薏苡附子敗醬散對腸上皮細胞屏障損傷的保護作用研究

彭君偉，周 帆，陳 江

（1.復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院閔行院區(qū)中西醫(yī)結(jié)合科，上海 220240；2.湖州市第三人民醫(yī)院內(nèi)科，浙江 湖州 313002；3.南京中醫(yī)藥大學蘇州附屬醫(yī)院脾胃病科， 江蘇 蘇州 215009）

薏苡附子敗醬散近年來被應用到潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）及炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌（colitis-associated colorectal cancer，CAC）的治療當中，取得較好的臨床療效[5-6]。研究證實，薏苡附子敗醬散具有調(diào)節(jié)免疫、減輕炎癥反應、促進腸黏膜修復等作用[7]，但其對于腸黏膜屏障的保護機制尚未闡明。薏苡附子敗醬散寒溫并用、虛實兼顧，契合UC及CRC 脾腎衰憊為本，濕熱毒邪為標的病機。本研究基于前期實驗結(jié)果[7]，建立脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）誘導的 IEC-6 細胞損傷模型，觀察薏苡附子敗醬散納入附子及單用附子的不同配伍對炎癥損傷下腸上皮細胞屏障的影響，以期為薏苡附子敗醬散治療UC和CAC 提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 大鼠小腸隱窩上皮細胞株（IEC-6），購自上海中喬新舟生物科技有限公司，貨號：ZQ0783。

1.2 藥物 全方組：薏苡仁30 g，附子6 g，敗醬草15 g；去附子組：薏苡仁30 g，敗醬草15 g；單用附子組：附子6 g，均購自蘇州市春暉堂藥業(yè)有限公司。各組藥液濃縮至1 g 生藥/mL，4℃保存。加入細胞前用完全培養(yǎng)基稀釋至所需濃度，并過濾除菌。

1.3 主要試劑與儀器 DMEM 培養(yǎng)液（美國GIBCO公司，批號：1993895）；四氮唑鹽（MTT，批號：EZ2811A179）；二甲基亞砜（AMERSCO 公司，批號：2015906）；ELISA 試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，批號：A382H80425、A306H80152）；RIPA裂解液（上?；鶢栴D生物，批號：BYL40825）；BCA蛋白定量試劑盒（Thermo 公司，批號：PICPI23223）；ZO-1（批號：AF5145）、Occludin 一抗（美國Affinity公司，批號：DF7504）；GAPDH（美國CST 公司，批號：#5174）。SpectraMax M2e 型酶標儀（Molecular Devices 公司）；Millicell ERS-2 型伏特歐姆計（美國Millipore 公司）。

1.4 確定全方組的實驗藥物濃度

1.4.1 薏苡附子敗醬散對LPS 誘導的IEC-6 細胞活力的影響 將IEC-6 細胞接種于96 孔細胞培養(yǎng)板，每孔100 uL（細胞數(shù)約1.0×105個）。設對照組、模型組和薏苡附子敗醬散不同濃度組，共7 組，每組5個復孔。各組細胞培養(yǎng)24 h 后，對照組換液，其余各組吸棄上清，加入10 μg/mL 以完全培養(yǎng)基稀釋的LPS 溶液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。之后對照組和模型組均加入100 μL 完全培養(yǎng)基，其余各組加入終濃度分別為0.5、1、5、10、20 mg/mL的以完全培養(yǎng)基稀釋的全方藥液。24 h 后，每孔加入5 mg/mL MTT 溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，吸棄上清，每孔加入150 μL DMSO，水平搖床震蕩，以酶標儀測定各孔吸光度（OD）值，比色選擇490 nm 波長。各組細胞活率=實驗組OD 值/對照組OD 值×100%。

1.4.2 薏苡附子敗醬散對LPS 誘導IEC-6 細胞TNF-α、IL-6 分泌量的影響 IEC-6 細胞接種于24 孔細胞培養(yǎng)板，每孔約1.0×106個細胞，每組5 個復孔，分組、干預方法同“1.4.1”。培養(yǎng)24 h 后，分別吸取上清液至EP 管中，3 000 r/min 離心10 min，按照試劑盒說明書檢測各組上清液中TNF-α 和IL-6 的含量。

1.5 全方、去附子和單用附子對LPS 誘導IEC-6 細胞活性的影響 IEC-6 細胞接種于96 孔細胞培養(yǎng)板，每孔約1.0×105個細胞，設對照組、模型組、全方組、去附子組和單用附子組，共5 組，每組5 個復孔。24 h后，對照組換液，其余各組加入10 μg/mL LPS 溶液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。之后對照組和模型組加入完全培養(yǎng)基，全方組加入終濃度為10 mg/mL 的全方稀釋液，8.82 mg/mL 去附子和1.18 mg/mL 單用附子稀釋液。24 h 后，以MTT 法檢測各組細胞活率。

1.6 全方、去附子和單用附子對LPS 誘導的IEC-6 細胞分泌TNF-α和IL-6的影響 分組、干預方法同“1.5”，按試劑盒說明書檢測各組細胞上清液中TNF-α 和IL-6的含量。

除此之外，筆者認為還有兩篇值得關(guān)注的文章，一篇是楊振之先生從哲學角度提出的“詩意棲居說”[27]，另一篇是胡傳東先生從進化心理學角度提出的“心理適應說”[28](筆者姑且這樣稱之)。本文認為，楊振之先生的“詩意地棲居”一定程度上切近了旅游的本質(zhì)。但由于其切入的路徑是哲學的思辨，邏輯上雖有說服力，但比較缺少科學和事實的說服力。本文認為與其說是“詩意地棲居”，不如說是“流動地棲居”“遷移地棲居”更能反映出旅游的動態(tài)性特征，也更符合人類發(fā)展演化的歷史事實。

1.7 全方、去附子和單用附子對LPS 誘導的IEC-6細胞緊密連接蛋白Occludin、ZO-1 表達的影響 將IEC-6 細胞漂洗后，加入裂解液后收集，12 000 r/min離心10 min。取上清液，采用BCA 試劑盒測定蛋白濃度。各組樣本經(jīng)分離、轉(zhuǎn)膜、孵育一抗洗滌；二抗經(jīng)HRP稀釋、孵育、洗滌等步驟，再加入顯影液曝光條帶。以GAPDH 作為內(nèi)參，通過Gel-PRO Analyzer 軟件分析各組結(jié)果。

1.8 全方、去附子和單用附子對LPS 誘導的IEC-6 細胞跨細胞單層電阻的影響 將IEC-6 細胞以5×105/孔接種于Millipore Transwell 24 孔板上室，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種第4 天開始，每2 天用Millicell ERS-2 伏特歐姆計監(jiān)測單層IEC-6 細胞的跨膜電阻值（TEER）。待TEER 上升到平臺期時，分組造模，方法同“1.5”。最后檢測各組細胞TEER。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，若符合正態(tài)分布資料數(shù)據(jù)組間比較采用單因素方差分析；若為非正態(tài)分布資料數(shù)據(jù)采用Mann-Whitney U 秩和檢驗。以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 全方對LPS 誘導IEC-6 細胞活性及炎癥因子表達的影響 與模型組比較，10 mg/mL 薏苡附子敗醬散明顯提高 LPS 損傷后的 IEC-6 細胞活率（P＜ 0.01），見表1，且明顯降低 TNF-α 和 IL-6 分泌量（P＜ 0.01），見表2，增強細胞活性和抗炎作用均最佳，故以10 mg/mL 作為全方組后續(xù)實驗濃度并以此換算出去附子組和單用附子組的濃度。

表1 不同濃度YFBS 對IEC-6 細胞活率比較（±s，n = 5）%

表1 不同濃度YFBS 對IEC-6 細胞活率比較（±s，n = 5）%

注：與對照組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△△P ＜0.01

組別細胞活率對照組100模型組70.94±4.25##0.5 mg/mL75.32±4.40 1 mg/mL80.86±4.21△△5 mg/mL85.25±4.43△△10 mg/mL88.87±5.97△△20 mg/mL82.80±5.45△△

表2 不同濃度YFBS 對IEC-6 細胞TNF-α 和IL-6 分泌量的影響（±s，n = 5） pg/mL

表2 不同濃度YFBS 對IEC-6 細胞TNF-α 和IL-6 分泌量的影響（±s，n = 5） pg/mL

注：與對照組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

組別TNF-αIL-6對照組 73.99±7.25117.71±4.69模型組106.45±7.12##149.20±6.32##0.5 mg/mL103.39±5.21147.08±6.16 1 mg/mL 98.51±4.93△142.48±4.68 5 mg/mL 91.67±5.00 △△133.63±7.00 △△10 mg/mL 83.12±5.25 △△124.06±7.06 △△20 mg/mL 95.24±5.71 △△135.92±8.28 △△

2.2 全方、全方去附子和單用附子對LPS 誘導的IEC-6 細胞活性的影響 3 組均能提高LPS 損傷后的IEC-6 細胞活率（P＜0.05），但以全方組最高，去附子組次之，單用附子組最低，見表3。

表3 各組IEC-6 細胞活率比較（±s，n = 5） %

表3 各組IEC-6 細胞活率比較（±s，n = 5） %

注：與對照組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；與全方組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01；與去附子組比較，**P ＜0.01

組別細胞活率對照組100模型組69.62±6.58##全方組88.27±1.46△△去附子組82.90±3.68△△▲單用附子組74.21±4.17△▲▲**

2.3 全方、去附子和單用附子對LPS 誘導的IEC-6 細胞TNF-α 和IL-6 分泌量的影響 全方和去附子組均可明顯降低LPS 誘導下TNF-α 和IL-6 分泌量（P＜0.01），且全方和去附子組效應相當（P＞0.05），單用附子組無明顯作用（P＞0.05），見表4。

表4 各組IEC-6 細胞TNF-α 和IL-6 分泌量的比較（±s，n = 5） pg/mL

表4 各組IEC-6 細胞TNF-α 和IL-6 分泌量的比較（±s，n = 5） pg/mL

注：與對照組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△△P ＜0.01；與全方組比較，▲▲P ＜0.01；與去附子組比較，*P ＜0.05

組別TNF-αIL-6對照組 66.52±5.91110.79±8.19模型組110.65±7.37##143.12±9.62##全方組 89.58±7.84△△119.10±8.00△△去附子組 93.18±2.82△△122.47±6.18△△單用附子組103.69±5.46▲▲*133.60±6.84▲▲*

2.4 全方、去附子和單用附子對LPS 誘導的IEC-6 細胞ZO-1 和Occludin 蛋白表達的影響 3 組均可減輕

LPS 對ZO-1 蛋白的破壞，3 組間兩兩比較均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），即ZO-1 表達量全方組＞去附子組＞單用附子組。在Occludin 表達量上，全方組、去附子組均表達增高（P＜0.01），單用附子組無明顯作用（P＞0.05），見表5，如圖1。

圖1 各組IEC-6 細胞ZO-1、Occludin 蛋白表達量比較

表5 各組細胞ZO-1、Occludin 蛋白相對表達量（±s，n = 3） GAPDH

表5 各組細胞ZO-1、Occludin 蛋白相對表達量（±s，n = 3） GAPDH

注：與對照組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△△P ＜0.01；與全方組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01；與去附子組比較，**P ＜0.01

組別ZO-1Occludin對照組0.74±0.020.72±0.01模型組0.20±0.01##0.35±0.02##全方組0.59±0.02△△0.52±0.01△△去附子組0.55±0.01△△▲0.50±0.02△△單用附子組0.34±0.01△△▲▲**0.38±0.02▲▲**

2.5 全方、全方去附子和單用附子對LPS 誘導的IEC-6 細胞通透性的影響 與對照組相比，模型組TEER 值顯著下降（P＜0.01），與模型組相比，3 組均顯著升高TEER 值（P＜0.01）。各組相比，全方組TEER 最高（P＜0.01），去附子和單用附子組沒有明顯差異（P＞0.05），見表6。

表6 各組IEC-6細胞跨細胞單層電阻值（±s，n = 3）Ω·cm2

表6 各組IEC-6細胞跨細胞單層電阻值（±s，n = 3）Ω·cm2

注：與對照組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△△P ＜0.01；與全方組比較，▲▲P ＜0.01

組別TEER對照組627.8±9.18模型組276.8±7.50##全方組587.4±35.85△△去附子組461.4±31.75△△▲▲單用附子組463.2±49.39△△▲▲

3 討論

腸上皮細胞既能交換營養(yǎng)物質(zhì)，又充當著腸黏膜屏障的角色[8-9]。在病理狀態(tài)下，維持腸上皮細胞的適度增殖是重建腸上皮屏障完整性的重要環(huán)節(jié)[10-11]。TJs在電鏡下表現(xiàn)為緊密連接蛋白相互交錯，包繞在相鄰細胞的連接面上，以封閉細胞間隙。TJs 中的Occludin蛋白在調(diào)節(jié)細胞旁路滲透性中起到重要作用[12-13]。ZO-1 蛋白位于細胞質(zhì)內(nèi)膜表面，通過PDZ 結(jié)構(gòu)域與絕大多數(shù)緊密連接蛋白及細胞骨架相連[14]，對于維持TJ 的穩(wěn)固性發(fā)揮重要作用。此外，ZO-1 和Occludin還發(fā)揮著促進細胞黏附、維持上皮極性、調(diào)控細胞增殖分化等功能。兩者減少、缺失或移位均能引起腸上皮細胞間通透性的增加。腸上皮屏障的通透性可通過測定跨細胞電阻值（transepithelial electrical resistance，TEER）來反應，兩者成反比，即TEER 越大，細胞通透性越低[15]。

薏苡附子敗醬散中薏苡仁清熱利濕，消癰利腸[16]；敗醬草瀉熱解毒，祛瘀排膿[17-18]；少佐附子為妙用，既可扶助脾腎之陽以治本，又可辛通溫散，以利濕熱瘀毒排出。三藥共奏溫陽健脾、清熱祛濕解毒之功[19]。臨床實踐也表明，薏苡附子敗醬散加減對UC 具有較好的治療效果[20]。為此，我們建立以LPS 刺激IEC-6細胞模擬腸黏膜屏障功能損傷模型，觀察薏苡附子敗醬散納入附子及單用附子對炎癥損傷后腸黏膜屏障的影響進一步佐證溫陽解毒除濕治法治療UC 和CAC 的合理性。

實驗結(jié)果表明：全方組、去附子組均能夠提高LPS 損傷下IEC-6 細胞的活率，降低炎癥狀態(tài)下的TNF-α 和IL-6 分泌量，上調(diào)ZO-1、Occludin 的表達，降低跨膜電阻值，降低上皮屏障通透性。全方組在提高細胞活率作用強于去附子組；在降低TNF-α 和IL-6分泌上2 組作用相當；在增加ZO-1 蛋白表達上，全方組強于去附子組，而對Occludin 的表達，2 組作用相當。單味附子無明顯抗炎作用，但可以提高損傷細胞的活性，是全方良好增殖效應的基礎之一。另外，單味附子雖然只對ZO-1 蛋白促表達有明顯作用，但仍可明顯降低黏膜通透性究其原因可能附子主要作用于其他緊密連接蛋白或涉及其他機制。可見，薏苡仁+敗醬草主要作用在于抗炎、提高細胞活性，保護緊密連接蛋白；附子則主要集中在增強細胞活性、維持上皮屏障緊密性等作用，與前兩味藥相配使腸上皮屏障的保護作用發(fā)揮到最大。當然，全方的效應不是三味藥藥理作用的簡單疊加，而是各有側(cè)重，密切配合，其中的機制通路尚待進一步研究。