補(bǔ)中益氣湯加減升麻、柴胡對(duì)脾虛泄瀉大鼠胃腸、免疫功能及腸黏膜屏障的影響差異

葛文靜，單朋濤，2，李兵杰，2，王慧森，劉明，李華妮，李更生，梁瑞峰，2 [. 河南省中醫(yī)藥研究院（河南省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院），河南 鄭州 450004；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046]

中醫(yī)理論認(rèn)為，在方劑配伍中通過運(yùn)用引經(jīng)藥可改變其他藥物的作用方向，使其作用側(cè)重或集中于特定的部位，引導(dǎo)藥物直達(dá)經(jīng)絡(luò)臟腑，使藥效靶向集中。引經(jīng)藥的使用，是中醫(yī)遣方用藥的一大特色，極大地豐富了方劑配伍的內(nèi)容?，F(xiàn)代研究[1-2]表明，引經(jīng)藥可增強(qiáng)中藥療效，若引經(jīng)藥使用得當(dāng)，能起到事半功倍的作用，對(duì)臨床用藥具有重要意義。

補(bǔ)中益氣湯出自李東垣的《脾胃論》，為治療脾胃氣虛的經(jīng)典方劑，方中升麻、柴胡升陽舉陷，升麻引陽明清氣上升，柴胡引少陽清氣上升，在方中發(fā)揮脾經(jīng)引經(jīng)作用。中醫(yī)認(rèn)為脾主運(yùn)化，司中氣，與胃同為氣血生化之源，脾胃虛弱，運(yùn)化失司，可因水谷精微吸收不足，以致氣血生化之源匱乏。臨床和基礎(chǔ)研究均顯示，脾虛患者消化功能紊亂，免疫功能低下[3-4]。因此，本研究擬通過脾虛泄瀉大鼠模型，觀察補(bǔ)中益氣湯加減引經(jīng)藥升麻、柴胡后，對(duì)脾虛泄瀉大鼠胃腸功能、免疫紊亂和腸黏膜的影響，以期闡明升麻、柴胡的引經(jīng)增效作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SD 大鼠，雄性，SPF 級(jí)，6～8 周，體質(zhì)量（200 ± 20）g，濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（魯）2019-0003，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：0002478。飼養(yǎng)于河南省中醫(yī)藥研究院SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)溫度：20～22 ℃，濕度：45%～55%，12 h 光暗循環(huán)周期。實(shí)驗(yàn)經(jīng)河南省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：HNTCMDW-20200306。

1.2 藥物及試劑 黃芪、炙甘草、人參、當(dāng)歸、陳皮、白術(shù)、升麻、柴胡購于河南省順康醫(yī)藥有限公司，經(jīng)河南省中醫(yī)藥研究院王慧森副研究員鑒定，均符合2020 年版《中華人民共和國藥典》項(xiàng)下規(guī)定；利血平注射液，天津金耀藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1903211；異氟烷，深圳瑞沃德生命科技有限公司，批號(hào)：R510-22；胃泌素（gastrin，GAS）試劑盒，武漢華美生物公司，批號(hào)：Y13035081；大鼠白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素10（interleukin-10，IL-10）、血管活性腸肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）ELISA 試劑盒，武漢伊萊瑞特生物公司， 批號(hào)分別為： GY02VFJN5336、ERSH5RSLJC、V26VVA4LFA；CD3+、CD4+、CD8+一抗，美國Biolegend 公司，批號(hào)分別為：B247807、B201139、B263802；p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）、磷酸化p38 絲裂原活化蛋白激酶（phosphorylated p38 mitogen-activated protein kinase，p-p38 MAPK）一抗，武漢三鷹公司，批號(hào)分別為：14064-1-AP、28796-1-AP；閉鎖小帶蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）、閉合蛋白（Occludin）一抗，美國Affinity 公司，批號(hào)分別為：44h7470、53t8241。

1.3 儀器 2K15 型冷凍離心機(jī)，德國Sigma 公司；Synergy NEO 型全功能酶標(biāo)儀，美國Bio-Tek 公司；IX73 型顯微鏡，日本Olympus 公司；Fluorchem R 型成像系統(tǒng)，美國Alpha Innotech 公司；NAVIOS 流式細(xì)胞儀，美國Beckman Coulter 公司；R500 型小動(dòng)物麻醉機(jī)，深圳瑞沃德生命科技有限公司；DYCZ-24DN 型電泳儀、DYCZ-40D 型電泳儀，北京六一生物科技有限公司。

1.4 藥物制備 大黃提取液[5]：稱取大黃500 g，取10 倍量70%乙醇，加熱回流提取2 次，每次2 h，合并濾液，減壓回收乙醇，調(diào)整濃度為相當(dāng)于含生藥1.5 g·mL-1。補(bǔ)中益氣湯提取液：按原方比例稱取適量藥材加10 倍量水，浸泡30 min 后煎煮2 h，提取2 次，合并濾液，調(diào)整濃度為含生藥1.323 g·mL-1。補(bǔ)中益氣湯缺升麻、柴胡組提取液制備方法同上，調(diào)整質(zhì)量濃度為補(bǔ)中益氣湯缺升麻組（含生藥1.197 g·mL-1）、補(bǔ)中益氣湯缺柴胡組（含生藥1.197 g·mL-1）和補(bǔ)中益氣湯缺升麻柴胡組（含生藥1.071 g·mL-1），4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 模型復(fù)制及給藥 雄性SD 大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、補(bǔ)中益氣湯全方組（含生藥13.23 g·kg-1）、補(bǔ)中益氣湯缺升麻組（含生藥11.97 g·kg-1）、補(bǔ)中益氣湯缺柴胡組（含生藥11.97 g·kg-1）和補(bǔ)中益氣湯缺升麻柴胡組（含生藥10.71 g·kg-1），每組10 只。采用“利血平+大黃+隔日進(jìn)食”多因素法復(fù)制脾虛泄瀉大鼠模型[6]，方法如下：大鼠灌胃大黃提取液（15 g·kg-1），每日1 次；皮下注射利血平（0.5 mg·kg-1），隔日1 次；隔日禁食，與利血平交替進(jìn)行。正常大鼠每日灌胃蒸餾水、皮下注射等體積生理鹽水，共14 d。大鼠出現(xiàn)精神萎靡、攝食量減少、毛發(fā)枯黃、瞇眼懶動(dòng)、扎堆弓背、大便稀溏、肛周污穢、體質(zhì)量降低等癥狀，提示模型復(fù)制成功。從第3 周開始，每日上午灌胃給藥，下午給予大黃提取液（15 g·kg-1），每日1 次，連續(xù)14 d，正常組和模型組的大鼠灌服等體積蒸餾水。

1.6 一般狀態(tài)觀察及腹瀉指數(shù)的測(cè)定 觀察各組大鼠的精神狀態(tài)、活躍程度、皮膚毛發(fā)、飲食狀態(tài)、大便狀態(tài)等變化。給藥前、末次給藥后將各組的每只大鼠分別置于代謝籠中，籠下放置濾紙，統(tǒng)計(jì)4 h 內(nèi)濾紙上所有糞便總數(shù)、稀便數(shù)，計(jì)算各組大鼠腹瀉指數(shù)[6]。稀便率：稀便次數(shù)與總便次數(shù)之比。稀便級(jí)：以稀便污跡的直徑進(jìn)行定級(jí)，分為4 級(jí)：1 級(jí)（＜1 cm）、2 級(jí)（1～2 cm）、3 級(jí)（2～3 cm）、4 級(jí)（＞3 cm）。逐一統(tǒng)計(jì)每堆稀便的級(jí)數(shù)，然后將該鼠所有稀便級(jí)數(shù)相加后除以稀便次數(shù)，得到平均稀便級(jí)。計(jì)算腹瀉指數(shù)：腹瀉指數(shù)=稀便率×平均稀便級(jí)。

1.7 脾臟及胸腺指數(shù) 末次給藥后禁食不禁水24 h，2.5%異氟烷1 L·min-1吸入麻醉，腹主動(dòng)脈取血，900×g離心10 min 分離血清，-80 ℃保存。取一部分空腸置于4%多聚甲醛固定，另一部分-80 ℃保存。分離各組大鼠的脾臟和胸腺，去除附帶脂肪組織，用濾紙吸干水分后稱質(zhì)量，計(jì)算脾臟及胸腺指數(shù)。脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g），胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）。

1.8 空腸組織病理學(xué)的觀察 空腸組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE 染色后于顯微鏡下觀察各組大鼠空腸組織的病理學(xué)改變。

1.9 血清IL-6、IL-10、GAS、VIP 的測(cè)定 麻醉后腹主動(dòng)脈取血，900×g離心10 min，分離血清，-80 ℃保存?zhèn)溆?。血清中IL-6、IL-10、GAS、VIP 均用ELISA 試劑盒測(cè)定，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.10 血液中T 淋巴細(xì)胞亞群的測(cè)定 取3 mL 血于抗凝管中，按流式抗體說明書進(jìn)行處理，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行T 淋巴細(xì)胞CD3+、CD4+、CD8+亞群的檢測(cè)，計(jì)數(shù)CD3+、CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞的百分比和CD4+/CD8+T 淋巴細(xì)胞的比值。

1.11 空腸組織中p38 MAPK、p-p38 MAPK、ZO-1、Occludin 蛋白的表達(dá) 取適量空腸組織，加入RIPA裂解液冰上裂解提取組織蛋白。BCA 法檢測(cè)蛋白濃度，100 ℃變性5 min 后取等量蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，棄封閉液后漂洗3 次，分別加入p38 MAPK（1∶1 000）、p-p38 MAPK（1∶2 000）、ZO-1（1∶2 000）、Occludin（1∶2 000）、GAPDH（1∶2 000）一抗4 ℃孵育過夜，羊抗鼠二抗（1∶10 000）室溫下震蕩孵育1 h，洗膜后加入ECL 顯色液曝光拍照，ImageJ 軟件分析灰度值，以目的條帶/GAPDH 灰度值計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS 26.0 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)中益氣湯加減引經(jīng)藥對(duì)脾虛泄瀉大鼠一般狀態(tài)的影響 正常組大鼠活動(dòng)情況及精神狀態(tài)良好，毛發(fā)白亮有光澤，攝食量正常，大便橢圓顆粒狀，無腹瀉。模型組大鼠精神萎靡、瞇眼拱背、扎堆蜷縮、攝食量及活動(dòng)減少、毛發(fā)枯黃、大便稀溏，肛周污穢。不同配伍補(bǔ)中益氣湯藥物組大鼠較模型組大鼠精神狀態(tài)均有改善，毛發(fā)有光澤，攝食量增加，大便基本成形。

2.2 補(bǔ)中益氣湯加減引經(jīng)藥對(duì)脾虛泄瀉大鼠腹瀉指數(shù)的影響 結(jié)果見表1。正常組大鼠給藥前后均無腹瀉。給藥前，模型組與補(bǔ)中益氣湯各藥物組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。給藥后，與模型組比較，補(bǔ)中益氣湯全方組和補(bǔ)中益氣湯缺柴胡組大鼠腹瀉指數(shù)均不同程度降低（P＜0.01，P＜0.05）。與補(bǔ)中益氣湯全方組比較，補(bǔ)中益氣湯缺升麻柴胡組大鼠腹瀉指數(shù)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明其療效不如補(bǔ)中益氣湯全方組。

表1 補(bǔ)中益氣湯加減引經(jīng)藥對(duì)脾虛泄瀉大鼠腹瀉指數(shù)的影響（±s，n=10）Table 1 Effect of Buzhong Yiqi Decoction modified with meridian- guiding drug on diarrhea index in splenasthenic diarrhea rats（± s，n=10）

表1 補(bǔ)中益氣湯加減引經(jīng)藥對(duì)脾虛泄瀉大鼠腹瀉指數(shù)的影響（±s，n=10）Table 1 Effect of Buzhong Yiqi Decoction modified with meridian- guiding drug on diarrhea index in splenasthenic diarrhea rats（± s，n=10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與補(bǔ)中益氣湯全方組比較，△P＜0.05

給藥后0 1.02±0.19**0.72±0.13##0.86±0.23 0.83±0.16#0.92±0.18△組別正常組模型組補(bǔ)中益氣湯全方組補(bǔ)中益氣湯缺升麻組補(bǔ)中益氣湯缺柴胡組補(bǔ)中益氣湯缺升麻柴胡組劑量/（g·kg-1）--13.23 11.97 11.97 10.71給藥前0 1.03±0.20**1.02±0.17 1.00±0.18 0.99±0.22 1.02±0.23

2.3 補(bǔ)中益氣湯加減引經(jīng)藥對(duì)脾虛泄瀉大鼠脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)的影響 結(jié)果見表2。與正常組比較，模型組大鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，不同配伍補(bǔ)中益氣湯藥物組大鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）。與補(bǔ)中益氣湯全方組比較，補(bǔ)中益氣湯缺升麻、補(bǔ)中益氣湯缺柴胡、補(bǔ)中益氣湯缺升麻柴胡組大鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)均不同程度降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）

表2 補(bǔ)中益氣湯加減引經(jīng)藥對(duì)脾虛泄瀉大鼠脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)的影響（±s，n=10）Table 2 Effects of Buzhong Yiqi Decoction modified with meridian-guiding drug on spleen index and thymus index in splenasthenic diarrhea rats（±s，n=10）

表2 補(bǔ)中益氣湯加減引經(jīng)藥對(duì)脾虛泄瀉大鼠脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)的影響（±s，n=10）Table 2 Effects of Buzhong Yiqi Decoction modified with meridian-guiding drug on spleen index and thymus index in splenasthenic diarrhea rats（±s，n=10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

胸腺指數(shù)/（mg·g-1）1.56±0.15 1.22±0.15**1.52±0.11##1.42±0.22#1.45±0.21#1.40±0.26#組別正常組模型組補(bǔ)中益氣湯全方組補(bǔ)中益氣湯缺升麻組補(bǔ)中益氣湯缺柴胡組補(bǔ)中益氣湯缺升麻柴胡組劑量/（g·kg-1）--13.23 11.97 11.97 10.71脾臟指數(shù)/（mg·g-1）2.62±0.28 2.22±0.21**2.60±0.21##2.54±0.17##2.52±0.20##2.45±0.24#

2.4 補(bǔ)中益氣湯加減引經(jīng)藥對(duì)脾虛泄瀉大鼠空腸組織病理形態(tài)的影響 結(jié)果見圖1。HE 染色結(jié)果顯示，正常組大鼠空腸黏膜結(jié)構(gòu)清晰、完整，絨毛形態(tài)規(guī)則，固有層未見炎性細(xì)胞浸潤。脾虛泄瀉模型組大鼠空腸絨毛變形、彎曲、萎縮，空腸黏膜損傷明顯，部分上皮細(xì)胞缺失，固有層可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，腺體排列紊亂。不同配伍補(bǔ)中益氣湯藥物組大鼠空腸黏膜損傷較模型組可見不同程度改善，炎癥細(xì)胞浸潤減少，腺體排列較整齊。與缺升麻、柴胡的各組比較，補(bǔ)中益氣湯全方組改善更為明顯。

圖1 補(bǔ)中益氣湯加減引經(jīng)藥對(duì)脾虛泄瀉大鼠空腸組織病理形態(tài)的影響（HE 染色，×200）Figure 1 Effect of Buzhong Yiqi Decoction modified with meridian-guiding drug on the pathological morphology of jejunum tissue in splenasthenic diarrhea rats（HE staining，×200）

2.5 補(bǔ)中益氣湯加減引經(jīng)藥對(duì)脾虛泄瀉大鼠血清中IL-6、IL-10、GAS、VIP 水平的影響 結(jié)果見表3。模型組大鼠血清中IL-6 水平較正常組明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，不同配伍補(bǔ)中益氣湯組血清中IL-6 水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），但補(bǔ)中益氣湯全方組降低更明顯（P＜0.05，P＜0.01）。與正常組比較，模型組大鼠血清中IL-10、GAS、VIP 水平均明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，補(bǔ)中益氣湯全方組大鼠血清中IL-10、GAS、VIP 水平均不同程度升高（P＜0.01）。與補(bǔ)中益氣湯全方組比較，補(bǔ)中益氣湯缺升麻組、補(bǔ)中益氣湯缺柴胡組、補(bǔ)中益氣湯缺升麻柴胡組大鼠血清中GAS、VIP 的水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），說明補(bǔ)中益氣湯全方組療效更佳。

表3 補(bǔ)中益氣湯加減引經(jīng)藥對(duì)脾虛泄瀉大鼠血清中IL-6、IL-10、GAS 和VIP 水平的影響（±s，n=10）Table 3 Effect of Buzhong Yiqi Decoction modified with meridian-guiding drug on serum IL-6 ，IL-10，GAS and VIP levels in splenasthenic diarrhea rats（±s，n=10）

表3 補(bǔ)中益氣湯加減引經(jīng)藥對(duì)脾虛泄瀉大鼠血清中IL-6、IL-10、GAS 和VIP 水平的影響（±s，n=10）Table 3 Effect of Buzhong Yiqi Decoction modified with meridian-guiding drug on serum IL-6 ，IL-10，GAS and VIP levels in splenasthenic diarrhea rats（±s，n=10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與補(bǔ)中益氣湯全方組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

VIP/（pg·mL-1）198.23±29.60 130.67±15.02**187.11±27.61##154.84±20.70#△△165.95±15.23##△144.84±16.49△△組別正常組模型組補(bǔ)中益氣湯全方組補(bǔ)中益氣湯缺升麻組補(bǔ)中益氣湯缺柴胡組補(bǔ)中益氣湯缺升麻柴胡組劑量/（g·kg-1）--13.23 11.97 11.97 10.71 IL-6/（pg·mL-1）35.13±4.34 52.45±6.10**37.43±4.19##42.60±4.81##△40.61±4.35##46.88±5.85#△△IL-10/（pg·mL-1）28.58±4.70 21.01±3.43**27.48±4.45##24.34±3.29 24.51±2.77#23.40±3.52△GAS/（ng·mL-1）2.53±0.35 0.98±0.15**1.56±0.24##1.32±0.22##△1.13±0.22△△1.02±0.19△△

2.6 補(bǔ)中益氣湯加減引經(jīng)藥對(duì)脾虛泄瀉大鼠血液中T淋巴細(xì)胞亞群的影響 結(jié)果見圖2、表4。T 淋巴細(xì)胞亞群流式結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠外周血中CD3+、CD4+T 淋巴細(xì)胞百分比和CD4+/CD8+比值降低（P＜0.01）。與模型組比較，補(bǔ)中益氣湯全方組大鼠外周血中CD3+、CD4+T 淋巴細(xì)胞百分比和CD4+/CD8+比值均有所升高（P＜0.01），且較補(bǔ)中益氣湯缺升麻柴胡組升高更明顯（P＜0.05，P＜0.01）。與正常組比較，各組大鼠外周血CD8+T 淋巴細(xì)胞百分比的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 補(bǔ)中益氣湯加減引經(jīng)藥對(duì)脾虛泄瀉大鼠血液中T 淋巴細(xì)胞亞群影響的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果Figure 2 Results of flow cytometry of Buzhong Yiqi Decoction modified with meridian-guiding drug on T lymphocyte subsets in blood of splenasthenic diarrhea rats

表4 補(bǔ)中益氣湯加減引經(jīng)藥對(duì)脾虛泄瀉大鼠血液中T 淋巴細(xì)胞亞群的影響（±s，n=10）Table 4 Effect of Buzhong Yiqi Decoction modified with meridian-guiding drug on T lymphocyte subsets in blood of splenasthenic diarrhea rats（±s，n=10）

表4 補(bǔ)中益氣湯加減引經(jīng)藥對(duì)脾虛泄瀉大鼠血液中T 淋巴細(xì)胞亞群的影響（±s，n=10）Table 4 Effect of Buzhong Yiqi Decoction modified with meridian-guiding drug on T lymphocyte subsets in blood of splenasthenic diarrhea rats（±s，n=10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與補(bǔ)中益氣湯全方組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

CD4+/CD8+2.71±0.54 1.88±0.28**2.46±0.41##2.04±0.22△2.23±0.43#2.08±0.34△組別正常組模型組補(bǔ)中益氣湯全方組補(bǔ)中益氣湯缺升麻組補(bǔ)中益氣湯缺柴胡組補(bǔ)中益氣湯缺升麻柴胡組劑量/（g·kg-1）--13.23 11.97 11.97 10.71 CD3+/%56.14±4.30 39.46±6.55**53.42±4.36##51.91±5.07##47.45±5.31##△44.34±5.93#△△CD4+/%41.03±4.29 25.75±4.15**38.01±2.91##34.95±3.93##32.62±2.58##△△29.82±3.23#△△CD8+/%15.50±2.45 13.89±2.92 15.73±2.52 17.28±1.89##15.16±3.34 14.71±3.07

2.7 補(bǔ)中益氣湯加減引經(jīng)藥對(duì)脾虛泄瀉大鼠空腸組織p38 MAPK、p-p38 MAPK、ZO-1、Occludin 蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果見圖3、表5。與正常組比較，模型組大鼠空腸中p-p38 MAPK 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.01），ZO-1、Occludin 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，補(bǔ)中益氣湯全方組大鼠空腸中p-p38 MAPK 蛋白水平降低， ZO-1、Occludin 蛋白表達(dá)水平增加（P＜0.01）。與補(bǔ)中益氣湯全方組比較，補(bǔ)中益氣湯缺升麻柴胡組大鼠空腸中p-p38 MAPK 蛋白表達(dá)水平升高，ZO-1、Occludin蛋白水平降低（P＜0.01）。

圖3 各組大鼠空腸組織中p38 MAPK、p-p38 MAPK、ZO-1、Occludin 蛋白的表達(dá)Figure 3 The protein expressions of p38 MAPK，p-p38 MAPK，ZO-1 and Occludin in jejunum tissue of rats of each group

表5 補(bǔ)中益氣湯加減引經(jīng)藥對(duì)脾虛泄瀉大鼠空腸組織p38 MAPK、p-p38 MAPK、ZO-1、Occludin 蛋白表達(dá)的影響（±s，n=6）Table 5 Effects of Buzhong Yiqi Decoction modified with meridian-guiding drug on the protein expressions of p38 MAPK，p-p38 MAPK，ZO-1 and Occludin in jejunum tissue of splenasthenic diarrhea rats（±s，n=6）

表5 補(bǔ)中益氣湯加減引經(jīng)藥對(duì)脾虛泄瀉大鼠空腸組織p38 MAPK、p-p38 MAPK、ZO-1、Occludin 蛋白表達(dá)的影響（±s，n=6）Table 5 Effects of Buzhong Yiqi Decoction modified with meridian-guiding drug on the protein expressions of p38 MAPK，p-p38 MAPK，ZO-1 and Occludin in jejunum tissue of splenasthenic diarrhea rats（±s，n=6）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與補(bǔ)中益氣湯全方組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

Occludin 0.74±0.12 0.37±0.06**0.70±0.10##0.49±0.05#△△0.64±0.09##0.41±0.07△△組別正常組模型組補(bǔ)中益氣湯全方組補(bǔ)中益氣湯缺升麻組補(bǔ)中益氣湯缺柴胡組補(bǔ)中益氣湯缺升麻柴胡組劑量/（g·kg-1）--13.23 11.97 11.97 10.71 p38 MAPK 0.56±0.06 0.56±0.04 0.58±0.06 0.53±0.06 0.57±0.07 0.57±0.07 p-p38 MAPK 0.23±0.03 0.44±0.06**0.28±0.03##0.35±0.05##△0.33±0.04##0.39±0.04#△△ZO-1 0.66±0.10 0.34±0.04**0.56±0.06##0.42±0.05#△△0.39±0.04△△0.45±0.05##△△

3 討論

中醫(yī)理論認(rèn)為，在方劑配伍中運(yùn)用引經(jīng)藥可引導(dǎo)藥物直達(dá)經(jīng)絡(luò)臟腑，使藥效靶向集中，從而提高療效[7]。補(bǔ)中益氣湯是治療脾胃氣虛的代表方，方中升麻、柴胡升陽舉陷，協(xié)助君藥升提下陷之中氣，《本草綱目》：“升麻引陽明清氣上升，柴胡引少陽清氣上行，此乃稟賦虛弱，元?dú)馓擆H，及勞役饑飽，生冷內(nèi)傷，脾胃引經(jīng)最要藥也”，在方中共為引經(jīng)佐使藥。中醫(yī)認(rèn)為脾主運(yùn)化，脾胃虛弱、脾失健運(yùn)可導(dǎo)致腹脹、泄瀉等腸道功能紊亂癥狀。本研究采用“大黃+利血平+隔日進(jìn)食”多因素法復(fù)制脾虛泄瀉大鼠模型，模型大鼠出現(xiàn)大便溏稀、精神萎靡、瞇眼拱背、扎堆蜷縮等與臨床脾虛證相似的癥狀，且模型大鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)及血清IL-6、IL-10、GAS、VIP 等指標(biāo)均與正常大鼠有明顯性差異，表明脾虛泄瀉大鼠模型復(fù)制成功。不同配伍的補(bǔ)中益氣湯均可改善脾虛泄瀉大鼠的癥狀，以補(bǔ)中益氣湯全方組效果最為明顯，補(bǔ)中益氣湯缺柴胡組次之，表明升麻、柴胡對(duì)補(bǔ)中益氣湯具有引經(jīng)增效作用，且升麻的引經(jīng)增效作用優(yōu)于柴胡。

中醫(yī)認(rèn)為脾主運(yùn)化，其功能主要與胃腸運(yùn)動(dòng)、胃腸激素分泌等密切相關(guān)，脾胃虛弱可導(dǎo)致機(jī)體消化功能紊亂[8]。GAS 作為調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)的激素，具有調(diào)節(jié)吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝等生理活性，可加強(qiáng)胃腸運(yùn)動(dòng)和膽囊收縮，促進(jìn)胃蛋白酶原、胃酸、膽汁的分泌，是衡量胃腸功能的重要指標(biāo)[9-10]。VIP 是由腸道神經(jīng)元分泌的調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)與胃腸運(yùn)動(dòng)的一種主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，可通過松弛胃腸平滑肌，抑制結(jié)腸和直腸緊張性及小腸運(yùn)動(dòng)。VIP 水平異?？芍挛改c動(dòng)力和分泌功能紊亂，導(dǎo)致腸道平滑肌運(yùn)動(dòng)障礙，引起腹瀉[11-12]。有研究[13]表明，多因素誘導(dǎo)的脾虛大鼠模型在造模第2 周時(shí)血漿中VIP 水平較正常大鼠增高，第3 周后VIP 水平較正常大鼠降低，而GAS 水平在整個(gè)造模期間均低于正常大鼠。在造模的不同時(shí)間點(diǎn)各種胃腸激素水平會(huì)發(fā)生不同的變化，導(dǎo)致胃腸運(yùn)動(dòng)無節(jié)律、消化液分泌紊亂，嚴(yán)重影響到胃腸的消化吸收功能，引起胃腸功能紊亂。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠腹瀉指數(shù)高于正常組，血清GAS、VIP 水平均明顯低于正常組，補(bǔ)中益氣湯各給藥組大鼠腹瀉指數(shù)降低，GAS、VIP 水平均有不同程度升高，胃腸功能紊亂有所改善，其中補(bǔ)中益氣湯全方組療效更明顯，提示升麻、柴胡作為引經(jīng)藥可能通過調(diào)控胃腸激素的分泌調(diào)節(jié)胃腸功能而發(fā)揮增效作用。

脾與免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，中醫(yī)認(rèn)為脾居中焦，為氣血生化之源，氣機(jī)升降之樞紐，是人體抗御病邪的重要防衛(wèi)機(jī)構(gòu)[8]。胸腺是T 細(xì)胞分化、成熟的器官，脾臟是成熟T 細(xì)胞等定居和產(chǎn)生免疫應(yīng)答的場(chǎng)所，二者是機(jī)體最重要的免疫器官。脾臟及胸腺指數(shù)的改變可直觀反映機(jī)體及細(xì)胞免疫水平的變化[14-15]。T 淋巴細(xì)胞亞群是監(jiān)測(cè)機(jī)體細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)，CD3+T 細(xì)胞是體內(nèi)的T 淋巴細(xì)胞總和，存在于外周血T 淋巴細(xì)胞和胸腺細(xì)胞表面，參與機(jī)體抗原應(yīng)激反應(yīng)。CD4+T 淋巴細(xì)胞主要發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，可抑制免疫細(xì)胞的活化。CD8+T 細(xì)胞主要是一類具有殺傷活性的效應(yīng)細(xì)胞，能直接識(shí)別靶細(xì)胞，發(fā)揮免疫效應(yīng)。CD4+與CD8+T 淋巴細(xì)胞，兩者相互協(xié)作共同發(fā)生作用，CD4+/CD8+比值變化比較敏感，可及時(shí)反映機(jī)體當(dāng)前的免疫狀態(tài)[16-18]。IL-6 作為機(jī)體炎癥反應(yīng)最早出現(xiàn)的細(xì)胞因子，主要由活化的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，在腸道炎癥中，IL-6 的過度表達(dá)會(huì)影響腸上皮細(xì)胞的電解質(zhì)分泌，使腸黏膜通透性增加，IL-10 主要由CD4+Th2 輔助細(xì)胞亞群產(chǎn)生，是細(xì)胞免疫反應(yīng)的抑炎癥因子[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，脾虛泄瀉大鼠血清中CD3+T 淋巴細(xì)胞、CD4+T 淋巴細(xì)胞百分比及CD4+/CD8+比值較正常組明顯下降，IL-6 水平升高，IL-10 含量降低，表明脾虛可使機(jī)體免疫功能降低；不同配伍補(bǔ)中益氣湯可提高脾虛泄瀉小鼠脾臟及胸腺指數(shù)，提高CD3+T 淋巴細(xì)胞、CD4+T 淋巴細(xì)胞百分比，恢復(fù)T 淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+的平衡，降低IL-6 水平，升高IL-10 含量，補(bǔ)中益氣湯全方組改善更明顯，提示升麻、柴胡對(duì)補(bǔ)中益氣湯提高免疫功能有引經(jīng)增效作用。

脾虛泄瀉可引起炎癥反應(yīng)，造成腸黏膜屏障破壞，進(jìn)而導(dǎo)致腹瀉的發(fā)生。研究[21-22]表明，腸道細(xì)胞間的緊密連接是構(gòu)成腸道屏障的重要組成部分，是調(diào)節(jié)腸黏膜通透性的關(guān)鍵因素。ZO-1、Occludin 蛋白作為緊密連接的重要組成蛋白，對(duì)維持腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)完整、功能正常及調(diào)節(jié)腸道通透性發(fā)揮著重要作用。ZO-1 還作為橋梁蛋白，可將Occludin 蛋白的末端與細(xì)胞骨架蛋白連接起來，維持緊密連接結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[23-24]。研究[25]表明，ZO-1 蛋白表達(dá)減少，將導(dǎo)致其他緊密連接蛋白的表達(dá)下調(diào)，使得緊密連接結(jié)構(gòu)完整性遭到破壞，腸黏膜屏障功能破壞。Occludin蛋白的缺乏，會(huì)導(dǎo)致腸黏膜屏障功能障礙，使腸道通透性增加，引起腹瀉[26]。p38 MAPK 是MAPK 家族成員之一，可以介導(dǎo)應(yīng)激、炎癥等細(xì)胞反應(yīng)。p38 MAPK 磷酸化為p-p38 MAPK 后激活，可調(diào)控下游轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)IL-6、TNF-α 等細(xì)胞因子的分泌，引起腸黏膜炎癥反應(yīng)。同時(shí)，p38 MAPK 信號(hào)通路激活可抑制ZO-1、Occludin 等蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致腸道緊密連接結(jié)構(gòu)破壞[27-29]。本研究結(jié)果顯示：脾虛泄瀉模型組大鼠空腸組織病理學(xué)觀察可見絨毛彎曲、變形、萎縮，空腸黏膜損傷，部分上皮缺失，固有層可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，組織內(nèi)p-p38 MAPK 蛋白表達(dá)增加，ZO-1 和Occludin 蛋白表達(dá)減少；與模型組比較，不同配伍補(bǔ)中益氣湯藥物組能明顯降低p-p38 MAPK 蛋白的表達(dá)，提高大鼠空腸緊密連接蛋白ZO-1 和Occludin 的表達(dá)；補(bǔ)中益氣湯缺柴胡組p-p38 MAPK、Occludin 蛋白表達(dá)與全方組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示升麻、柴胡作為引經(jīng)藥可能通過調(diào)節(jié)空腸黏膜屏障蛋白的表達(dá)，降低空腸組織通透性發(fā)揮引經(jīng)增效作用，且升麻的引經(jīng)增效作用優(yōu)于柴胡。

綜上所述，補(bǔ)中益氣湯可明顯改善脾虛泄瀉，方中升麻、柴胡可增強(qiáng)補(bǔ)中益氣湯的藥效，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)胃腸功能、恢復(fù)免疫功能紊亂及上調(diào)空腸緊密連接蛋白表達(dá)有關(guān)。現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究[7，30]表明引經(jīng)藥可能通過提高靶組織中的藥物分布發(fā)揮引經(jīng)作用，升麻、柴胡作為引經(jīng)藥在補(bǔ)中益氣湯中具有增強(qiáng)療效的作用，但其是否通過增加有效成分在相關(guān)組織的分布發(fā)揮引經(jīng)作用尚需進(jìn)一步研究。