四物湯通過(guò)激活LKB1/AMPK通路對(duì)多囊卵巢綜合征大鼠的改善作用

劉亞敏，張明昊，王瑾瑾，白莉，王燦（. 河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046；. 河南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046）

多囊卵巢綜合征（Polycystic ovary syndrome，PCOS）是一種常見(jiàn)的婦科內(nèi)分泌疾病，常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)主要有排卵異常、高雄激素、卵巢呈現(xiàn)多囊樣改變及胰島素抵抗（Insulin resistance，IR）等[1-2]。根據(jù)其特征，中醫(yī)臨床常將PCOS 歸為“不孕”“經(jīng)遲”“閉經(jīng)”“崩漏”等范疇，普遍認(rèn)為其病因病機(jī)與腎虛、脾虛、肝郁、血瘀、沖任損傷、天癸失序、痰瘀胞宮等有關(guān)[3-4]。針對(duì)腎虛血瘀病機(jī)，多采用補(bǔ)腎活血化瘀的治法[5-9]。四物湯由當(dāng)歸、川芎、白芍、熟地黃四味中藥組成，是養(yǎng)血補(bǔ)血活血的經(jīng)典方[10-11]。臨床研究[12]表明，四物湯合五子衍宗方加減能夠改善PCOS 患者臨床癥狀，縮短月經(jīng)周期，提高妊娠率。卵巢顆粒細(xì)胞在維持卵巢功能方面有重要作用，四物湯能促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖，改善PCOS 大鼠卵巢功能[13-14]。研究[15]還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸水提物能通過(guò)改善高雄激素狀態(tài)、減輕炎癥反應(yīng)和提高抗氧化水平達(dá)到治療PCOS 的目的。四物湯可通過(guò)糾正PCOS 大鼠血清激素水平，一定程度上恢復(fù)下丘腦-垂體-卵巢性腺軸功能，改善卵巢排卵功能[16]。IR 是PCOS 的主要癥狀之一，而肝激酶B1（LKB1）/腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）通路與IR 密切相關(guān)[17]。研究[18]發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖能夠顯著改善PCOS 大鼠的IR，調(diào)節(jié)性激素水平，修復(fù)卵巢病理改變，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)LKB1/AMPK 通路有關(guān)。故本研究擬基于LKB1/AMPK 通路探討四物湯對(duì)PCOS 大鼠的治療作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物SPF 級(jí)健康雌性SD 大鼠，8 周齡，體質(zhì)量（190±10）g，購(gòu)自鄭州市惠濟(jì)區(qū)華興實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（豫）2019-0002。所有大鼠分籠飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)機(jī)能實(shí)驗(yàn)室，大鼠自由飲水、攝食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，批文號(hào)：DWLL202201010。

1.2 藥物及試劑四物湯由當(dāng)歸9 g、川芎6 g、白芍6 g、熟地黃12 g 組成，藥材購(gòu)自鄭州真心大藥房股份有限公司，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陳隨清教授鑒定均為正品。冷水浸泡藥材30 min 后，大火煮沸后轉(zhuǎn)小火煎煮30 min，共煎煮3 次，合并藥液并濃縮為1 g·mL-1四物湯水煎液。

來(lái)曲唑（批號(hào)：C12785740），上海麥克林生化科技有限公司；鹽酸二甲雙胍片（批號(hào)：20031702），上海壽如松藥業(yè)泌陽(yáng)制藥有限公司；達(dá)英-35（批號(hào)：KT062FL2），德國(guó)拜耳醫(yī)藥保健有限公司；伊紅染色液、蘇木素染色液（批號(hào)分別為：20211009、190805），福州飛凈生物科技有限公司；氨基甲酸乙酯（批號(hào)：20210902），天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；葡萄糖（Glu）、胰島素（Insulin）、雌二醇（Estrogen，E2）、睪酮（Testosterone，T）、促性腺激素釋放激素（Gonadotropin-releasing hormone，GnRH）、促黃體生成素（Luteinizing hormone，LH）、促卵泡素（Follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）試劑盒（批號(hào)分別為：F006-1-1、H203-1-2、H102-1、H090-1-2、H297、H206-1-2、H101-1-2），均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；DAB顯色試劑盒、兔SP 試劑盒（批號(hào)分別為：ZLI-9018、SP-9001），北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TriQuick 總RNA 提取試劑、cDNA 合成試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增試劑（批號(hào)分別為：R1100、G3330、G3320）及兔抗大鼠LKB1、AMPK抗體（批號(hào)分別為：GB111236、GB111919），武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 主要儀器BS110S 型電子天平，北京賽多利斯天平公司；RM2235 型石蠟切片機(jī)，德國(guó)Leica 公司；MR-96TB 型酶標(biāo)儀，騁克儀器（上海）有限公司；YD-6D 型組織包埋機(jī)、YD-A 型組織攤片機(jī)、YD-B 型組織烤片機(jī)，金華市科迪儀器設(shè)備有限公司；D3024R 型臺(tái)式高速冷凍型微量離心機(jī)，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司；Stepone plus 型熒光定量PCR 儀，美國(guó)ABI 公司；CX23 型光學(xué)顯微鏡，日本奧林巴斯公司。

1.4 模型復(fù)制將50 只雌性SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為正常組（10 只）、造模組（40 只）。正常組大鼠灌胃0.1% CMC-Na 溶液，造模組大鼠灌胃來(lái)曲唑混懸液，每日1 次，連續(xù)灌胃21 d。造模第16 天開(kāi)始進(jìn)行陰道涂片觀察，光鏡下可觀察到大鼠陰道上皮細(xì)胞持續(xù)角化者為造模成功[19-20]。

1.5 分組及給藥將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、達(dá)英-35+二甲雙胍組（0.2+230 mg·kg-1）和四物湯低、中、高劑量組（1.62、3.24、6.48 g·kg-1），每組10 只。四物湯、達(dá)英-35、二甲雙胍的成人（70 kg）用量分別為36 g、2 mg、2.55 g，根據(jù)人與大鼠劑量換算公式（S200g大鼠=0.018×S70kg人）計(jì)算，四物湯、達(dá)英-35、二甲雙胍的大鼠給藥劑量分別為3.24 g·kg-1、0.2 mg·kg-1、230 mg·kg-1。本實(shí)驗(yàn)以等效劑量3.24 g·kg-1為四物湯中劑量，以中劑量的0.5、2 倍作為四物湯低（1.62 g·kg-1）、高（6.48 g·kg-1）劑量；以0.2、230 mg·kg-1分別為達(dá)英-35、二甲雙胍給藥劑量。上述藥物均灌胃給藥（10 mL·kg-1），正常組和模型組大鼠灌胃等體積蒸餾水，每日1 次，連續(xù)30 d。

1.6 取材及處理各組大鼠禁食12 h 后，稱體質(zhì)量，腹腔注射1 g·kg-1氨基甲酸乙酯麻醉大鼠；腹主動(dòng)脈取血，以3 000 r·min-1（離心半徑=10 cm）離心10 min，取上清液，保存于-80 ℃冰箱。然后摘取卵巢，去除周?chē)M織，用生理鹽水洗滌；觀察卵巢外觀形態(tài)，用濾紙吸盡臟器表面液體后，稱定質(zhì)量；將卵巢組織分為2 份，1 份用4%多聚甲醛溶液固定后用于組織病理學(xué)分析，另1 份用液氮速凍后，-80 ℃保存。

1.7 ELISA 法檢測(cè)大鼠血清中血糖、胰島素、E2、T、GnRH、FSH、LH 水平取“1.6”項(xiàng)下制備的血清，室溫下解凍后，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作，檢測(cè)血糖、胰島素、E2、T、GnRH、FSH、LH 水平，并計(jì)算：IR 指數(shù)=空腹血糖值×空腹胰島素值/22.5。

1.8 大鼠卵巢系數(shù)測(cè)定計(jì)算：大鼠卵巢系數(shù)=卵巢質(zhì)量/體質(zhì)量，依據(jù)卵巢系數(shù)評(píng)價(jià)卵巢病變程度。

1.9 大鼠卵巢組織病理形態(tài)學(xué)觀察取“1.6”項(xiàng)下固定后的卵巢組織，經(jīng)梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片、HE 染色、梯度乙醇脫水、中性樹(shù)膠封片等步驟，在光學(xué)顯微鏡下觀察病理切片，并采集圖像。

1.10 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠卵巢組織中LKB1、AMPK 蛋白表達(dá)水平取“1.9”項(xiàng)下制備的卵巢組織切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、水化后，用檸檬酸鹽緩沖液熱修復(fù)8 min；待溫度降至室溫后依次用H2O2孵育10 min，PBS 浸洗，山羊血清孵育30 min；然后滴加LKB1（1∶2 000）、AMPK（1∶1 000）抗體，4 ℃下孵育過(guò)夜；次日，切片復(fù)溫至37 ℃后，滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗，孵育20 min；PBS 浸洗，DAB 顯色10 min后，自來(lái)水沖洗終止；然后蘇木素復(fù)染3 min，鹽酸乙醇分化，自來(lái)水再次沖洗；切片經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片后鏡檢。每只大鼠卵巢切片在400 倍鏡下隨機(jī)選取1 個(gè)視野，以棕黃色為陽(yáng)性染色；采用Image-Pro Plus 6.0 軟件測(cè)定每個(gè)視野中的積分光密度（Integrated Optical Density，IOD）值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.11 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)大鼠卵巢組織中LKB1、AMPK mRNA 表達(dá)水平根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)公布的大鼠LKB1（登錄號(hào)：NM001108069.1）、AMPK（登錄號(hào)：NM023991）、GAPDH（登錄號(hào)：NM017008.4）基因序列，采用DNAStar 軟件包的PrimerSelect 程序設(shè)計(jì)特異性引物，并由武漢塞維爾生物科技有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。取大鼠卵巢組織100 mg，加入1 mL TriQuick 試劑充分研磨勻漿后提取總RNA，檢測(cè)RNA 濃度及純度。在20 μL反應(yīng)體系內(nèi)合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄條件為：25 ℃、5 min，42 ℃、30 min，85 ℃、5 s；再以2 μL cDNA 為模板，加入靶基因上下游引物于15 μL 反應(yīng)體系內(nèi)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)擴(kuò)增曲線及熔解曲線判斷PCR 反應(yīng)特異性。結(jié)果以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 PCR 引物序列Table 1 Primer sequences for PCR

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計(jì)量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD 法，方差不齊者采用Dunnett’s 檢驗(yàn)；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四物湯對(duì)PCOS 大鼠血糖、胰島素水平及IR指數(shù)的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。與正常組比較，模型組大鼠的血糖、胰島素水平及IR 指數(shù)明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，達(dá)英-35+二甲雙胍組和四物湯低、中、高劑量組大鼠的血糖、胰島素水平及IR指數(shù)明顯降低（P＜0.05）。結(jié)果表明，四物湯能降低PCOS 大鼠的血糖、胰島素水平。

圖1 四物湯對(duì)多囊卵巢綜合征大鼠血糖、胰島素水平和胰島素抵抗指數(shù)的影響（±s，n=10）Figure 1 The effect of Siwu Decoction on the levels of blood glucose and insulin and insulin resistance index in polycystic ovary syndrome rats（±s，n=10）

2.2 四物湯對(duì)PCOS 大鼠血清E2、T、GnRH、FSH、LH 水平的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。與正常組比較，模型組大鼠血清中T、GnRH、LH 水平明顯升高（P＜0.05），E2、FSH 水平明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，達(dá)英-35+二甲雙胍組和四物湯低、中、高劑量組大鼠血清中GnRH、LH 水平明顯降低（P＜0.05），F(xiàn)SH 水平明顯升高（P＜0.05）；達(dá)英-35+二甲雙胍組和四物湯中劑量組大鼠血清中E2水平明顯升高（P＜0.05），T 水平明顯降低（P＜0.05）。結(jié)果表明，四物湯能升高PCOS 大鼠E2、FSH 水平，降低T、GnRH、LH 水平。

圖2 四物湯對(duì)多囊卵巢綜合征大鼠血清E2、T、GnRH、FSH、LH 水平的影響（±s，n=10）Figure 2 The effect of Siwu Decoction on the levels of E2，T，GnRH，F(xiàn)SH and LH in polycystic ovary syndrome rats（±s，n=10）

2.3 四物湯對(duì)PCOS 大鼠卵巢系數(shù)的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。與正常組比較，模型組大鼠的卵巢系數(shù)明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，達(dá)英-35+二甲雙胍組和四物湯低、中、高劑量組大鼠的卵巢系數(shù)明顯降低（P＜0.05）。結(jié)果表明，四物湯能降低PCOS 大鼠的卵巢系數(shù)。

圖3 四物湯對(duì)多囊卵巢綜合征大鼠卵巢系數(shù)的影響（±s，n=10）Figure 3 The effect of Siwu Decoction on ovarian coefficient in polycystic ovary syndrome rats（±s，n=10）

2.4 四物湯對(duì)PCOS 大鼠卵巢組織病理變化的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。正常組大鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)完整，各級(jí)卵泡數(shù)量較多，發(fā)育良好，存在正常黃體和白體。模型組大鼠卵巢皮質(zhì)膠原化，閉鎖卵泡及無(wú)卵丘的囊性卵泡數(shù)量增多，卵泡顆粒細(xì)胞層數(shù)少。達(dá)英-35+二甲雙胍組大鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)基本完整，各級(jí)卵泡形態(tài)完好，放射冠清晰，未見(jiàn)卵泡囊性改變，卵泡顆粒細(xì)胞層厚度增加，存在少量黃體和白體。四物湯低劑量組大鼠卵巢組織中可見(jiàn)較多的閉鎖卵泡和無(wú)卵丘囊性卵泡，卵泡顆粒細(xì)胞層數(shù)少；四物湯中、高劑量組大鼠卵巢組織內(nèi)含有各級(jí)卵泡，數(shù)量比例正常，顆粒細(xì)胞層厚度增加，放射冠清晰，存在少量黃體和白體，未見(jiàn)卵泡囊性改變。

圖4 四物湯對(duì)多囊卵巢綜合征大鼠卵巢組織病理變化的影響（HE 染色，×100）Figure 4 The effect of Siwu Decoction on pathological morphology micrograph of ovaries in polycystic ovary syndrome rats（HE staining，×100）

2.5 四物湯對(duì)PCOS 大鼠卵巢組織LKB1、AMPK

蛋白表達(dá)水平的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。與正常組比較，模型組大鼠卵巢組織中LKB1、AMPK 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，達(dá)英-35+二甲雙胍組和四物湯低、中、高劑量組大鼠卵巢組織中LKB1、AMPK 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。結(jié)果表明，四物湯能上調(diào)PCOS 大鼠卵巢組織中的LKB1、AMPK 蛋白表達(dá)。

圖5 四物湯對(duì)多囊卵巢綜合征大鼠卵巢組織LKB1、AMPK 蛋白表達(dá)水平的影響（免疫組化，×400；±s，n=10）Figure 5 The effect of Siwu Decoction on the protein expression levels of LKB1 and AMPK in polycystic ovary syndrome rats（IHC，×400；±s，n=10）

2.6 四物湯對(duì)PCOS 大鼠卵巢組織LKB1、AMPK mRNA 表達(dá)水平的影響結(jié)果見(jiàn)圖6。與正常組比較，模型組大鼠卵巢組織中LKB1、AMPK mRNA 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。與模型組比較，達(dá)英-35+二甲雙胍組和四物湯低、中、高劑量組大鼠卵巢組織中LKB1、AMPK mRNA 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。結(jié)果表明，四物湯能上調(diào)PCOS 大鼠卵巢組織中LKB1、AMPK mRNA 表達(dá)。

圖6 四物湯對(duì)多囊卵巢綜合征大鼠卵巢組織LKB1、AMPK mRNA 表達(dá)水平的影響（±s，n=10）Figure 6 The effect of Siwu Decoction on the mRNA levels of LKB1 and AMPK in polycystic ovary syndrome rats（±s，n=10）

3 討論

多囊卵巢綜合征（PCOS）是婦科常見(jiàn)的生殖功能障礙伴有糖代謝異常的內(nèi)分泌紊亂綜合征。其常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)及主要病理特征有持續(xù)排卵異常、月經(jīng)紊亂、高雄激素、胰島素抵抗（IR）、卵巢呈現(xiàn)多囊樣改變、閉鎖卵泡及無(wú)卵丘的囊性卵泡數(shù)量增多、卵泡顆粒細(xì)胞層數(shù)及成熟卵泡減少[21]。目前研究PCOS 的常用動(dòng)物模型的造模方法有類(lèi)固醇造模法、雄激素造模法、來(lái)曲唑造模法等。其中來(lái)曲唑造模法應(yīng)用較為廣泛，多項(xiàng)研究[22-23]將來(lái)曲唑造模法與其他造模法進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不管是從卵巢局部解剖學(xué)、形態(tài)學(xué)方面看，還是從性激素、蛋白表達(dá)水平方面比較，來(lái)曲唑造模法構(gòu)建的PCOS 動(dòng)物模型都更接近PCOS 的典型臨床特征，且操作簡(jiǎn)單，對(duì)動(dòng)物創(chuàng)傷性小，是研究PCOS 較理想的動(dòng)物模型[24]。本研究結(jié)果顯示，PCOS 模型大鼠卵巢稍增大且出現(xiàn)多囊性改變，血清T、GnRH 及LH 水平明顯升高，E2、FSH 水平明顯降低，且血糖、胰島素水平及IR指數(shù)明顯升高，表明造模成功。達(dá)英-35（炔雌醇環(huán)丙孕酮片）對(duì)PCOS 所致的高雄激素等癥狀有改善作用[25]，二甲雙胍可以改善IR[26]，臨床上常聯(lián)合使用達(dá)英-35 和二甲雙胍治療PCOS[27-28]。因此，本研究采用達(dá)英-35 聯(lián)合二甲雙胍作為陽(yáng)性對(duì)照藥。

本研究結(jié)果顯示，四物湯能增加PCOS 大鼠卵巢組織內(nèi)各級(jí)卵泡數(shù)量，使囊性卵泡數(shù)量減少或消失，并且使顆粒細(xì)胞層增厚。PCOS 常常伴有卵泡排出障礙，導(dǎo)致卵巢增生[29]，而四物湯可以降低PCOS大鼠卵巢系數(shù)，緩解其增生進(jìn)程。LH、FSH、E2和相應(yīng)激素受體一起作用于卵巢，調(diào)控雌性機(jī)體的卵泡發(fā)育和排卵過(guò)程[30-31]。LH、FSH 的分泌受GnRH 的調(diào)控[32]。PCOS 患者分泌的GnRH 明顯增多，引起LH水平升高、FSH 水平下降，而LH 水平升高可刺激卵泡膜細(xì)胞生成大量T，而FSH 水平下降則會(huì)影響T向雌激素轉(zhuǎn)化的進(jìn)程，從而導(dǎo)致卵巢內(nèi)高雄激素，妨礙優(yōu)勢(shì)卵泡的發(fā)育和排出，進(jìn)而形成卵巢多囊樣改變[33-34]。同時(shí)，PCOS 患者分泌E2減少，也會(huì)導(dǎo)致卵泡閉鎖和排卵障礙[35-37]。本研究結(jié)果顯示，四物湯能升高PCOS 大鼠E2、FSH 水平，降低T、GnRH、LH 水平，表明四物湯對(duì)PCOS 大鼠的性激素分泌水平有一定的改善作用。

研究[38-40]發(fā)現(xiàn)，PCOS 常伴有IR，而LKB1/AMPK信號(hào)通路與IR 的產(chǎn)生相關(guān)。LKB1、AMPK 為真核細(xì)胞中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，廣泛表達(dá)于各種組織。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)一磷酸腺苷（AMP）/三磷酸腺苷（ATP）比值升高時(shí)，AMP 與AMPK-γ 調(diào)節(jié)亞基結(jié)合，磷酸化LKB1 為p-LKB1，p-LKB1 又與AMPK-α 亞基上的Thr172 位點(diǎn)結(jié)合，磷酸化該位點(diǎn)為p-AMPK，進(jìn)而開(kāi)啟分解代謝途徑以升高ATP 水平，同時(shí)關(guān)閉合成代謝途徑以降低ATP 消耗，維持能量平衡[41-42]。有研究[43-44]表明，LKB1、AMPK 蛋白表達(dá)水平降低是IR 發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而有氧運(yùn)動(dòng)與膳食干預(yù)則能提高LKB1、AMPK 蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而改善IR。因此，推測(cè)PCOS 引起的IR 與LKB1/AMPK 通路的下調(diào)有關(guān)。研究[45]還發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可以激活A(yù)MPK 通路，使糖酵解速度加快，提高胰島素敏感性。本研究結(jié)果顯示，PCOS 大鼠卵巢組織中LKB1、AMPK蛋白及mRNA 表達(dá)水平明顯下降，即LKB1/AMPK通路被抑制，而四物湯可以明顯上調(diào)LKB1、AMPK蛋白及mRNA 表達(dá)水平，因此推測(cè)四物湯可能通過(guò)激活LKB1/AMPK 通路來(lái)發(fā)揮其對(duì)PCOS 的改善作用。

綜上所述，四物湯對(duì)PCOS 大鼠性激素水平、IR及卵巢囊性改變具有明顯改善作用，其機(jī)制可能與激活LKB1/AMPK 通路有關(guān)。本研究結(jié)果可為四物湯在PCOS 治療方面的深入開(kāi)發(fā)利用提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。