血府逐瘀湯及桔梗、牛膝對大鼠不同臟器中環(huán)核苷酸水平的影響*

吳承峰 劉 敏 陳菁菁 唐德才

（1.鐘山職業(yè)技術學院，江蘇 南京 210049；2.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210023）

目前在血府逐瘀湯的研究中，對于引經(jīng)藥桔梗、牛膝對全方效用的影響尚未見報道。筆者以慢性氣滯血瘀模型大鼠為載體，在前期研究基礎上［1-2］，采用ELISA法，觀察桔梗、牛膝不同配伍的血府逐瘀湯對血瘀證模型大鼠各臟器組織中 cAMP、cGMP含量及cAMP/cGMP比值的影響，以期探明桔梗、牛膝的配伍意義及引經(jīng)作用?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 清潔級健康成年SD大鼠90只，全雄性，體質(zhì)量（200±20） g，由浙江省實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（浙）20080033。其隨機分為空白組、模型組、全方組、全方無桔梗組、全方無牛膝組、全方無桔梗牛膝組、桔梗牛膝配伍組、桔梗組、牛膝組共9組，每組各10只。

1.2 藥物與試劑 （1）藥物。血府逐瘀湯方中各藥均購自南京中醫(yī)藥大學國醫(yī)堂門診部并經(jīng)南京中醫(yī)藥大學中藥鑒定學教研室鑒定。組成及劑量參照成人（體質(zhì)量 60 kg）的用量比例：桃仁 12 g，紅花 9 g，當歸 9 g，生地黃 9 g，川芎 4.5 g，赤芍 6 g，牛膝 9 g，桔梗 4.5 g，柴胡3 g，枳殼6 g，甘草3 g。并由國醫(yī)堂門診部提供并進行制備煎液及水浴濃縮，每日1劑。鹽酸腎上腺素注射液（天津金耀氨基酸有限公司）；氯化鈉注射液（中國廣州百特醫(yī)療用品有限公司）。（2）試劑。大鼠環(huán)磷酸腺苷（cAMP）ELISA試劑盒由上海西唐生物科技有限公司提供；大鼠環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）ELISA試劑盒由上海西唐生物科技有限公司提供。

1.3 動物模型制備 參考文獻方法［3］，采用連續(xù)多次小劑量皮下注射腎上腺素（0.1%Adr），模擬較長時間大怒及情感焦慮狀態(tài)，制備氣滯血瘀動物模型。具體操作方法：用0.9%氯化鈉注射液10 mL將0.1%鹽酸腎上腺素注射液稀釋為0.01%鹽酸腎上腺素注射液，注射劑量為0.08 mg/kg體質(zhì)量，頸背部皮下注射，每日1次，連續(xù)7 d。空白組于相同部位、相同時間注射等量0.9%氯化鈉注射液。各組動物均在最后一次注射鹽酸腎上腺素注射液后24 h處死。

1.4 給藥方法 自造模之日起，各實驗組分別灌胃中藥水煎濃縮液（1 mL/100 g），其中全方組含生藥1.27 g/mL、全方無桔梗組1.18 g/mL、全方無牛膝組1.12 g/mL、全方無桔梗牛膝組1.03 g/mL、桔梗牛膝組0.23 g/mL、牛膝配伍組 0.15 g/mL、桔梗組 0.08 g/mL，每日 1次，連續(xù)7 d。模型組、空白組分別灌胃0.9%氯化鈉注射液1 mL/100 g。

1.5 檢測指標及方法 上述各組動物處死后，立即剖取其心、肺、肝、腎組織，各組織分別取約50 mg。所取組織用生理鹽水沖洗其上之血液或內(nèi)容物，放入盛有2 mL冷醋酸緩沖液（pH值4.75、濃度50 mmol/L）的試管中，立即冰浴勻漿，懸浮液加入無水乙醇2 mL，混勻，靜置 5min，3500 r/min離心 15min，收集上清液。再用75%乙醇2 mL洗沉淀物，混勻，3500 r/min離心15min。合并上清液，60℃烘箱中烘干。ELISA法測定各臟器組織中cAMP、cGMP含量及cAMP/cGMP比值，測定方法嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS11.5統(tǒng)計軟件。計量資料以 （）表示，多組主要定量指標采用One-Way ANOAY方差分析，兩組間比較采用LSD及S-N-K分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠各臟器組織中cAMP的比較 見表1。（1）心臟組織。與空白組比較，模型組cAMP水平明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組對cAMP水平均有降低趨勢，其中以全方組、無牛膝組明顯（P＜0.05）；其他各組雖有減少，但無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與全方組比較，桔梗牛膝配伍組降低cAMP水平較弱（P＜0.05）。與牛膝組比較，全方組、全方無牛組、全方無桔梗牛膝組均有顯著差異 （P＜0.01），全方無桔梗組、桔梗組亦有顯著差異（P＜0.05）。（2）肺臟組織。與空白組比較，模型組cAMP水平降低，但無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各用藥組之間比較，雖有數(shù)據(jù)上的差異，但是影響無規(guī)律，且無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（3）肝臟組織。與空白組比較，模型組cAMP水平明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組對cAMP水平均有降低趨勢，其中以全方組、全方無桔組、全方無桔梗牛膝組作用較明顯（P＜0.01）；牛膝組作用明顯（P＜0.05）；與桔梗牛膝配伍組、桔梗組比較，全方組、全方無桔梗組有顯著差異（P＜0.01）；全方無桔梗牛膝組、牛膝組亦有顯著差異（P＜0.05）。與牛膝組比較，桔梗牛膝配伍組、桔梗組有顯著差異（P＜0.05）。（4）腎臟組織。與空白組比較，模型組cAMP水平降低，但無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各用藥組之間比較，雖有數(shù)據(jù)上的差異，但是影響無規(guī)律，且無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 對大鼠各臟器組織中cAMP的影響結果（pmol/mL，）

表1 對大鼠各臟器組織中cAMP的影響結果（pmol/mL，）

與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與全方組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與無桔組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01；與桔牛組比較，■P＜0.05，■■P＜0.01；與桔梗組比較，●P＜0.05，●●P＜0.01。與牛膝組比較，※P＜0.05，※※P＜0.01。

2.2 對大鼠各臟器組織中cGMP的影響 見表2。（1）心臟組織。與空白桔梗牛膝配伍組比較，模型組cGMP水平明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組對cGMP水平均有明顯降低趨勢（P＜0.01）。與全方組比較，桔梗牛膝配值組、桔梗組、牛膝組降低cGMP水平較弱。（2）肺臟組織。與空白組比較，模型組cGMP水平明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，全方組對cGMP水平升高趨勢最為明顯（P＜0.01）。與全方組比較，全方無桔梗牛膝組升高cGMP水平較弱（P＜0.05），其他各組升高趨勢更弱，有顯著差異（P＜0.01）。（3）肝臟組織。與空白組比較，模型組cGMP水平明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組對cGMP水平均有降低趨勢，其中桔梗組較明顯（P＜0.05）；其他各組作用均非常明顯（P＜0.01）。（4）腎臟組織。與空白組比較，模型組cGMP水平明顯降低（P＜0.01）。與無全方牛膝組比較，全方無桔梗牛膝組、牛膝組水平有明顯差異（P＜0.05）。

表2 對大鼠各臟器組織中cGMP的影響結果（pmol/mL，）

表2 對大鼠各臟器組織中cGMP的影響結果（pmol/mL，）

與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與全方組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與無牛組比較，■P＜0.05，■■P＜0.01。

2.3 對大鼠各臟器組織中cAMP/cGMP比值的影響見表3。（1）心臟組織。與模型組比較，牛膝組對cAMP/cGMP比值升高趨勢較明顯（P＜0.01）。與桔梗組比較，牛膝組對比值升高作用較弱（P＜0.05）。（2）肺臟組織。與空白組比較，模型組比值明顯升高（P＜0.05）。組間比較，全方無桔梗組與全方無桔梗牛膝組作用差異明顯（P＜0.05），其中全方無桔梗組對模型組比值影響較小，而全方無桔梗牛膝組則影響較大。（3）肝臟組織。與模型組比較，全方無牛膝組、桔梗牛膝配伍組對比值有明顯升高趨勢（P＜0.05）。（4）腎臟組織。與空白組比較，模型組比值水平明顯降低（P＜0.01）。與牛膝組比較，全方組作用有明顯差異（P＜0.05），全方無牛膝組作用有極明顯差異（P＜0.01）。

表3 對大鼠各臟器組織中cAMP/cGMP的影響結果（pmol/mL，）

與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01； 與全方組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與無桔組比較，■P＜0.05，■■P＜0.01； 與牛膝組比較，●P＜0.05，●●P＜0.01。

3 結 論

cAMP、cGMP在體內(nèi)各組織普遍存在，是細胞功能的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)；cAMP、cGMP對多種信息，尤其是藥物的刺激非常靈敏，且各組織臟器中的含量水平，基本上可反映其細胞功能的某一動態(tài)平衡狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，許多中藥均是通過調(diào)節(jié)體內(nèi)環(huán)核苷酸含量而起作用；反之，從環(huán)核苷含量變化中亦可觀察到中藥對機體的影響以及對疾病的療效［4-5］。近年來，不少學者對cAMP、cGMP隨“陰陽盛衰”而變化的現(xiàn)象作了大量研究，表明它們之間存在著類似中醫(yī)陰陽學說的相互矛盾及對立統(tǒng)一的關系［6］。

本研究表明，血瘀模型組心、肝組織中cAMP、cGMP含量明顯升高，而肺腎組織中cAMP、cGMP含量卻呈現(xiàn)降低趨勢，對cAMP/cGMP比值的影響則正好相反。從各用藥組數(shù)據(jù)分析，含桔梗的用藥組心臟組織中cAMP、cGMP水平明顯降低，而含牛膝的用藥組則降低均不明顯。對肝臟中cAMP含量的影響卻恰恰相反，即含牛膝的用藥組肝臟組織中cAMP水平明顯降低，而含桔梗的用藥組則降低不明顯。肝臟組織中cGMP的變化，除桔梗組外，其他各組作用均非常明顯，表明桔梗、牛膝確實能影響心、肝組織中cAMP和cGMP的分布水平，這與桔?！拜d藥上行”、牛膝“引藥下行”的引經(jīng)理論正相符合。對肺、腎組織中cAMP的影響雖有數(shù)據(jù)上的差異，但無統(tǒng)計學意義，提示可能與血府逐瘀湯主要用于“血府”血瘀證有關，其部位雖在胸中，但血瘀證主要與心、肝關系密切。

對肺臟組織中cGMP的影響，以全方組對cGMP水平升高影響最為明顯。與全方組比較，無桔梗牛膝組cGMP水平升高較弱，其他各組升高趨勢更弱。提示全方組效果最好，而桔梗牛膝配伍則會影響藥物在肺臟中的分布，說明牛膝“引藥下行”之功可能影響桔?！拜d藥上行”特性。對腎臟組織中cGMP的影響，則以牛膝組和無桔梗組最明顯，無牛膝組則作用最弱，提示牛膝確能增加cGMP在腎臟中的分布，通過觀察對各臟器組織中cAMP/cGMP比值的影響，也發(fā)現(xiàn)有此規(guī)律。

綜上，研究證實桔梗確有“載藥上行”之功，能增加藥物在心肺中的分布；而牛膝確有“引藥下行”之力，能增加藥物在肝腎中的分布；桔梗與牛膝單獨使用，或單獨配伍多起拮抗作用，但在全方中配伍卻起協(xié)同作用，這也正是中醫(yī)組方精妙之所在。

［1］陳菁菁，劉敏，唐德才.血府逐瘀湯及桔梗、牛膝配伍對血清NO、血漿ET-1的影響［J］.遼寧中醫(yī)藥大學學報，2011，13（11）：123-124.

［2］劉敏，唐德才，陳菁菁.血府逐瘀湯及方中桔梗、牛膝對血管內(nèi)皮細胞黏附分子表達的影響［J］.遼寧中醫(yī)藥大學學報，2012，14（1）：76-78.

［3］和嵐，蔣文躍，毛騰敏.注射腎上腺素模擬“氣滯”復制急、慢性血瘀模型初探［J］.中國中西醫(yī)藥結合雜志，2004，24（3）：244-246.

［4］王樹榮，翟繼偉，蓋英臣，等.天麻、桔梗、元胡歸經(jīng)的實驗研究［J］.上海中醫(yī)藥雜志，1995，41（1）：44-46.

［5］王樹榮，孫冰，丁國明.中藥歸經(jīng)的實驗研究［J］.中國中藥雜志，1994，19（8）：500-502.

［6］王淑美，徐曉玉.滋陰清熱藥對環(huán)核苷酸的影響［J］.藥學專論，2003，12（7）：26-27.