高山兀鷲拉奎拉棒狀桿菌和腸球菌屬的分離鑒定

粟玉剛　李向勇　李蜜　劉彬　彭叢笑　夏青珍　劉友瓊

摘 要：從動物園發(fā)病死亡的高山兀鷲的肝臟、心臟血液、胰臟中分離到2種菌株。經(jīng)形態(tài)學觀察、革蘭氏染色和分子生物學鑒定最終確定2種菌株分別為拉奎拉棒狀桿菌和腸球菌屬。本次試驗結果為高山兀鷲生物學特性研究提供了技術支撐。

關鍵詞：高山兀鷲、拉奎拉棒狀桿菌、腸球菌屬、分離鑒定

中圖分類號：S858.39? ? ?文獻標識碼：B 文章編號：1673-1085（2023）07-0054-04

高山兀鷲（Gypshimalayensis），又名喜馬拉雅兀鷲，鷹形目（Accipitriformes）、鷹科（Accipitridae）[1-2]、禿鷲亞科（Aegypiinae），屬于大型猛禽，國家二級保護鳥類，被列入瀕危野生動植物國際貿易公約（CITES公約）附錄Ⅱ限制貿易鳥類。高山兀鷲集中分布于我國的西部高山、高原地區(qū)，為不易歸類的分布型鳥，生活在海拔2 500～4 800 m區(qū)域。資料顯示生活在珠穆朗瑪峰自然保護區(qū)的高山兀鷲，秋季沿橫斷山脈向南遷徙至云南西部，或越過喜馬拉雅山脈到印度、緬甸等地越冬[3-4]。高山兀鷲體長120～150 cm，體重可達8～12 kg，于高空翱翔，飛行狀態(tài)時翼尖而長，略向上揚[5]，有時結小群活動，或停棲于多巖峭壁，以腐肉為食，對維持生態(tài)系統(tǒng)平衡有重要意義。本研究從動物園一例死亡的高山兀鷲的肝臟、心臟血液、胰臟等病料分離出細菌，經(jīng)革蘭氏染色進行形態(tài)學觀察，并通過分子生物學檢測鑒定分離菌為拉奎拉棒狀桿菌和腸球菌屬，從而為高山兀鷲的疾病防治和動物園飼養(yǎng)提供理論依據(jù)和有益參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 長沙生態(tài)動物園一例死亡的高山兀鷲采集其肝臟、心臟血液、胰臟等臟器組織作為病料樣品。

1.1.2 主要試劑 血瓊脂培養(yǎng)基購自鄭州貝瑞特生物技術有限公司，藥敏紙片套裝購自常德比克曼生物科技有限公司，DL5000 marker購自北京索萊寶科技有限公司，Premix Taq? （TaKaRa Taq? Version 2.0）、Nuclease-free Water購自TakaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離與革蘭氏染色鑒定 將死亡的高山兀鷲肝臟、心臟血液、胰臟等進行組織處理后嚴格按照無菌操作，用高溫灼燒后的接種環(huán)蘸取少量病變組織液在血瓊脂培養(yǎng)基上進行劃線接種，在37℃恒溫箱培養(yǎng)18 h后，分別挑取不同形態(tài)的單菌落并編號為1號、2號菌，通過平板劃線法再次接種于血瓊脂平板進行純化，挑取少量純化后的單菌落適當稀釋后進行革蘭氏染色鑒定。

1.2.2 細菌16S rDNA基因序列擴增 用無菌接種環(huán)分別挑取不同形態(tài)的純化后的1號、2號菌，接種于150 ?L滅菌超純水中混勻，按照DNA提取試劑盒提取細菌基因組DNA，根據(jù)先前研究[6]合成用于PCR擴增細菌16S rRNA基因序列的通用引物，16S rRNA-27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；16S rRNA-1492R：5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3'，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反應總體系25 ?L，包括Premix Taq? 12.5 ?L，上下游引物各0.5 ?L，DNA模板1.0 ?L，Nuclease-free Water 10.5 ?L。反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，共35個循環(huán)，最后72℃再延伸5 min。PCR反應結束后取5.0 ?L PCR產(chǎn)物進行瓊脂凝膠電泳，觀察結果。將擴增的陽性PCR產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司測序，將測序回來的結果使用DNAMAN拼接好后，提交至NCBI進行Blast比對，同源性≥99%可以定義到種的水平；若同源性在97.0%～98.9%，可以定義到屬的水平；若同源性＜97.0%，則定義為科水平，鑒定標準按照同源性≥97.0%判定[7]。

2 結果

2.1 細菌形態(tài)及革蘭氏染色觀察結果

接種病料組織液后的血瓊脂培養(yǎng)基，經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)表面長有兩種形態(tài)不同的菌落，1號菌落為圓形、灰白，呈水滴狀，革蘭氏陽性菌，鏡檢顯示兩端膨大呈棒狀，排列不規(guī)則，如圖1；2號菌落形狀不規(guī)則、灰白色，個別呈刺突狀，革蘭氏陽性菌，鏡檢呈圓形或橢圓形短鏈狀排列，如圖2。

2.2 PCR擴增及序列分析結果

用細菌通用引物對其16S rDNA基因序列進行擴增，凝膠電泳結果如圖3所示，菌1和菌2均擴增出大小約為1 500bp的片段，進一步測序分析結果發(fā)現(xiàn)該兩種菌株序列分別與已知拉奎拉棒狀桿菌和腸球菌屬同源性高于99%，提示獲得分離株為拉奎拉棒狀桿菌和腸球菌屬。同源性分析結果見表1。

3 討論

本試驗通過細菌形態(tài)、革蘭氏染色鑒定及PCR擴增及序列分析，從發(fā)病高山兀鷲的肝臟、心臟血液、胰臟中分離到拉奎拉棒狀桿菌和腸球菌屬2種菌株。關于拉奎拉棒狀桿菌在高山兀鷲糞便、病料等檢出的文獻研究較為少見[8]。腸球菌屬為當前益生菌研究的熱點，多種常見的腸球菌菌株已廣泛應用于多種發(fā)酵食品、藥物和微生態(tài)制劑當中[9]。對于高山兀鷲這種食腐食性猛禽，其腸道中的腸球菌屬對其消化腐食以及抑制腐食中病原菌所發(fā)揮的作用是值得深入研究的課題，其對于進一步研究高山兀鷲的生態(tài)習性等具有重要意義[10]。

拉奎拉棒狀桿菌和腸球菌屬的病原體大多毒力不高或致病性不強，一些是條件性致病菌，疾病的發(fā)生常與創(chuàng)傷或動物的免疫力低下有關。該例高山兀鷲死亡前經(jīng)歷籠舍調整，由大的開放籠舍轉移到面積小的封閉籠舍，可能存在飛行等行為無法得到有效滿足這一誘因。此外結合剖檢結果，不排除其因機體抵抗力降低，伴隨細菌感染后發(fā)病死亡的可能。因此，在高山兀鷲圈養(yǎng)實踐中應從籠舍環(huán)境與其生活習性之間的關系及疫苗接種、飼養(yǎng)環(huán)境的消殺滅源等疫病防控措施作進一步探討，本研究為高山兀鷲的動物園飼養(yǎng)和疾病防治提供理論依據(jù)和有益參考。

參考文獻：

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[2]? Bird Life International. Gyps himalayensis[EB/OL]. The IUCN red list of threatened species 2017.[2020-11-09].http：//dx.doi.org/10.2305/IUCN.UK.2017-3.RLTS.T22695215A118594518.en.

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[10] 魯旭， 張影， 曾明．益生性腸球菌安全性評價研究進展與監(jiān)管[J].中國藥事，2019，33（05）： 555-560．

第一作者簡介：粟玉剛（1985—），女，湖南長沙人，中級獸醫(yī)師，主要從事動物疾病治療與防治工作，E-mail：412635016@qq.com。

*通信作者簡介：李向勇（1981—），男，河南周口人，高級獸醫(yī)師，主要從事動物疾病治療與防治工作，E-mail：29778693@qq.com。