腺苷A2a受體激動(dòng)劑對(duì)膿毒癥急性腎損傷中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)節(jié)作用

王靜靜, 巴音查汗·博然衣, 郭峻氚

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科, 新疆 烏魯木齊 830000)

膿毒癥是一種復(fù)雜的臨床綜合征,由宿主對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)引起,會(huì)引起全身炎癥反應(yīng),并導(dǎo)致廣泛的組織損傷和多器官功能障礙[1]。急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)是膿毒癥進(jìn)展過(guò)程中最常見(jiàn)和最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,據(jù)統(tǒng)計(jì),高達(dá)60%的膿毒癥病例并發(fā)AKI,這不僅易發(fā)展為慢性腎臟病,并大大增加了患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)[2]。然而,膿毒癥AKI致病機(jī)制復(fù)雜,發(fā)生發(fā)展涉及多種因素,目前尚無(wú)有效預(yù)防或治療藥物,因此,尋求該疾病的有效治療手段十分關(guān)鍵。腺苷是一種內(nèi)源性核苷,通過(guò)G蛋白偶聯(lián)腺苷受體發(fā)出信號(hào)來(lái)控制細(xì)胞功能。目前已確定腺苷受體四種亞型:A1、A2a、A2b、A3,不同受體在各種病理生理?xiàng)l件下發(fā)揮重要作用。其中,腺苷A2a受體對(duì)腺苷具有很高的親和力,可在肥大細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、T細(xì)胞和血小板上表達(dá),先前已有研究表明,當(dāng)該受體被激活后可以抑制T細(xì)胞增殖和促炎因子的產(chǎn)生,有助于抗炎因子的合成,從而在多種炎癥性疾病中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)功能,因而在膿毒癥治療中具有很大潛力。但腺苷A2a受體在膿毒癥中的研究尚處于臨床前研究階段,關(guān)于膿毒癥相關(guān)AKI的研究報(bào)道也很少。CGS21680是腺苷A2a受體的高效激動(dòng)劑,已被證實(shí)能夠抑制多種炎性細(xì)胞的聚集及其介質(zhì)釋放[3]?；诖?本研究通過(guò)構(gòu)建膿毒癥誘導(dǎo)AKI大鼠模型,探討腺苷A2a受體激動(dòng)劑CGS21680能否減輕大鼠腎損傷,并對(duì)作用機(jī)制進(jìn)行了初步探究?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)大鼠:40只健康SD大鼠,雄性,體質(zhì)量180g～230g,購(gòu)于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。大鼠在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng),溫度控制在23℃～25℃,相對(duì)濕度為55%,12h光暗循環(huán),自由飲食、飲水,適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2主要試劑:腺苷A2a受體激動(dòng)劑CGS21680(美國(guó)Sigma Aldrich公司),水合氯醛(北京康瑞納生物公司),封閉山羊血清原液(上海酶研生物科技公司),SCr、BUN、KIM-1和NGAL檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所),HE染色液和PAS染色液(北京凱詩(shī)源生物公司),TUNEL細(xì)胞凋亡染色試劑盒、DAPI染料、RIPA裂解液及ECL試劑(上海碧云天生物研究所),DAB顯色試劑盒(北京普非生物科技公司),BCA蛋白檢測(cè)試劑盒(北京康為世紀(jì)公司),辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG與兔抗GRP78、CHOP、MCP-1抗體(英國(guó)Abcam公司),兔抗GAPDH、XBP1、PERK、p-eIF2α及eIF2α抗體(美國(guó)Santa Cruz 公司)。

1.3方 法

1.3.1動(dòng)物分組、造模及給藥:將40只SD大鼠按數(shù)字隨機(jī)表法分為對(duì)照組、腺苷A2a受體激動(dòng)劑(CGS21680)組、模型(AKI)組、腺苷A2a受體激動(dòng)劑干預(yù)(CGS21680+AKI)組,每組10只。除對(duì)照組外,其余3組大鼠均建立AKI模型,術(shù)前1h,CGS21680組和CGS21680+AKI組腹腔注射CGS21680(2.1mg/kg),對(duì)照組和AKI組腹腔注射等量生理鹽水。AKI模型制備參考文獻(xiàn)[4]方法操作,對(duì)照組大鼠僅開(kāi)腹分離,不結(jié)扎、不穿孔。

1.3.2血清生化指標(biāo)測(cè)定:1周后麻醉各組大鼠,尾靜脈取血,室溫靜置2h,置于低溫離心機(jī)通過(guò)3000 r/min離心15min,收集上清液,保存于-20℃?zhèn)溆?。全自?dòng)生化分析儀測(cè)定血清SCr和BUN水平,ELISA法檢測(cè)血清KIM-1和NGAL水平,實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作。

1.3.3HE染色:各組大鼠采血結(jié)束后,解剖摘取腎臟組織,生理鹽水清洗干凈,4%多聚甲醛浸泡固定過(guò)夜。修剪固定好的組織,常規(guī)石蠟包埋,脫水與透明,切成5μm厚的組織切片,進(jìn)行HE染色。染色后,中性樹(shù)膠封片,通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察腎臟病理變化并采集圖像。

1.3.4PAS染色:取制備的各組大鼠腎組織石蠟切片進(jìn)行脫蠟水化,置于阿利新藍(lán)液中浸泡10min,流水沖洗,加入過(guò)碘酸處理5min,雪夫希夫染色10min,流水再次沖洗,蘇木素復(fù)染,1%酸性乙醇分化,加入氨水返藍(lán),流水沖洗,脫水與透明,中性樹(shù)膠封片,在光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟病理變化并采集圖像。

1.3.5TUNEL染色:各組大鼠腎組織石蠟切片經(jīng)過(guò)脫蠟水化后,室溫下加入20μg/mL蛋白酶K作用15min, PBS沖洗,將蛋白酶K清洗干凈。吸取適量TUNEL工作液滴于切片上,置于37℃濕盒內(nèi)染色1h。室溫避光環(huán)境下,滴加DAPI染核10min,脫水與透明。用抗熒光淬滅封片液封片,通過(guò)熒光顯微鏡觀察并采集圖像,鏡下TUNEL陽(yáng)性即凋亡細(xì)胞呈綠色熒光,隨機(jī)選擇6個(gè)視野,統(tǒng)計(jì)該視野下TUNEL陽(yáng)性數(shù)目與總細(xì)胞數(shù)目,兩者之比記為T(mén)UNEL陽(yáng)性細(xì)胞率(%)。

1.3.6免疫組化染色:各組大鼠腎組織石蠟切片經(jīng)脫蠟水化、檸檬酸鹽緩沖液加熱修復(fù),3%H2O2孵育10min,以5%山羊血清作封閉液室溫處理2h。將切片分別與兔抗GRP78、CHOP、MCP-1多克隆抗體(均按1∶500稀釋)放于4℃冰箱內(nèi)共孵育過(guò)夜。次日,PBS沖洗,加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(按1∶1000稀釋),室溫下再孵育1h,PBS沖洗后,根據(jù)DAB試劑盒顯色,蘇木精復(fù)染,滴加中性樹(shù)膠進(jìn)行封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖像,鏡下胞質(zhì)有黃棕色至棕色顆粒沉積即為陽(yáng)性,隨機(jī)選擇6個(gè)視野,Image J軟件測(cè)量蛋白陽(yáng)性表達(dá)面積占比。

1.3.7Western blot法:RIPA裂解液提取各組大鼠腎組織總蛋白,BCA法測(cè)定樣品濃度。以蛋白質(zhì)量為50μg計(jì)算各蛋白體積,加入緩沖液后加熱煮沸,使蛋白變性。配置10%聚丙烯酰胺凝膠,將變性后的蛋白上樣至膠孔,固定電泳裝置,恒壓電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)至PVDF膜。加入5%山羊血清室溫封閉1h,將印跡與稀釋后的一抗XBP1、PERK、p-eIF2α、eIF2α、MCP-1(1∶1000)置于4℃搖床共孵育過(guò)夜。TBST洗膜,加入對(duì)應(yīng)稀釋的二抗(1∶5000),室溫下孵育1h,TBST再次清洗,ECL顯影,凝膠成像儀進(jìn)行可視化,以GAPDH作為內(nèi)參蛋白,Image J軟件分析條帶灰度值,蛋白相對(duì)表達(dá)量以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值之比來(lái)表示。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠血清生化指標(biāo)水平比較:與對(duì)照組比較,CGS21680組大鼠血清SCr、BUN、KIM-1及NGAL水平未發(fā)生統(tǒng)計(jì)學(xué)變化(P>0.05),AKI組SCr、BUN、KIM-1及NGAL水平均較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)。與AKI組比較,CGS21680+AKI組SCr、BUN、KIM-1及NGAL水平均顯著降低(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清SCr BUN KIM-1及NGAL水平比較

2.2各組大鼠腎組織病理學(xué)變化觀察:HE染色與PAS染色結(jié)果顯示,對(duì)照組和CGS21680組的大鼠腎組織未見(jiàn)病理學(xué)改變,組織結(jié)構(gòu)完整。AKI組大鼠腎小管擴(kuò)張、變性,腎間質(zhì)加寬,腎小球水腫,基底膜明顯增厚,有核細(xì)胞數(shù)目增加。CGS21680+AKI組大鼠腎損傷程度較AKI組明顯減輕。見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 各組大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)變化觀察(HE,×100)

圖2 各組大鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)變化觀察(PAS,×100)

2.3各組大鼠腎組織內(nèi)細(xì)胞凋亡比較:TUNEL染色統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,對(duì)照組和CGS21680組的大鼠腎組織內(nèi)TUNEL陽(yáng)性率之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),AKI組TUNEL陽(yáng)性率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。CGS21680+AKI組TUNEL陽(yáng)性率則又顯著低于AKI組(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡檢測(cè)(TUNEL,×100)

2.4各組大鼠腎組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平變化比較:免疫組化染色結(jié)果顯示,GRP78與CHO陽(yáng)性表達(dá)主要分布于細(xì)胞漿,與對(duì)照組比較,CGS21680組大鼠腎組織GRP78、CHOP陽(yáng)性表達(dá)比例未發(fā)生統(tǒng)計(jì)學(xué)變化(P>0.05),AKI組GRP78、CHOP陽(yáng)性表達(dá)比例均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。與AKI組比較,CGS21680+AKI組GRP78、CHOP陽(yáng)性表達(dá)比例均顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 各組大鼠腎組織GRP78與CHOP陽(yáng)性表達(dá)檢測(cè)(免疫組化,×100)

Western blot測(cè)定結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,CGS21680組大鼠腎組織XBP1、PERK蛋白相對(duì)表達(dá)量及eIF2α/p-eIF2α比值未發(fā)生統(tǒng)計(jì)學(xué)變化(P>0.05),AKI組XBP1、PERK蛋白相對(duì)表達(dá)量及eIF2α/p-eIF2α比值均顯著上調(diào)(P<0.05)。與AKI組比較,CGS21680+AKI組XBP1、PERK蛋白相對(duì)表達(dá)量及eIF2α/p-eIF2α比值顯著下調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

圖5 各組大鼠腎組織XBP1、PERK、p-eIF2α及eIF2α蛋白表達(dá)水平比較

2.5各組大鼠腎組織MCP-1表達(dá)比較:免疫組化染色結(jié)果顯示,MCP-1陽(yáng)性表達(dá)主要分布于細(xì)胞漿,與對(duì)照組比較,CGS21680組大鼠腎組織MCP-1陽(yáng)性表達(dá)比例未發(fā)生統(tǒng)計(jì)學(xué)變化(P>0.05),AKI組MCP-1陽(yáng)性表達(dá)比例均顯著上調(diào)(P<0.05)。與AKI組比較,CGS21680+AKI組MCP-1陽(yáng)性表達(dá)比例均顯著下調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖6。

圖6 各組大鼠腎組織MCP-1陽(yáng)性表達(dá)檢測(cè)(免疫組化,×100)

Western blot測(cè)定結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,CGS21680組大鼠腎組織MCP-1蛋白相對(duì)表達(dá)量未發(fā)生統(tǒng)計(jì)學(xué)變化(P>0.05),AKI組MCP-1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)。與AKI組比較,CGS21680+AKI組MCP-1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖7。

圖7 各組大鼠腎組織MCP-1蛋白表達(dá)檢測(cè)

3 討 論

目前,腺苷A2a受體激動(dòng)劑作為一種新型炎癥調(diào)節(jié)劑,在多種疾病中抗炎效果十分突出,在自身免疫性疾病、心血管疾病和癌癥中均發(fā)揮作用。研究表明,在大鼠脛骨骨折模型中局部植入含有腺苷A2a受體激動(dòng)劑CGS21680的纖維蛋白凝膠后,降低了骨折大鼠血液和骨折區(qū)域的IL-6水平,調(diào)節(jié)Treg/Th17細(xì)胞趨于平衡,從而促進(jìn)骨折愈合;在腦缺血模型沙鼠給予腺苷A2a受體激動(dòng)劑聚脫氧核糖核苷酸(polydeoxyribonucleotide,PDRN)處理后,抑制了促炎細(xì)胞因子的分泌和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號(hào)途徑的激活,改善神經(jīng)元細(xì)胞存活,并防止腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭卸唐谟洃浀南陆?此外,腺苷A2a受體激動(dòng)劑CGS21680可減輕缺血再灌注介導(dǎo)的組織損傷,并改善同種異體原位肝移植的功能恢復(fù),提高移植動(dòng)物模型的存活率[5,6]。本研究結(jié)果顯示,腺苷A2a受體激動(dòng)劑CGS21680處理下的膿毒癥AKI大鼠腎組織損傷明顯減輕,血清中腎功能損害相關(guān)指標(biāo)SCr、BUN、KIM-1、NGAL水平均降低,腎組織內(nèi)細(xì)胞凋亡減少。由此說(shuō)明,腺苷A2a受體激動(dòng)劑CGS21680對(duì)膿毒癥誘導(dǎo)的AKI大鼠發(fā)揮保護(hù)作用。

在病理?xiàng)l件下,細(xì)胞可能會(huì)失去蛋白質(zhì)平衡,導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊和錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)積累,從而觸發(fā)未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。在輕度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下,細(xì)胞激活未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)以恢復(fù)蛋白質(zhì)平衡,促進(jìn)細(xì)胞存活并增強(qiáng)細(xì)胞承受應(yīng)激的能力。然而,一旦內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過(guò)度,未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)的適應(yīng)能力就會(huì)不堪重負(fù),導(dǎo)致細(xì)胞凋亡程序啟動(dòng),來(lái)消除不可逆的受損細(xì)胞,進(jìn)而造成組織損傷。多項(xiàng)研究證實(shí),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與膿毒癥過(guò)程并導(dǎo)致腎組織損傷,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物GRP78和CHOP在膿毒癥AKI腎組織中表達(dá)升高,并后續(xù)誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡[7]。提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是膿毒癥AKI臨床防治的潛在新靶點(diǎn)。XBP1是一種獨(dú)特的堿性區(qū)域亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子,其活性形式是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)平衡破壞和未折疊蛋白反應(yīng)激活時(shí)的非常規(guī)剪接反應(yīng)產(chǎn)生的,也是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的關(guān)鍵引發(fā)劑[8]。PERK是一種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的I型跨膜蛋白,在ER應(yīng)激條件下,PERK在與腔內(nèi)伴侶GRP78解離后激活,激活的PERK通過(guò)使起始因子eIF2α失活來(lái)抑制蛋白質(zhì)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的翻譯,導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成減少,這種抑制作用有助于通過(guò)減少錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白質(zhì)進(jìn)一步流入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來(lái)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[9]。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)過(guò)腺苷A2a受體激動(dòng)劑CGS21680處理的膿毒癥AKI大鼠腎組織中GRP78和CHOP蛋白表達(dá)下降,同時(shí),腎組織內(nèi)XBP1、PERK蛋白表達(dá)及eIF2α/p-eIF2α比值也下調(diào)。這一研究結(jié)果說(shuō)明了腺苷A2a受體激動(dòng)劑CGS21680能夠抑制膿毒癥AKI模型大鼠機(jī)體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,發(fā)揮腎組織保護(hù)作用。

單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)也稱為趨化因子配體2,通過(guò)將單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等募集到損傷組織或感染部位發(fā)揮促炎作用。已有研究表明,MCP-1在膿毒癥AKI患者血清中明顯偏高,不僅與疾病嚴(yán)重程度顯著相關(guān),還與機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)密切相關(guān),因而在膿毒癥AKI病理機(jī)制中至關(guān)重要,推測(cè)其可能成為膿毒癥AKI診療的靶點(diǎn)[10]。本研究發(fā)現(xiàn),膿毒癥AKI大鼠腎組織中MCP-1表達(dá)也升高,而經(jīng)過(guò)腺苷A2a受體激動(dòng)劑CGS21680處理的膿毒癥AKI大鼠腎組織中MCP-1表達(dá)明顯降低,由此提示,腺苷A2a受體激動(dòng)劑CGS21680對(duì)膿毒癥AKI模型大鼠的保護(hù)作用是通過(guò)降低MCP-1表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)的,這可能是腺苷A2a受體激動(dòng)劑的作用機(jī)制之一。

綜上所述,腺苷A2a受體激動(dòng)劑CGS21680能夠顯著減輕膿毒癥AKI模型大鼠的腎損傷,機(jī)制可能與其抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過(guò)度應(yīng)激、降低MCP-1表達(dá)水平有關(guān)。但腺苷A2a受體調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的藥理作用多樣,是否涉及其他作用機(jī)制仍需進(jìn)一步進(jìn)行探討,以期為該藥物的臨床應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。