基于多組學(xué)技術(shù)整合的中藥復(fù)方治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制研究進(jìn)展

姜麗，徐霞，張文彤，嚴(yán)小軍，徐國(guó)良，黃麗萍 （. 江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)基礎(chǔ)理論分化發(fā)展研究中心，江西 南昌 000；2. 江西省中醫(yī)病因生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 000；. 江西省中藥藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 000；. 山東大學(xué)齊魯醫(yī)院德州醫(yī)院，山東 德州 25000）

中藥復(fù)方作用機(jī)制研究是中藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵和核心，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)此進(jìn)行了很多有益的探索，并提出中藥復(fù)方是通過多組分、多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)整合起效的觀點(diǎn)。因此，需要從整體角度來(lái)理解中藥的作用機(jī)制。隨著生命科學(xué)的飛速發(fā)展和大數(shù)據(jù)時(shí)代的到來(lái)，基于化學(xué)基因組學(xué)、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)等多組學(xué)技術(shù)，分別從化學(xué)小分子、基因、蛋白、轉(zhuǎn)錄體以及代謝物層面為中藥作用機(jī)制的深度研究提供了有力手段。潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC）是一種結(jié)腸黏膜的慢性非特異性炎性疾病，主要起于直腸，連續(xù)向近端擴(kuò)散，常累及闌尾周圍。由于此病癥纏綿難愈，反復(fù)發(fā)作，已被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病之一[1-2]。常用的藥物療法（如氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素）、干細(xì)胞移植、白細(xì)胞吸附等[3]治療手段雖然見效快，療效顯著，但毒副作用較大，只能用于維持和預(yù)防疾病。而中藥復(fù)方對(duì)UC 這種多因素導(dǎo)致的復(fù)雜慢性疾病的臨床治療表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)，可降低復(fù)發(fā)率、減少不良反應(yīng)和激素依賴及激素抵抗、提高患者生活質(zhì)量、縮短治療療程等[4-5]。目前普遍認(rèn)為UC 的發(fā)生主要與免疫、細(xì)胞凋亡、遺傳、物理環(huán)境和感染等多種因素的共同作用有關(guān)[6-7]。因此，僅從單一藥效層面闡釋中藥復(fù)方治療UC 的作用機(jī)制研究往往存在局限性。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)可全面快速地獲取某一物種特定器官或組織在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，用于研究UC 條件下和正常情況下該物種轉(zhuǎn)錄水平的差異，為從轉(zhuǎn)錄組學(xué)水平探討UC 發(fā)病機(jī)制提供了思路和方法。代謝組學(xué)可對(duì)血漿、尿液及糞便等多個(gè)生物樣品代謝物進(jìn)行系統(tǒng)表征，探討UC 引起的機(jī)體代謝表型變化，并鑒定代謝網(wǎng)絡(luò)中與之相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物，揭示UC 的發(fā)生機(jī)制，為進(jìn)一步探究UC 的病因病機(jī)提供了重要的途徑。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，中藥復(fù)方與腸道菌群的相互作用研究越來(lái)越深入，在此背景下，中醫(yī)藥在治療疾病時(shí)對(duì)腸道菌群的影響，又可從腸道微生態(tài)角度闡釋中醫(yī)藥治療UC 的機(jī)制。因此，通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)、腸道微生物組學(xué)等多種現(xiàn)代分析技術(shù)整合手段與中醫(yī)藥相結(jié)合，為中藥復(fù)方作用機(jī)理的闡明提供了新的出路。本文從轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)、腸道微生物組學(xué)等多角度對(duì)中藥復(fù)方治療UC 的作用機(jī)理進(jìn)行了深入探討，并對(duì)各種技術(shù)在應(yīng)用層面的內(nèi)在聯(lián)系加以闡述，以期為預(yù)防和治療UC 及其并發(fā)癥提供新的方法與途徑，同時(shí)也對(duì)中藥復(fù)方作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)有所裨益。

1 基于多組學(xué)技術(shù)的中藥復(fù)方對(duì)UC 的作用機(jī)制研究

1.1 基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中藥復(fù)方對(duì)UC 的作用機(jī)制轉(zhuǎn)錄組學(xué)（Transcriptomics）可以通過研究完整的RNA轉(zhuǎn)錄組對(duì)細(xì)胞和組織中的基因表達(dá)模式進(jìn)行全基因組評(píng)估。轉(zhuǎn)錄組研究改變了單一基因的研究模式，使基因表達(dá)調(diào)控和基因組研究進(jìn)入了快速發(fā)展的時(shí)代。轉(zhuǎn)錄組學(xué)中“組學(xué)”的概念與中醫(yī)“整體”的思想是一致的。Wang 等[8]通過16S rRNA 測(cè)序、轉(zhuǎn)錄及代謝組學(xué)等方法研究吳茱萸堿治療UC 的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)吳茱萸堿對(duì)葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的緩解與嗜酸乳桿菌數(shù)量的增加和醋酸鹽的產(chǎn)生有關(guān)。

1.2 基于代謝組學(xué)研究中藥復(fù)方對(duì)UC 的作用機(jī)制代謝組學(xué)（Metabonomics）研究的對(duì)象是相對(duì)分子質(zhì)量小于1 000 的內(nèi)源性小分子，其可通過觀察代謝物的動(dòng)態(tài)變化來(lái)研究刺激或干擾（例如特定的基因突變或環(huán)境變化）前后的內(nèi)源性代謝物變化網(wǎng)絡(luò)。在探討中藥多成分、多靶點(diǎn)的復(fù)雜藥效和作用規(guī)律時(shí)，代謝組學(xué)對(duì)機(jī)體的整體性認(rèn)識(shí)與突出整體效應(yīng)的中醫(yī)藥學(xué)思想有一定的趨同性，可根據(jù)機(jī)體整體代謝產(chǎn)物在不同病癥狀態(tài)下的變化規(guī)律，評(píng)價(jià)中藥復(fù)方效應(yīng)及作用機(jī)制[9-11]。此外，代謝組學(xué)可對(duì)血漿[12]、尿液[13]及糞便[14]等多個(gè)生物樣品代謝物進(jìn)行系統(tǒng)表征，探討不同證型UC 模型及中藥干預(yù)后引起的機(jī)體代謝表型變化和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[15-16]，并鑒定代謝網(wǎng)絡(luò)中與之相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物，揭示中藥方劑的作用機(jī)制。同時(shí)，由于代謝物處于生物信息的末端，代謝譜反映了基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的變化及相互間協(xié)調(diào)作用的最終信息，能夠直接反映出生物體的代謝表型特征[17-20]。因此，隨著檢測(cè)技術(shù)的迅猛發(fā)展，利用代謝組學(xué)研究中藥復(fù)方作用機(jī)制已成為中藥研究的熱點(diǎn)之一。Wang 等[21]通過對(duì)尿液代謝組學(xué)的分析，發(fā)現(xiàn)UC 通過影響氨基酸代謝、不飽和脂肪酸的生物合成，以損害三羧酸循環(huán)而引起炎癥和胃腸道反應(yīng)。黃芩湯可通過調(diào)節(jié)上述代謝過程，從而使代謝紊亂恢復(fù)正常，揭示了黃芩湯對(duì)三硝基苯磺酸（TNBS）所致大鼠UC 的作用機(jī)制。Li 和Liao 等[22-23]通過超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法（UPLC-Q-TOF-MS/MS）對(duì)小鼠的尿樣和糞便進(jìn)行分析，采用靶向代謝組學(xué)驗(yàn)證結(jié)果，發(fā)現(xiàn)小檗堿可通過調(diào)節(jié)氨基酸代謝、脂肪代謝等改善UC，此研究從代謝組學(xué)角度探討了小檗堿治療UC 的作用機(jī)制。Qu等[24]采用UPLC-MS/MS 法，以代謝物圖譜和靶向代謝物分析來(lái)表征廣藿香醇給予UC 小鼠后血漿中小分子代謝物的變化，結(jié)果揭示了廣藿香醇治療UC 的作用機(jī)制。

1.3 基于腸道微生態(tài)研究中藥復(fù)方對(duì)UC 的作用機(jī)制腸道微生態(tài)（Intestinal Microecology）由腸道菌群及其腸道環(huán)境構(gòu)成，腸道菌群包括生活在人類腸道中的所有微生物，影響人類健康和疾病治療[25-28]。近年來(lái)，很多研究已經(jīng)認(rèn)識(shí)到UC 的發(fā)生發(fā)展與腸道菌群的紊亂具有一定的關(guān)系，腸道菌群與黏膜免疫系統(tǒng)間的相互作用可能也是其發(fā)生和反復(fù)發(fā)作的重要原因之一[29-31]。因此，UC 的發(fā)生發(fā)展及治療與腸道菌群之間緊密相關(guān)。大量研究表明，中醫(yī)藥可改善腸道菌群，在預(yù)防和治療UC 等疾病中發(fā)揮重要作用[32-35]。Cui 等[36]發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可通過改善腸道屏障功能，調(diào)節(jié)腸道微生物區(qū)系，可改善DSS 誘導(dǎo)的UC。Li 等[37]發(fā)現(xiàn)積雪草乙醇提取物對(duì)DSS 誘導(dǎo)的UC具有顯著療效，其抗炎作用可能有賴于黏膜屏障和腸道微生物區(qū)系穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)。Zhou 等[38]通過16S rRNA 分析腸道微生物區(qū)系組成、Western Blotting 檢測(cè)磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K/Akt）信號(hào)通路相關(guān)蛋白，明確了左金丸可能是通過激活PI3K/Akt 信號(hào)通路來(lái)達(dá)到減輕UC 癥狀的目的。

2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)與腸道微生態(tài)的內(nèi)在關(guān)系及其在中藥復(fù)方治療UC 作用機(jī)制的整合應(yīng)用

2.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)與代謝組學(xué) 轉(zhuǎn)錄組學(xué)作為基因表達(dá)的媒介，集合了許多差異表達(dá)基因和大量調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的信息，與生物樣品的基因組有直接聯(lián)系。而代謝組學(xué)可呈現(xiàn)生物樣本在代謝層面上的生理狀態(tài)，是構(gòu)成生物樣本復(fù)雜表型的基礎(chǔ)，反映了細(xì)胞功能和表型的變化情況[9-11]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)的聯(lián)合應(yīng)用能實(shí)現(xiàn)對(duì)時(shí)序表達(dá)的差異基因與差異代謝物進(jìn)行共表達(dá)分析[39]，探索差異基因和差異代謝物之間的關(guān)聯(lián)性，確定代謝通路、找到關(guān)鍵的差異表達(dá)基因，最后闡明其具有的潛在生物學(xué)意義[40-41]?；谏镄畔W(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)的聯(lián)合分析在挖掘關(guān)鍵差異表達(dá)基因和關(guān)鍵代謝途徑等方面表現(xiàn)出強(qiáng)大優(yōu)勢(shì)，能夠更加全面、更加系統(tǒng)透徹地分析生物樣本的作用機(jī)制及復(fù)雜的分子功能。Bjerrum 等[42]采用全基因組方法對(duì)患者活檢的降結(jié)腸進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析，并用核磁方法研究其代謝組學(xué)，鑒定生物標(biāo)記物和探索UC 作用機(jī)制。結(jié)果表明結(jié)合兩種方法的優(yōu)點(diǎn)可優(yōu)化UC 患者用藥，使個(gè)性化用藥成為可能。

2.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)與腸道微生態(tài) 20 世紀(jì)興起的宏基因組學(xué)很大程度上解決了大部分微生物因不能分離培養(yǎng)而難于研究的問題，避免了其他固有技術(shù)（如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）在應(yīng)用中易出現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)偏差，同時(shí)也免去了一些費(fèi)時(shí)耗力的實(shí)驗(yàn)步驟（如文庫(kù)構(gòu)建）[43]。但是該技術(shù)仍無(wú)法對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)及代謝，特別是無(wú)法明確微生物因適應(yīng)環(huán)境而做出的響應(yīng)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)可以將特定條件下的生物群落及其功能聯(lián)系到一起，對(duì)群體整體進(jìn)行各種相關(guān)功能的研究，能夠直接檢測(cè)轉(zhuǎn)錄的活性基因，聚焦于樣品中活性群落，降低群落的復(fù)雜度[44]。此方法能夠描述微生物群落中的代謝活性成分，為鑒定和分析微生物群落特異性變種的關(guān)鍵功能基因提供了新方法。Li 等[45]采用轉(zhuǎn)錄組和16S rDNA 測(cè)序的方法研究飛揚(yáng)腸胃炎膠囊對(duì)UC 小鼠的作用機(jī)制。結(jié)果表明飛揚(yáng)腸胃炎膠囊可通過改善腸道菌群、調(diào)節(jié)炎性因子、抑制抑瘤素M（OSM）/抑瘤素M 受體（OSMR）途徑發(fā)揮治療作用，闡明了飛揚(yáng)腸胃炎膠囊對(duì)UC 小鼠的保護(hù)作用機(jī)制。

2.3 代謝組學(xué)與腸道微生態(tài)學(xué) 目前，對(duì)腸道微生物的研究多采用宏基因組，又叫微生物環(huán)境基因組學(xué)、元基因組學(xué)。它是以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對(duì)象，以功能基因篩選和測(cè)序分析為研究手段，直接提取環(huán)境樣品中的宏基因組進(jìn)行高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析，可提供大量的基因信息，用于研究腸道微生物系統(tǒng)的多樣性，并可提供腸道微生物潛在的功能信息，從而成為菌群多樣性和功能相結(jié)合研究的工具。然而，鑒定人體腸道哪一種微生物執(zhí)行特定的代謝轉(zhuǎn)化，以及腸道菌群代謝產(chǎn)物對(duì)腸道疾病或腸道健康的作用是微生物學(xué)家一直面臨的挑戰(zhàn)。代謝組獲得的內(nèi)源性成分是在代謝酶的作用下生成最終產(chǎn)物，離生物的表型或生理狀態(tài)最近。與疾病表型相關(guān)的特定代謝物可以通過基于糞便、血漿、尿液或其他生物體液的質(zhì)譜或核磁共振代謝組學(xué)進(jìn)行鑒定，揭示基因和表現(xiàn)型之間的關(guān)系，達(dá)到監(jiān)測(cè)和推斷基因功能的目的[47]。因此，代謝組學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)合腸道菌群進(jìn)行分析，既可發(fā)現(xiàn)物種間的關(guān)系，也能找出微生物與代謝途徑之間一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系[46]。Su 等[47]采用16S rDNA 測(cè)序技術(shù)和氣相色譜-質(zhì)譜法探討五味子多糖對(duì)DSS 誘導(dǎo)的小鼠UC 的作用及其機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)五味子多糖能將炎癥因子調(diào)節(jié)到正常水平，同時(shí)能顯著調(diào)節(jié)腸道微生物區(qū)系的平衡。Fan 等[48]通過16S rRNA 測(cè)序分析腸道微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)，對(duì)寄主和微生物在結(jié)腸中的代謝物進(jìn)行代謝組學(xué)分析來(lái)確定芍藥苷治療UC 的作用機(jī)制。結(jié)果表明芍藥苷通過調(diào)節(jié)腸道微生物產(chǎn)生的吲哚-3-乳酸和上皮細(xì)胞自噬，從而減輕小鼠結(jié)腸炎癥狀。Zou 等[49]采用16S rRNA 基因測(cè)序和代謝組學(xué)相結(jié)合的方法研究理中湯對(duì)UC 小鼠的治療作用，發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)與腸道炎癥相關(guān)的條件致病菌減少、益生菌增加，糞便代謝物中腺苷降低、膽酸增加等，提示理中湯對(duì)UC 小鼠的作用機(jī)制可能通過調(diào)節(jié)腸道微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)和糞便代謝物譜來(lái)實(shí)現(xiàn)。

3 討論

目前，針對(duì)UC 的中醫(yī)藥作用機(jī)制研究，多數(shù)僅通過單一手段從單一因素入手，并未考慮UC 的發(fā)生發(fā)展不僅與遺傳易感性、免疫調(diào)節(jié)等宿主因素相關(guān)，也與腸道微生態(tài)失衡密切相關(guān)。盡管轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)、腸道微生態(tài)等單一分析方法可以提供不同生命進(jìn)程或者疾病組與正常組及藥物干預(yù)組相比的差異生物信息，然而，這些分析往往具有局限性。基于UC 病因病機(jī)復(fù)雜、病程纏綿難愈且并發(fā)癥多等特點(diǎn)，很難用單一的理論模式闡明UC 的發(fā)病機(jī)制。如轉(zhuǎn)錄組學(xué)也只限于對(duì)基因表達(dá)方面的研究；代謝組學(xué)能夠直接反映生物表型，但對(duì)微生物的多樣性、基因表達(dá)方面的研究不足；腸道菌群研究可以測(cè)定腸道微生物多樣性等，但無(wú)法明確微生物適應(yīng)環(huán)境而做出的響應(yīng)。

隨著大數(shù)據(jù)時(shí)代的到來(lái)，高通量、高效的多組學(xué)聯(lián)合分析已成為必然趨勢(shì)。多組學(xué)聯(lián)合分析通過將基因、mRNA、調(diào)控因子、蛋白、代謝等不同層面的信息進(jìn)行整合，構(gòu)建基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，深層次理解各個(gè)分子之間的調(diào)控及因果關(guān)系，從而更深入地認(rèn)識(shí)疾病進(jìn)程和藥物作用機(jī)理。簡(jiǎn)言之，多組學(xué)整合分析技術(shù)除了提供數(shù)據(jù)的拼接及挖掘，更是為基礎(chǔ)生物學(xué)以及疾病發(fā)病機(jī)制和藥物作用機(jī)制研究提供了新思路，在探究UC 的發(fā)病機(jī)制和治療方面可提供極大的幫助。因此，基于現(xiàn)代多組學(xué)技術(shù)整合對(duì)于UC的作用機(jī)制解讀擁有巨大優(yōu)勢(shì)，越來(lái)越多的研究者通過兩種或兩種以上組學(xué)研究方法從基因、菌群以及代謝產(chǎn)物等水平共同解釋UC 病變過程及中藥復(fù)方作用機(jī)制等科學(xué)問題。因此建議，應(yīng)充分利用中藥復(fù)方治療優(yōu)勢(shì)，克服其成分不清、機(jī)理不明等不足，基于多組學(xué)策略研究，結(jié)合多組學(xué)的數(shù)據(jù)集進(jìn)行多層次關(guān)聯(lián)分析，全面系統(tǒng)地闡釋UC 疾病特征，才能更加深入地了解UC 的發(fā)病機(jī)制，為UC 的中醫(yī)藥防治提供新的思路與途徑。