基于HIF-1α/VEGF-α 信號通路探討南續(xù)益母顆粒抑制膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎小鼠滑膜血管翳生成的作用機(jī)制

鄭雪霞，錢凱，韓玉鳳，劉小寶，許舒迪，鐘曉琴，劉敏瑩，林昌松（. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 50405；.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 50405）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一種常見的風(fēng)濕免疫疾病，其主要病理特征為持續(xù)性的滑膜炎和血管翳形成，導(dǎo)致滑膜增生、骨及軟骨的破壞[1-2]。血管翳中的新生血管可能是維持和促進(jìn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)展的核心因素[3]。越來越多的證據(jù)表明，缺氧和缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）在RA 血管生成的病理進(jìn)程中起關(guān)鍵作用[4]。血管內(nèi)皮生長因子α（VEGF-α）是HIF-1α 關(guān)鍵的下游效應(yīng)分子[5]，能夠促使內(nèi)皮細(xì)胞活化、增殖與遷移，從而形成新生血管[6]。因此，阻斷HIF-1α/VEGF-α 信號通路的激活，可能改善RA 病理性血管新生。

南續(xù)益母方為本課題組林昌松教授的經(jīng)驗(yàn)方，對RA 和骨關(guān)節(jié)炎等風(fēng)濕疾病具有較好療效，已被開發(fā)為廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑南續(xù)益母顆粒（粵藥制備字Z20200139000），廣泛應(yīng)用于臨床。本課題組前期研究[7]發(fā)現(xiàn)，南續(xù)益母方的潛在有效成分β-谷甾醇能通過VEGF 信號通路減少膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎（CIA）小鼠滑膜血管生成，從而減輕小鼠關(guān)節(jié)腫脹和骨破壞。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析[8]顯示，南續(xù)益母方可能通過HIF-1 信號通路發(fā)揮對RA 的治療作用。但南續(xù)益母方對RA 動物及細(xì)胞模型的作用及機(jī)制仍有待深入探索。因此本研究擬建立CIA 小鼠模型，基于HIF-1α/VEGF-α 信號通路探討南續(xù)益母顆粒對其滑膜血管翳生成的作用及可能機(jī)制，以期為南續(xù)益母顆粒治療RA 提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 DBA/1 雄性小鼠40 只，SPF 級，7～8 周齡，體質(zhì)量（18±2）g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0008，動物質(zhì)量合格證號：110322210100842268。動物飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心SPF 級動物房，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（粵）2018-0092。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，倫理批文號：TCMF1-2021018。

1.2 藥物及試劑 南續(xù)益母顆粒（批號：20210101），廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院；注射用甲氨蝶呤（Methotrexate，批號：02191103），山西普瑞藥業(yè)有限公司。牛Ⅱ型膠原（批號：20022）、完全弗氏佐劑（批號：7001）及不完全弗氏佐劑（批號：7002），均購自美國Chondrex 公司；番紅O 染液（批號：S8884）、固綠染液（批號：F7252），均購自美國Sigma 公司；HE 染液（批號：SBJ-0446），南京森貝伽生物科技有限公司；缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）抗體（批號：AF6191）、血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1（CD31）抗體（批號：AF1009）、血管內(nèi)皮生長因子α（VEGF-α）抗體（批號：AF5131），均購自江蘇親科生物研究中心有限公司；山羊抗兔二抗（批號：111-035-003），美國Jackson Immuno Research 公司；C-反應(yīng)蛋白（CRP）測定試劑盒（批號：21110676M1）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）測定試劑盒（批號：21100363-1）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）測定試劑盒（批號：21090881-1）、尿素氮（BUN）測定試劑盒（批號：20210800048-1）、肌酐（CR）測定試劑盒（批號：21101021M1）、類風(fēng)濕因子（RF）測定試劑盒（批號：21101027M1），均購自桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子有限公司。

1.3 主要儀器 JJ-12J 型脫水機(jī)、JB-P5 型包埋機(jī)、JB-L5 凍臺、RM2016 型病理切片機(jī)，上海徠卡儀器有限公司；KD-P 型組織攤片機(jī)，浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司；DHG-9140A 型烤箱，上?；厶﹥x器制造有限公司；MilliQAcademic 型超純水系統(tǒng)，美國Millipore 公司； URIT-8021A 型全自動生化分析儀，桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子有限公司；Neofuge 18R型臺式高速冷凍離心機(jī)，力新儀器上海有限公司；Skyscan1172 型高分辨率微型計(jì)算機(jī)斷層攝影術(shù)（Micro- CT）掃 描 儀， 比 利 時(shí) Bruker 公 司；Pannoramic MIDI 型數(shù)字病理切片掃描系統(tǒng)，匈牙利3D HISTEC 公司。

1.4 分組、模型復(fù)制及給藥 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為4 組：正常組、模型組、甲氨蝶呤組、南續(xù)益母顆粒組，每組10 只。按照課題組前期方法制備膠原及佐劑的乳化劑，除正常組外，采用二次免疫法復(fù)制CIA 小鼠模型[9]。初次免疫時(shí)間記錄為第0 天，二次免疫時(shí)間為第21 天，于第22 天開始給予相應(yīng)藥物灌胃，小鼠灌胃體積為10 μL·g-1。南續(xù)益母顆粒組給藥劑量為12.33 g·kg-1（相當(dāng)于臨床等效劑量的12 倍），每天灌胃1 次，連續(xù)30 d；甲氨蝶呤組給藥劑量為1 mg·kg-1，每3 d 灌胃1 次，其余時(shí)間點(diǎn)以等體積生理鹽水灌胃，連續(xù)30 d；正常組及模型組給予等體積生理鹽水灌胃，每天1 次，連續(xù)30 d。

1.5 小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)（Arthritis Index，AI）評分 于二次免疫后每3 d 觀察記錄小鼠足腫脹情況，并進(jìn)行AI 評分。采用4 分制的評分標(biāo)準(zhǔn)[10]，每只小鼠最高分為16 分，以AI 評分＞4 分為造模成功評判標(biāo)準(zhǔn)。

1.6 血清生化指標(biāo)檢測 給藥30 d 后，采用異氟烷吸入麻醉小鼠，摘眼球取血；在4 ℃下靜置1 h 后，以4 ℃、1 000 r·min-1（離心半徑18 cm）離心20 min，分離上清，分裝至EP 管內(nèi)，置于-80 ℃冰箱保存。按照試劑盒說明書步驟操作，采用全自動生化分析儀檢測各組小鼠血清中CRP、RF、AST、ALT、CR、BUN 水平。

1.7 HE 染色法觀察小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜病理變化 小鼠踝關(guān)節(jié)固定于4%福爾馬林中48 h 后，使用10%EDTA 溶液進(jìn)行脫鈣，直至用針刺入組織無阻力感為止。將脫鈣后的組織放于脫水盒內(nèi)，于脫水機(jī)內(nèi)依次用梯度乙醇進(jìn)行脫水、包埋和切片。切片脫蠟至水化，以Mayer 氏蘇木素染細(xì)胞核，伊紅染細(xì)胞質(zhì)，脫水封片后在顯微鏡下觀察。進(jìn)行組織學(xué)評分，滑膜血管：HE 染色5 個(gè)高倍鏡視野下滑膜血管數(shù)目，取平均值；滑膜炎癥：HE 染色5 個(gè)高倍鏡視野下單核炎癥細(xì)胞浸潤情況；以及對滑膜增生程度進(jìn)行評分，具體方法及評分標(biāo)準(zhǔn)[11]見表1。

表1 關(guān)節(jié)組織學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Joint histologic scoring

1.8 番紅固綠染色法觀察小鼠踝關(guān)節(jié)軟骨及骨質(zhì)結(jié)構(gòu)變化 切片步驟同“1.7”項(xiàng)下，石蠟切片脫臘至水化，先后予番紅O 及固綠染色，脫水封片后在顯微鏡下觀察。進(jìn)行組織學(xué)評分，軟骨侵襲：評估軟骨丟失的比例；骨破壞：在不同倍鏡視野下評估骨質(zhì)破壞程度。具體方法及評分標(biāo)準(zhǔn)[11]見表1。

1.9 Micro-CT 三維重建觀察小鼠踝關(guān)節(jié)骨皮質(zhì)表面變化 將小鼠踝關(guān)節(jié)整體用4%多聚甲醛溶液固定后，采用高分辨率的Skyscan 1172 型Micro-CT 系統(tǒng)對骨骼架構(gòu)進(jìn)行了掃描分析。掃描參數(shù)：分辨率為5 μm，電壓為80 kV，電流為88 μA。掃描完成后使用CT-vox 軟件進(jìn)行三維重建。

1.10 免疫組化法檢測小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜CD31、HIF-1α及VEGF-α 的表達(dá) 切片步驟同“1.7”項(xiàng)下，切片脫蠟至水化，枸櫞酸修復(fù)；封閉后滴加一抗［CD31（1∶50）、HIF-1α（1∶200）、VEGF-α（1∶50）］，4 ℃下孵育12 h；加入二抗（1∶200）后在37 ℃下孵育30 min；然后進(jìn)行DAB 顯色、蘇木素復(fù)染、鹽酸乙醇分化、梯度乙醇脫水、二甲苯透明，最終晾干封片。利用數(shù)字病理掃描儀進(jìn)行玻片掃描，在關(guān)節(jié)部位選取3 個(gè)視野，利用ImageJ 軟件進(jìn)行積分光密度值（IOD/Area）計(jì)算，取均數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析[12]。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計(jì)量資料滿足正態(tài)分布，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（Oneway ANOVA）， 若方差齊性則兩兩比較使用Bonferroni 分析，方差不齊使用Tamhane’s T2 法。計(jì)量資料不符合正態(tài)分布者，采用非參數(shù)分析，用中位數(shù)M（下四分位數(shù)P25，上四分位數(shù)P75）表示。重復(fù)測量數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布及方差齊性者采用重復(fù)測量方差分析，不符合正態(tài)分布及方差齊性者采用重復(fù)測量-廣義線性模型估計(jì)方程；以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 南續(xù)益母顆粒對CIA 小鼠踝關(guān)節(jié)腫脹的影響 結(jié)果見圖1、圖2。與正常組比較，模型組小鼠的踝關(guān)節(jié)及足面明顯腫脹，活動度明顯受限，AI 評分顯著升高（P＜0.001）。與模型組比較，甲氨蝶呤組和南續(xù)益母顆粒組小鼠的踝關(guān)節(jié)及足面紅腫均有改善，小鼠關(guān)節(jié)活動度基本正常，AI 評分顯著下降（P＜0.01）。結(jié)果表明，南續(xù)益母顆粒能明顯改善CIA 小鼠的關(guān)節(jié)腫脹程度。

圖1 南續(xù)益母顆粒對膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎小鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度的影響Figure 1 Effect of Nanxu Yimu Granules on ankle swelling in collagen-induced arthritis mice

圖2 南續(xù)益母顆粒對膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）評分的影響［M（P25，P75），n=10］Figure 2 Effect of Nanxu Yimu Granules on arthritis index score of collagen-induced arthritis mice［M（P25，P75），n=10］

2.2 南續(xù)益母顆粒對CIA 小鼠血清生化指標(biāo)的影響結(jié)果見圖3。各組小鼠之間的血清AST、ALT、BUN、CR、RF 水平無明顯變化（P＞0.05）。與正常組比較，模型組小鼠血清中的炎癥指標(biāo)CRP 水平顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，甲氨蝶呤組小鼠血清CRP 水平明顯下降（P＜0.05），南續(xù)益母顆粒組小鼠血清CRP 水平有一定程度下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果表明，南續(xù)益母顆粒對CIA小鼠有一定的抗炎作用，且對肝腎功能無明顯毒性。

圖3 南續(xù)益母顆粒對膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎小鼠血清生化指標(biāo)的影響［M（P25，P75）/（±s），n=10］Figure 3 Effect of Nanxu Yimu Granules on serum indicators in collagen-induced arthritis mice［M（P25，P75）/（±s），n=10］

2.3 南續(xù)益母顆粒對CIA 小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜病理變化的影響 結(jié)果見圖4、圖5。與正常組比較，模型組小鼠踝關(guān)節(jié)可見顯著滑膜增生（P＜0.001）和炎性浸潤（P＜0.001），血管數(shù)量顯著增加（P＜0.001）。與模型組比較，甲氨蝶呤組和南續(xù)益母顆粒組小鼠踝關(guān)節(jié)的滑膜增生和炎性浸潤均明顯減輕（P＜0.05），血管數(shù)量顯著減少（P＜0.01，P＜0.001）。結(jié)果表明，南續(xù)益母顆粒能減輕CIA 小鼠踝關(guān)節(jié)的滑膜病理改變。

圖4 南續(xù)益母顆粒對膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜病理變化的影響（HE 染色）Figure 4 Effect of Nanxu Yimu Granules on pathological changes of ankle synovium in mice with collagen-induced arthritis（HE staining）

圖5 南續(xù)益母顆粒對膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜病理變化的影響［M（P25，P75）/（±s），n=10］Figure 5 Effect of Nanxu Yimu Granules on pathological changes of ankle synovium in mice with collagen-induced arthritis［M（P25，P75）/（±s），n=10］

2.4 南續(xù)益母顆粒對CIA 小鼠踝關(guān)節(jié)軟骨及骨質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的影響 結(jié)果見圖6、圖7。與正常組比較，模型組小鼠踝關(guān)節(jié)可見顯著軟骨侵襲和骨破壞（P＜0.001）。與模型組比較，甲氨蝶呤組和南續(xù)益母顆粒組小鼠踝關(guān)節(jié)軟骨侵襲明顯改善（P＜0.05），骨破壞程度明顯減輕（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明，南續(xù)益母顆粒能減輕CIA 小鼠踝關(guān)節(jié)的軟骨及骨質(zhì)病理改變。

圖7 南續(xù)益母顆粒對膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎小鼠踝關(guān)節(jié)軟骨及骨質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的影響［M（P25，P75）/（±s），n=10］Figure 7 Effects of Nanxu Yimu Granules on the changes of ankle cartilage and bone structure in mice with collagen-induced arthritis［M（P25，P75）/（±s），n=10］

2.5 南續(xù)益母顆粒對CIA 小鼠踝關(guān)節(jié)骨皮質(zhì)表面變化的影響 結(jié)果見圖8。與正常組比較，模型組小鼠踝關(guān)節(jié)骨質(zhì)出現(xiàn)明顯局灶性侵蝕，骨表面失去光滑及完整性，部分關(guān)節(jié)融合呈強(qiáng)直狀。與模型組比較，南續(xù)益母顆粒組和甲氨蝶呤組小鼠踝關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞程度明顯減輕，骨表面輕度粗糙，小部分存在局灶性侵蝕。結(jié)果提示，南續(xù)益母顆粒可明顯抑制CIA 小鼠的骨質(zhì)破壞。

圖8 南續(xù)益母顆粒對膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎小鼠踝關(guān)節(jié)骨皮質(zhì)表面變化的影響Figure 8 Effect of Nanxu Yimu Granules on the changes of ankle cortical bone surface in mice with collagen-induced arthritis

2.6 南續(xù)益母顆粒對CIA 小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜CD31、HIF-1α、VEGF-α 蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果見圖9、圖10。與正常組比較，模型組小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜中CD31 免疫組化染色突出的血管數(shù)量明顯增加，CD31、HIF-1α、VEGF-α 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.001）。與模型組比較，甲氨蝶呤組和南續(xù)益母顆粒組小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜血管數(shù)量減少，CD31、HIF-1α、VEGF-α 蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明，南續(xù)益母顆粒能明顯抑制滑膜血管翳的生成，可能與抑制HIF-1α/VEGF-α 信號通路相關(guān)。

圖9 南續(xù)益母顆粒對膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜CD31、HIF-1α、VEGF-α 蛋白表達(dá)的影響（免疫組化，×400）Figure 9 Effects of Nanxu Yimu Granules on protein expressions of CD31，HIF-1α and VEGF-α in ankle joints of mice with collageninduced arthritis（IHC，×400）

圖10 南續(xù)益母顆粒對膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜CD31、HIF-1α、VEGF-α 蛋白表達(dá)的影響（±s，n=10）Figure 10 Effects of Nanxu Yimu Granules on protein expressions of CD31，HIF-1α and VEGF-α in ankle joints of mice with collagen-induced arthritis（±s，n=10）

3 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是以慢性滑膜炎為特征的自身免疫性疾病，全球發(fā)病率約為1%[13]。其病理過程主要包括滑膜增生、炎性細(xì)胞浸潤、血管生成、血管翳形成、軟骨侵襲和骨組織破壞等，其中新生血管生成被認(rèn)為是RA 疾病進(jìn)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[14]。滑膜中的新生血管促進(jìn)滑膜增生和血管翳的形成，是關(guān)節(jié)病變和軟骨損壞的重要因素。靶向新生血管生成已成為治療RA 的熱點(diǎn)方向，但目前尚未有相關(guān)抑制劑及抗體能夠應(yīng)用于臨床[15]。

RA 屬中醫(yī)學(xué)“痹病”“歷節(jié)病”范疇，其病因病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，肝腎虧虛為本，風(fēng)寒濕外邪為標(biāo)，久致痰瘀阻滯經(jīng)脈[16]。中醫(yī)理論中尚未有血管翳的相關(guān)描述，根據(jù)現(xiàn)代研究[17-19]解讀，血管翳實(shí)質(zhì)上是一種病理產(chǎn)物，與中醫(yī)理論中“氣滯血瘀”“氣血痹阻”“絡(luò)脈瘀阻”等理論相契合，故以祛濕化瘀通脈治療RA 具有一定療效。研究[20-21]發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方/有效成分可作為血管生成抑制劑對RA 動物模型發(fā)揮作用。本課題組林昌松教授通過臨床實(shí)踐，總結(jié)該病病機(jī)為“風(fēng)濕瘀阻，筋傷骨損”，臨床應(yīng)用祛濕通脈法治療RA 取得較好療效[22]。南續(xù)益母顆粒系祛濕通脈法代表方之一，以嶺南道地祛風(fēng)濕藥材衛(wèi)矛科南蛇藤屬植物南蛇藤為君，祛風(fēng)除濕、通經(jīng)止痛；以續(xù)斷為臣，補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨；以益母草活血通脈消腫；佐以紅景天扶正補(bǔ)虛、活血行血。

本研究采用DBA/1 小鼠進(jìn)行二次免疫建立CIA模型，探討南續(xù)益母顆粒對RA 動物模型的作用及可能機(jī)制。DBA/1 小鼠品系是CIA 經(jīng)典小鼠模型，具有發(fā)病率高、可重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，其成模率在80%～100%之間，通常在初次免疫后第21～28 天發(fā)病[10]。CIA 小鼠模型為經(jīng)典的RA 動物模型，與RA 具有相似的滑膜炎和骨破壞等病理特征[23]。CIA 模型的主要特征是自身膠原的耐受性破壞和自身抗體的產(chǎn)生，但該模型不存在類風(fēng)濕因子（RF）升高[24]，這與本研究結(jié)果相符。初次免疫后第24～30 天之間，CIA 小鼠AI 評分均高于4 分，成模率可達(dá)100%[25]。甲氨蝶呤是治療RA 的一線用藥，研究[7，26]證實(shí)甲氨蝶呤對RA動物模型具有明顯治療作用，故本研究將其作為陽性對照藥物。經(jīng)過甲氨蝶呤和南續(xù)益母顆粒治療后，CIA 小鼠踝關(guān)節(jié)炎癥得到緩解，AI 評分明顯下降。結(jié)合HE 及番紅固綠染色及Micro-CT 結(jié)果，甲氨蝶呤和南續(xù)益母顆粒能明顯改善CIA 小鼠踝關(guān)節(jié)滑膜增生、炎性浸潤、血管新生、軟骨侵襲及骨質(zhì)破壞等病理改變。CRP 是RA 臨床常用于評估疾病活動的炎性指標(biāo)，在多種慢性炎性疾病中起著重要的調(diào)節(jié)作用。CRP 水平與RA 嚴(yán)重程度和進(jìn)展呈正相關(guān)，能作為CIA 動物模型的藥效評價(jià)指標(biāo)之一[27-29]。甲氨蝶呤和南續(xù)益母顆粒能不同程度降低CIA 小鼠血清CRP 水平，具有一定的抗炎作用。

研究[30]表明，炎癥、免疫失衡和缺氧是RA 滑膜新生血管形成的主要原因。HIF-1α 是在RA 缺氧滑膜中高表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，與RA 滑膜新生血管生成密切相關(guān)。在缺氧條件下，HIF-1α 在細(xì)胞質(zhì)中穩(wěn)定存在并累積，繼而轉(zhuǎn)位入核，通過啟動下游眾多基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)而參與多種生理病理過程[37]。VEGF-α是HIF-1α 調(diào)控的關(guān)鍵下游基因之一，具有調(diào)控血管生成的作用[31]。大量研究[32-33]證實(shí)，RA 患者的血清、滑膜組織和體液中存在高水平的VEGF-α。阻滯VEGF 信號通路，能夠顯著減少CIA 小鼠滑膜血管翳的生成[7，34]。因此，阻斷HIF-1α/VEGF-α 信號通路的激活，或能改善RA 病理性血管新生。本研究中，采用CD31 作為評判RA 滑膜血管翳數(shù)量的指標(biāo)[25]。CD31 是一種內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白，其免疫組化染色可將部分滑膜微血管突出標(biāo)志，常作為血管生成的觀察指標(biāo)[35]。本研究發(fā)現(xiàn)，南續(xù)益母顆粒能減少CIA 小鼠關(guān)節(jié)滑膜CD31 的表達(dá)，抑制滑膜血管翳的生成，同時(shí)HIF-1α、VEGF-α 蛋白在滑膜中的表達(dá)明顯下降。結(jié)果提示南續(xù)益母顆粒或通過介導(dǎo)HIF-1α/VEGF-α 通路減少CIA 小鼠滑膜血管翳的形成。

綜上所述，南續(xù)益母顆粒對CIA 模型小鼠有明顯的治療作用，能夠顯著改善關(guān)節(jié)腫脹癥狀及其病理變化，抑制關(guān)節(jié)滑膜血管翳形成，其作用機(jī)制可能與抑制HIF-1α/VEGF-α 信號通路激活相關(guān)。本研究初步探討了南續(xù)益母顆粒抑制CIA 小鼠血管翳的作用和機(jī)制，可為進(jìn)一步拓展其在臨床上的應(yīng)用及相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。