從微觀血瘀角度探討補(bǔ)陽還五湯對特發(fā)性肺纖維化大鼠的影響

韓云鵬，田津，劉立石，劉文雅，王翼軒，閆亞男，方朝義（.河北中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050200；2.河北省中西醫(yī)結(jié)合肺病研究重點實驗室，河北 石家莊 05009）

特發(fā)性肺纖維化（Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種病因不明的纖維化性、慢性進(jìn)行性間質(zhì)肺炎，發(fā)病率呈增長趨勢，其病理特點為彌漫性肺泡炎，及肺泡上皮細(xì)胞損傷和異常修復(fù)所致的肺間質(zhì)進(jìn)行性纖維化，導(dǎo)致肺功能不可逆下降[1]，癥狀多見干咳、勞累性呼吸困難和疲勞等。該病的病因病機(jī)尚未完全明確，主要有炎癥反應(yīng)、上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、氧化應(yīng)激和相關(guān)信號傳導(dǎo)通路活化等相關(guān)學(xué)說[2-4]。IPF 屬于中醫(yī)學(xué)“肺痿”或“肺痹”范疇，臨床多為氣虛血瘀證型，常用補(bǔ)益肺氣、活血通絡(luò)之法[5]，補(bǔ)益肺氣有助于提高患者免疫功能，活血通絡(luò)則能改善肺臟微循環(huán)。補(bǔ)陽還五湯是補(bǔ)氣活血通絡(luò)的經(jīng)典名方，被廣泛用于IPF 的治療，且具有較好療效[6-8]。研究[9-13]發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽還五湯能夠通過多環(huán)節(jié)、多通道、多靶點發(fā)揮抗肺纖維化的作用，與調(diào)控炎性因子表達(dá)、干預(yù)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、抑制成纖維細(xì)胞增殖、維持氧化/抗氧化平衡、調(diào)節(jié)血管生成、保護(hù)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞、促進(jìn)自噬激活，以及調(diào)控TGF-β/Smad/ERK、HMGB1、PTEN/mTOR 相關(guān)信號通路等有關(guān)。氣虛引起推動血液運(yùn)行能力下降，血瘀則致血流郁積于經(jīng)脈或器官而呈現(xiàn)凝滯狀態(tài)。故本研究擬通過觀察血液流變學(xué)指標(biāo)及肺小動脈的形態(tài)變化，從微觀血瘀角度探討實驗性IPF 大鼠的氣虛血瘀狀態(tài)及補(bǔ)陽還五湯的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 動物6 周齡雄性SD 大鼠60 只，SPF 級，體質(zhì)量180～200 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2021-0006，實驗動物質(zhì)量合格證號：110011200107908327。大鼠飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)動物房，自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料和純凈水。本動物實驗經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院倫理委員會審查，倫理批文號：DWLL2020086。

1.2 藥物及試劑補(bǔ)陽還五湯方劑組成：生黃芪120 g（批號：20200801）、當(dāng)歸尾6 g（批號：20200630）、赤芍4.5 g（批號：088200901）、川芎3 g（批號：098191202）、紅花3 g（批號：20200701）、桃仁3 g（批號：20200912）、地龍3 g（批號：A190034001），每劑142.5 g，購自北京同仁堂藥店，上述藥材均經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院張丹教授鑒定合格。所有藥材以純凈水煎煮2 次，每次30 min，過濾去渣，藥液保存于冰箱備用。

注射用鹽酸博來霉素（Bleomycin，BLM），浙江翰暉制藥有限公司，批號：20 067411；乙磺酸尼達(dá)尼布膠囊，德國勃林格殷格翰公司，批號： 900678；戊巴比妥鈉，江蘇艾康生物醫(yī)藥研發(fā)有限公司，批號：57-33-0。HE、Masson 染色試劑盒，珠海貝索生物技術(shù)有限公司，批號分別為：BA-4097、BA-4079A；乙二胺四乙酸二鉀，北京華威銳科化工有限公司，批號：2001-94-7。

1.3 主要儀器LBY-N75008 型全自動血液流變儀，北京普利生儀器有限公司；Plus384 型酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices 公司；EG11508 型組織包埋機(jī)、HI1210 型攤片機(jī)、RM2255 型全自動輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，德國徠卡公司；BX53 型顯微鏡，日本Olympus公司；3K15 型高速冷凍離心機(jī)，德國Sigma 公司；WBP-RT4 型清醒動物肺功能檢測系統(tǒng)，法國EMKA科技公司。

1.4 分組、模型復(fù)制及給藥適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，將大鼠隨機(jī)分為4 組：對照組、模型組、尼達(dá)尼布組（0.1 g·kg-1）、補(bǔ)陽還五湯組（14.84 g·kg-1），每組15 只。采用氣管內(nèi)滴注博來霉素建立IPF 大鼠模型[14]，具體操作如下：腹腔注射2%戊巴比妥鈉（0.04 g·kg-1）麻醉大鼠后，從頸部正中線切開皮膚，分開肌肉，暴露氣管；用1 mL 注射器經(jīng)氣管軟骨環(huán)間隙向心端刺入，緩慢滴注以生理鹽水溶解的博來霉素（5 mg·kg-1）；滴注完畢后，迅速將鼠板直立并旋轉(zhuǎn)，使藥物均勻分布在大鼠兩側(cè)肺部；對照組采用同樣方式滴注同等體積的去離子水。術(shù)后次日開始，除對照組外的其他各組均每日施加限制食量和睡眠剝奪刺激因素，以加重大鼠氣虛血瘀狀態(tài)。每日白天隨機(jī)進(jìn)行睡眠剝奪4 h（反復(fù)敲擊鼠籠或更換鼠籠，以干擾其睡眠），20∶00 給予正常大鼠食量的2/3，連續(xù)干預(yù)28 d。大鼠于術(shù)后次日開始灌胃給藥[15]，補(bǔ)陽還五湯組給予補(bǔ)陽還五湯中藥煎液14.84 g·kg-1，尼達(dá)尼布組給予尼達(dá)尼布混懸液0.1 g·kg-1，對照組和模型組給予等體積去離子水10 mL·kg-1，每日1 次，連續(xù)28 d。

1.5 一般生物學(xué)表征比較觀察大鼠的精神狀態(tài)、皮毛色澤、攝食飲水、糞便、活動、呼吸等一般情況。重點觀察大鼠有無氣虛血瘀癥狀表現(xiàn)，如進(jìn)食量減少，體質(zhì)量降低，精神不振、喜蜷臥、喘息，活動性差，攻擊性、對抗性行為減少或消失，糞便軟或出現(xiàn)稀溏，毛發(fā)干燥無光澤，口唇、舌質(zhì)色絳或紫暗，尾尖、尾根等部位出現(xiàn)青斑或皮下瘀紫，眼球更鮮紅或暗紅等[16]。分別于造模術(shù)前和術(shù)后第28 天對大鼠氣虛血瘀癥狀進(jìn)行量化評分[17-20]，每只大鼠由4 名實驗人員獨立完成評分，最終取平均值納入統(tǒng)計分析。評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 大鼠氣虛血瘀證候評價量表Table 1 Evaluation scale of qi deficiency and blood stasis syndrome in rats

1.6 大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察將大鼠肺組織置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h 后，行乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，切片機(jī)制備厚4 μm 組織切片，行HE、Masson 常規(guī)染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察。HE 染色結(jié)果以Szapiel 評分體系評價肺泡炎性程度[14]，Masson 染色結(jié)果采用Ashcroft 評分體系評價大鼠肺組織纖維化情況[21]。分別在200 倍視野下，每組選取8 個視野進(jìn)行評價，具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表2、表3。

表2 Szapiel 評分體系Table 2 The Szapiel scoring system

表3 Ashcroft 評分體系Table 3 The Ashcroft scoring system

1.7 曠場實驗第0、7、14、28 天通過曠場實驗檢測大鼠行為學(xué)變化。實驗所用曠場箱底面為1 m×1 m的正方形，外圍高40 cm 擋板，形成一個無蓋箱體。曠場箱底面劃分為25 塊20 cm×20 cm 的正方形小格，貼近四壁的小格稱為“外周格”（共16 格），其余為“中央?yún)^(qū)”（共9 格），中央?yún)^(qū)最中心的1 個小格為“中心格”。實驗人員將大鼠輕輕放進(jìn)中心格，30 s 后開始計時，觀察大鼠在5 min 之內(nèi)的運(yùn)動軌跡、運(yùn)動總距離、進(jìn)入中央?yún)^(qū)次數(shù)及進(jìn)入中心格次數(shù)。

1.8 血液流變學(xué)檢測取大鼠股動脈血液2 mL 抗凝，常溫下靜置30 min 后，采用全自動血液流變儀檢測全血低切變率（10 s-1）、中切變率（60 s-1）、高切變率（150 s-1）、紅細(xì)胞壓積、聚集指數(shù)和電泳指數(shù)。

1.9 評估肺小動脈病理變化程度取“1.6”項下的HE 染色切片，在200 倍鏡下選取4 個視野，并以400 倍鏡放大。然后采用Image-pro Plus 6.0 圖像分析軟件計算肺小動脈管壁厚度、血管外徑、管腔面積、血管總面積，并計算出肺小動脈管壁厚度與血管外徑比值（WT%）、管壁面積與血管總面積比值（WA%），取其平均值進(jìn)行統(tǒng)計分析，以評價肺小動脈病理變化程度。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理方法采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用SNK-q檢驗；若所測數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布及方差齊性，則采用非參數(shù)檢驗中的多個獨立樣本的Kruskal-WallisH檢驗，兩兩比較則采用SNK-q檢驗；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)陽還五湯對IPF 大鼠一般生物學(xué)表征及氣虛血瘀證候評分的影響造模前各組大鼠精神狀態(tài)良好，行動活潑，反應(yīng)靈敏，皮毛光澤，攝食飲水、排便均正常，體質(zhì)量差異不明顯。造模后大鼠呼吸淺快，繼而呼吸急促，甚至出現(xiàn)哮鳴音，鼻頭、口唇和爪甲紫暗，毛發(fā)日漸色暗干枯，后期有大量毛發(fā)脫落。給藥組大鼠經(jīng)藥物干預(yù)后，攝食量有所增加，呼吸較為平穩(wěn)，鼻頭、口唇和爪甲出現(xiàn)輕度紫暗，毛發(fā)枯黃掉落等現(xiàn)象減少。氣虛血瘀證候評分結(jié)果見圖1。與對照組比較，模型組大鼠氣虛血瘀證候評分顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，尼達(dá)尼布和補(bǔ)陽還五湯組大鼠的氣虛血瘀證候評分顯著下降（P＜0.01）。與尼達(dá)尼布組比較，補(bǔ)陽還五湯組大鼠的氣虛血瘀證候評分明顯下降（P＜0.05）。結(jié)果表明，補(bǔ)陽還五湯能夠明顯改善IPF 大鼠的氣虛血瘀癥狀，且效果優(yōu)于尼達(dá)尼布。

圖1 補(bǔ)陽還五湯對特發(fā)性肺纖維化大鼠氣虛血瘀證候評分的影響（±s，n=15）Figure 1 Effect of Buyang Huanwu Decoction on the score of qi deficiency and blood stasis syndrome in rats with idiopathic pulmonary fibrosis（±s，n=15）

2.2 補(bǔ)陽還五湯對IPF 大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)變化的影響結(jié)果見圖2、圖3。對照組大鼠肺組織無明顯病理變化，結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁完整、連續(xù)。與對照組比較，模型組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡結(jié)構(gòu)有不同程度破壞，肺泡腔及肺間質(zhì)可見大量炎性細(xì)胞浸潤，肺間質(zhì)中可見明顯的成纖維細(xì)胞聚集和大量的膠原沉積，Szapiel 評分及Ashcroft 評分均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，尼達(dá)尼布組和補(bǔ)陽還五湯組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)相對完整，炎性細(xì)胞浸潤、膠原沉積和成纖維細(xì)胞聚積明顯減輕，Szapiel 評分及Ashcroft 評分顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果表明，補(bǔ)陽還五湯能夠改善IPF 大鼠肺組織的炎癥及纖維化程度。

圖2 補(bǔ)陽還五湯對特發(fā)性肺纖維化大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)變化的影響Figure 2 Effect of Buyang Huanwu Decoction on pathological changes of lung tissue in rats with idiopathic pulmonary fibrosis

圖3 補(bǔ)陽還五湯對特發(fā)性肺纖維化大鼠肺組織Szapiel 評分、Ashcroft評分的影響（±s，n=8）Figure 3Effect of Buyang Huanwu Decoction on Szapiel and Ashcroft scores of lung tissue in rats with idiopathic pulmonary fibrosis（±s，n=8）

2.3 補(bǔ)陽還五湯對IPF 大鼠行為學(xué)變化的影響結(jié)果見圖4。與對照組比較，模型組大鼠第28 天的運(yùn)動總距離、進(jìn)入中央?yún)^(qū)次數(shù)及中心格次數(shù)均顯著減少（P＜0.01）。與模型組比較，尼達(dá)尼布組及補(bǔ)陽還五湯組大鼠第28 天的運(yùn)動總距離、進(jìn)入中央?yún)^(qū)次數(shù)及中心格次數(shù)均顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）。與尼達(dá)尼布組比較， 補(bǔ)陽還五湯組大鼠第28 天的運(yùn)動總距離明顯增加（P＜0.05）。

圖4 補(bǔ)陽還五湯對特發(fā)性肺纖維化大鼠行為學(xué)變化的影響（±s，n=15）Figure 4 Effect of Buyang Huanwu Decoction on the behaviors of rats with idiopathic pulmonary fibrosis（±s，n=15）

2.4 補(bǔ)陽還五湯對IPF 大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)的影響結(jié)果見圖5。與對照組比較，模型組大鼠的全血低切、中切和高切黏度及紅細(xì)胞壓積、聚集指數(shù)、電泳指數(shù)均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，尼達(dá)尼布組及補(bǔ)陽還五湯組大鼠的全血低切、中切和高切黏度及紅細(xì)胞壓積、聚集指數(shù)、電泳指數(shù)均明顯下降（P＜0.05，P＜0.01）。

圖5 補(bǔ)陽還五湯對特發(fā)性肺纖維化大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)的影響（±s，n=15）Figure 5 Effect of Buyang Huanwu Decoction on hemorheology of rats with idiopathic pulmonary fibrosis（±s，n=15）

2.5 補(bǔ)陽還五湯對IPF 大鼠肺小動脈病理變化的影響結(jié)果見圖6。與對照組比較，模型組大鼠的肺小動脈管壁厚度、肺小動脈管壁厚度與血管外徑比值、管壁面積與血管總面積比值均顯著增加（P＜0.01），肺小動脈形態(tài)發(fā)生明顯改變，并且肺小動脈主要分布在肺間質(zhì)，圍繞著肺小動脈有較多的肺間質(zhì)增生。與模型組比較，尼達(dá)尼布組和補(bǔ)陽還五湯組大鼠的肺小動脈管壁厚度、肺小動脈管壁厚度與血管外徑比值、管壁面積與血管總面積比值均顯著降低（P＜0.01）。

圖6 補(bǔ)陽還五湯對特發(fā)性肺纖維化大鼠肺小動脈病理變化的影響（HE 染色；±s，n=4）Figure 6 Effect of Buyang Huanwu Decoction on pathological changes of pulmonary arterioles in rats with idiopathic pulmonary fibrosis（HE staining；±s，n=4）

3 討論

研究[22]表明，氣管內(nèi)一次性或重復(fù)注入博來霉素可復(fù)制與人肺間質(zhì)纖維化病理過程相似的動物模型，是目前研究特發(fā)性肺纖維化（IPF）的常用造模方法。氣管內(nèi)注入博來霉素導(dǎo)致大鼠呈現(xiàn)肺纖維化病理改變的同時，還存在典型的氣虛血瘀狀態(tài)[23]，本研究采用氣管內(nèi)滴注博來霉素結(jié)合限制食量及睡眠剝奪作為刺激因素[24-27]，構(gòu)建了氣虛血瘀IPF 大鼠證候模型。本研究結(jié)果表明，模型大鼠逐漸出現(xiàn)肺泡實變和肺間質(zhì)纖維化增生，Szapiel 評分、Ashcroft 評分均顯著升高，符合IPF 的主要病理特征[28-30]；大鼠喜蜷臥，大便質(zhì)稀量多，毛發(fā)日漸枯槁無光澤，活動探索時間下降，呼吸淺快或急促，甚至出現(xiàn)哮鳴音，表現(xiàn)出氣虛相關(guān)癥狀；鼻頭、口唇和尾尖紫暗，或有瘀斑，血液流變學(xué)指標(biāo)明顯改變，出現(xiàn)肺小動脈壁厚度增加、管腔變窄等病理變化，判斷為典型的血瘀之象；結(jié)合氣虛血瘀證候評分結(jié)果，表明IPF 大鼠出現(xiàn)明顯的氣虛血瘀狀態(tài)，模型復(fù)制成功。

補(bǔ)陽還五湯由生黃芪、當(dāng)歸尾、赤芍、川芎、桃仁、紅花、地龍組成，具有補(bǔ)氣活血、祛瘀通絡(luò)的功效，常用于氣虛血瘀型IPF 的治療。方中重用生黃芪為君藥，大補(bǔ)脾肺之氣，且寓培土生金之意，肺氣旺則助心行血之功益昌，血自流經(jīng)，瘀無由生，絡(luò)脈通，玄府暢。臣以當(dāng)歸尾，其長于活血，兼可養(yǎng)血，在活血化瘀同時尚可化生新血。赤芍清熱涼血，活血祛瘀，助歸尾行血之力，使肺臟絡(luò)活氣寧；川芎活血行氣，走而不守，行散血瘀力強(qiáng)；桃仁活血祛瘀以通肺絡(luò)，潤燥滑腸以行腑氣，腑氣得通則肺氣自降，一藥而兼三用，其功皆在保肺；紅花亦可活血暢通肺絡(luò)以利玄府。使藥地龍通經(jīng)活絡(luò)，可疏通微小血管之瘀。全方共奏益氣活血、通絡(luò)開玄之效，為益氣活血之代表方，亦契合IPF 氣虛血瘀之病機(jī)。其益氣活血通絡(luò)以使肺臟氣血得到充盈，臟腑組織得以充養(yǎng)；活血祛瘀開玄，又能促進(jìn)病理產(chǎn)物代謝，改善血液循環(huán)，從而緩解肺纖維化之“血瘀”表現(xiàn)。

本研究結(jié)果表明，補(bǔ)陽還五湯可顯著改善IPF大鼠肺組織病理變化以及氣虛血瘀狀態(tài)，可能與其降低全血黏度、抑制肺小動脈血管病變，從而增強(qiáng)肺功能有關(guān)。本研究從微觀血瘀角度觀察了補(bǔ)陽還五湯對IPF 大鼠的影響，可為臨床應(yīng)用益氣活血法治療IPF 提供參考，但更深層次的作用機(jī)制有待深入研究。