨退變和炎癥狀態(tài)。

圖7 桃仁-紅花對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎小鼠軟骨退變和炎癥狀態(tài)的影響（±s，n=3）Figure 7 The effect of Persicae Semen and Carthami Flos on cartilage degeneration and inflammatory state of KOA mice（±s，n=3）

3 討論

膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，多種相互關(guān)聯(lián)的免疫信號(hào)通路的激活和細(xì)胞因子產(chǎn)生的不平衡性促進(jìn)了膝骨關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)[17]。這種炎癥反應(yīng)一方面給患者帶來(lái)了劇烈疼痛，另一方面對(duì)關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)和周圍組織也產(chǎn)生了負(fù)面影響[18]。目前，膝骨關(guān)節(jié)炎的主要治療方式仍是非甾體抗炎藥（NSAID）。然而，這些抗炎藥只能減輕關(guān)節(jié)的疼痛和腫脹，并且長(zhǎng)期服用會(huì)引起嚴(yán)重的副作用[19]。因此，我們需要探索一種有效的膝骨關(guān)節(jié)炎治療策略。中醫(yī)藥為治療膝骨關(guān)節(jié)炎提供了重要的附加選擇。長(zhǎng)期以來(lái)，中藥一直用于治療包括膝骨關(guān)節(jié)炎在內(nèi)的多種疾病[20]。然而，大多數(shù)中草藥治療膝骨關(guān)節(jié)炎的分子機(jī)制尚不清楚，這在一定程度上限制了中藥治療膝骨關(guān)節(jié)炎的臨床應(yīng)用。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，構(gòu)建桃仁-紅花治療膝骨關(guān)節(jié)炎的藥物活性成分目標(biāo)網(wǎng)絡(luò)。并通過(guò)共同靶點(diǎn)的富集分析、關(guān)鍵靶點(diǎn)信息和信號(hào)通路的篩選，系統(tǒng)探索了桃仁-紅花治療膝骨關(guān)節(jié)炎的分子機(jī)制。

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，本次研究利用中藥靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)和人類疾病基因數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選出桃仁、紅花作用于膝骨關(guān)節(jié)炎的藥物活性成分。槲皮素、β-谷甾醇、鞣花酸（EA）、天竺葵素（PEL）和豆甾醇是預(yù)測(cè)結(jié)果中的最優(yōu)活性成分。槲皮素是一種廣泛存在于蔬菜和水果中的類黃酮，具有多種藥理作用，包括清除氧自由基、抗氧化應(yīng)激作用和抗炎作用[21]。基礎(chǔ)研究[22]表明，槲皮素顯著降低IL-1β、TNF-α 和IL-6 的表達(dá)和分泌，在治療膝骨關(guān)節(jié)炎方面具有潛在的藥用價(jià)值。槲皮素通過(guò)SIRT1/AMPK通路抑制大鼠軟骨細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而減輕氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡并阻止膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠的病理進(jìn)展[23]。此外，槲皮素還可能通過(guò)調(diào)節(jié)滑膜巨噬細(xì)胞向M2 巨噬細(xì)胞極化發(fā)揮軟骨保護(hù)作用[24]。β-谷甾醇是一種植物甾醇，屬于四環(huán)三萜類化合物，廣泛存在于各種植物油、水果、蔬菜和植物種子中[25]。研究[26]表明，β-谷甾醇以濃度依賴性方式降低實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠腸道組織中TNF-α、IL-6 和IL-1β 的水平。EA 是一種存在于漿果和堅(jiān)果中的天然多酚，具有抗炎作用。體外研究[27]表明，EA 抑制IL-1β 誘導(dǎo)的iNOS、COX-2、NO、TNF-α 和PGE2 的表達(dá)，下調(diào)MMP-13 和ADAMTS-5 的表達(dá)，并且EA 也被證明可以上調(diào)Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖。豆甾醇是一種植物甾醇，能夠顯著抑制MMPs 的表達(dá)，抑制軟骨的降解[28]。

軟骨細(xì)胞的退化是膝骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展的重要組成部分，IL-1β 等炎癥因子被認(rèn)為是軟骨細(xì)胞代謝紊亂的主要原因[29]。本研究的數(shù)據(jù)表明，IL-1β 的刺激導(dǎo)致軟骨細(xì)胞炎癥因子上調(diào)。然而，桃仁-紅花逆轉(zhuǎn)了COX-2、iNOS 和IL-6 等炎癥因子的增加。Ⅱ型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖是關(guān)節(jié)軟骨中細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的關(guān)鍵成分[30]。充足的Ⅱ型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖對(duì)于關(guān)節(jié)軟骨的生理、生物力學(xué)特性非常重要[31]。本研究結(jié)果表明，桃仁-紅花同樣上調(diào)了軟骨細(xì)胞的聚集蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)。此外，SOX9 可抑制軟骨細(xì)胞肥大，促進(jìn)軟骨形成[32]。研究[33]發(fā)現(xiàn)，在膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中，SOX9 水平降低可能是祖細(xì)胞無(wú)法在受損部位再生完整的軟骨的原因之一。此外，有研究[34]表明，SOX9 是控制軟骨ECM 穩(wěn)態(tài)的重要轉(zhuǎn)錄因子，也是通過(guò)促進(jìn)Collagen Ⅱ表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵因素。本項(xiàng)研究表明，IL-1β 的刺激導(dǎo)致軟骨細(xì)胞SOX9 下調(diào)，而桃仁-紅花逆轉(zhuǎn)了這一現(xiàn)象。

本研究進(jìn)行的通路富集分析表明，NF-κB 信號(hào)通路在桃仁-紅花治療膝骨關(guān)節(jié)炎中起重要作用。正如先前的論述[35-38]，NF-κB 幾乎影響膝骨關(guān)節(jié)炎炎癥的所有階段。NF-κB/Rel 家族的轉(zhuǎn)錄因子參與廣泛的生物學(xué)過(guò)程，例如免疫反應(yīng)、炎癥、增殖、分化、細(xì)胞存活和凋亡。體外研究[39]表明，Rela/p65 是介導(dǎo)NF-κB 信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵亞基，并參與軟骨形成、軟骨細(xì)胞分化、細(xì)胞存活和分解代謝酶的產(chǎn)生。軟骨細(xì)胞中的p65 過(guò)表達(dá)可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的增殖和分化，并通過(guò)增加BMP2 的表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞凋亡[40]。在生理?xiàng)l件下，p65 存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)受IL-1β 刺激時(shí)，p65 釋放增加并迅速轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，進(jìn)而促進(jìn)大量炎癥因子的表達(dá)。本項(xiàng)研究結(jié)果表明，桃仁-紅花能夠抑制p65 的表達(dá)和核轉(zhuǎn)位。這表明桃仁-紅花可能通過(guò)抑制NF-κB 信號(hào)通路的激活來(lái)保護(hù)軟骨細(xì)胞。

在體內(nèi)研究中，我們?cè)u(píng)估了桃仁-紅花對(duì)體內(nèi)膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)展的抑制作用，使用HE 和番紅O/固綠染色評(píng)估了小鼠膝骨關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度。與Sham 組相比，DMM 組具有明顯的形態(tài)學(xué)變化，包括粗糙的表面和無(wú)序且減少的軟骨細(xì)胞。然而，桃仁-紅花處理后軟骨表面形態(tài)和細(xì)胞數(shù)量有所改善。與DMM 組相比，桃仁-紅花還降低了OARIS 組織學(xué)評(píng)分。免疫組織化學(xué)結(jié)果還顯示，DMM 組中Collagen Ⅱ和Aggrecan 陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量減少，但在桃仁-紅花處理后恢復(fù)。Western Blot 結(jié)果顯示，DMM 組CollagenⅡ、Aggrecan 和SOX9 蛋白表達(dá)高于Sham 組，使用桃仁-紅花干預(yù)后有所改善。此外，桃仁-紅花降低了DMM 刺激對(duì)炎癥介質(zhì)過(guò)度表達(dá)的影響。這些數(shù)據(jù)表明，桃仁-紅花改善了小鼠模型中的膝骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展。

本研究仍有一定的限制性，我們沒有進(jìn)行桃仁、紅花藥對(duì)的入血成分鑒定，只對(duì)可能有效的單體成分進(jìn)行了預(yù)測(cè)。下一步，我們將對(duì)桃仁、紅花中作用于軟骨細(xì)胞的具體物質(zhì)做出鑒定，并結(jié)合體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，對(duì)我們的研究結(jié)果進(jìn)一步論證。

綜上所述，本研究通過(guò)多種靶點(diǎn)和多途徑的聯(lián)合作用初步探討了桃仁-紅花治療膝骨關(guān)節(jié)炎的潛在機(jī)制。我們的研究結(jié)果表明，桃仁-紅花可以通過(guò)抑制NF-κB 信號(hào)通路抑制軟骨細(xì)胞炎癥和軟骨降解。本研究為桃仁-紅花治療膝骨關(guān)節(jié)炎的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)和新的認(rèn)識(shí)，初步揭示了桃仁-紅花治療膝骨關(guān)節(jié)炎療效的物質(zhì)基礎(chǔ)和潛在機(jī)制。